Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Общая характеристика растений рода солодка (Glycyrrhiza) 7
1.1.1. Использование солодки в народном хозяйстве 8
1.2. Общая характеристика культивируемых in vitro клеток и тканей растений 9
1.3. Сомаклональная вариация культивируемых клеток in vitro 17
1.4. Анализ полиморфизма генома методом полимеразной цепной реакции 25
1.5. Организация митохондриального генома растительной клетки 28
2. Материалы и методы 36
2.1. Объект исследований 36
2.2. Условия культивирования каллусной ткани 36
2.3. Условия стерилизации 36
2.4. Определение прироста сырой биомассы каллуса 38
2.5. Определение размеров клеток каллуса 38
2.6. Спектрофотометрический метод количественного определения пигментов 39
2.7. Спектрофотометрический метод определения содержания глицирризиновой кислоты 39
2.8. Спектрофотометрический метод определения суммарного содержания фенольных соединений 40
2.9. Экстрагирование фитогормонов из растительной навески 41
2.10.Определение содержания фитогормонов методом ИФА 41
2.11 .Выделение тотальной ДНК 42
2.12.Выделение митохондриальной ДНК 43
2.13. Полимеразная цепная реакция 44
2.14. Расщепление митохондриальной ДНК рестрицирующими эндонуклеазами 45
2.15. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле 46
2.16. Использованные реактивы 46
3. Результаты и обсуждение 48
3.1. Получение линий каллуснои ткани солодки голой 48
3.2. Характеристика линий каллуснои ткани солодки голой 50
3.3. Влияние света на морфофизиологические параметры каллуснои ткани солодки голой 53
3.4. Анализ скорости роста линий каллуснои ткани солодки голой в зависимости от времени года 60
3.5. Способ ускорения роста каллуснои ткани солодки голой 69
3.6. Содержание фенольных соединений и глицирризиновой кислоты в каллуснои ткани солодки голой в ходе длительного культивирования 72
3.7. Содержание фитогормонов в каллуснои ткани солодки голой 78
3.8. Анализ тотальной ДНК длительно культивированных in vitro линий каллуснои ткани солодки голой методом RAPD-ПЦР 86
3.9. Анализ митохондриальной ДНК длительно культивированных in vitro линий каллуснои ткани солодки голой методом ПДРФ 92
Заключение 104
Выводы 108
Список литературы 109
Приложения 133
- Общая характеристика культивируемых in vitro клеток и тканей растений
- Организация митохондриального генома растительной клетки
- Анализ скорости роста линий каллуснои ткани солодки голой в зависимости от времени года
- Содержание фитогормонов в каллуснои ткани солодки голой
Общая характеристика культивируемых in vitro клеток и тканей растений
Метод культивирования in vitro клеток, тканей и органов растений на питательной среде за почти столетнюю историю приобрел к настоящему времени широкое распространение. Этот подход успешно используется для получения продуктов вторичного метаболизма и ферментов. Система клеток in vitro служит моделью для изучения генной экспрессии, регуляции роста и развития растений и является удобным инструментом в селекционных и генно-инженерных работах (Калинин и др., 1980; Бутенко, 1999; Носов, 1999; Шаяхметов, 1999).
Культура растительных клеток, тканей и органов in vitro включает в себя культуру протопластов, каллусных тканей, клеточных суспензий, меристем, пыльцы, зародышей, корней, листьев, цветков, плодов и т.д.
Протопласты - это клетки, лишенные клеточной оболочки. Их получают чаще всего с помощью ферментов, разрушающих клеточную оболочку (Cocking, 1972). В настоящее время протопласты выделяют из любого органа растения, а также из культуры клеток и тканей. Протопласты используют в качестве модели для изучения синтеза целлюлозы (протопласты очень легко восстанавливают клеточную стенку), как объект генной инженерии для получения гибридов растений (путем слияния протопластов и их последующей регенерации в целое растение), для получения устойчивых к болезням форм (путем введения в протопласт части генома, определяющего устойчивость) (Bajaj, 1974; Hossain et al., 1995).
Клеточные суспензии представляют собой одиночные клетки и клеточные агрегаты, выращиваемые в аэрируемой жидкой питательной среде (Калинин и др., 1980; Шевелуха и др., 1998). Их получают путем внесения каллусов с рыхлой консистенцией в перемешиваемую жидкую среду. Также суспензии образуют внесением в среду предварительно измельченного и состоящего из живых и мертвых клеток гомогената. Реже суспензии получают при внесении кусочков ткани, которые в жидкой среде образуют каллус, распадающийся на отдельные клетки (Мардамшин, 1995). Клеточные суспензии культивируют двумя основными способами. Первый способ -периодическое (накопительное) культивирование - заключается в том, что культуру клеток вместе с питательной средой помещают в пробирки или колбы, которые устанавливают на раскачивающиеся или круговые качалки либо роллеры. При втором способе (непрерывное культивирование) клетки выращивают в ферментерах, при этом постоянно добавляется питательная среда, а часть клеточной суспензии удаляется. Клеточные суспензии используются для производства различных веществ в больших количествах. Сюда относятся ферменты, алкалоиды, полифенолы, эфирные масла и т.д. Кроме этого, суспензии применяются как модели для изучения различных физиологических, морфологических и биохимических процессов, протекающих в клетках (Калинин и др., 1980; Мусияка, 2000).
Меристемы - ткани верхушки побега. Для получения растений из меристем последние срезаются вместе с 1-2 листовыми приморднями и высаживаются в питательную среду. Метод изолированных меристем применяется главным образом для получения безвирусных растений, для ускоренного размножения растений и при изучении морфогенеза (Калинин и др., 1980; Мусияка, 2000).
Каллусом является недифференцированная ткань, возникающая при делении дедифференцированных клеток паренхимной ткани изолированных сегментов (эксплантов) различных органов растений. В регуляции образования и роста каллусной ткани определяющее место отводят фитогормонам, поэтому для стимуляции роста и развития клеток в питательную среду вносят ауксины и цитокинины. Первичным каллусом называют каллус, возникший непосредственно на экспланте в асептических условиях. Полученный первичный каллус затем отделяют и пересаживают на новую питательную среду. Это приводит к образованию стерильной культуры каллусной ткани.
Каллусную ткань можно поддерживать неограниченно длительное время. Через определенные промежутки времени (20-30 дней) культуру каллусов разделяют на фрагменты и высаживают на новую питательную среду. При пересадке удаляются участки, подверженные некрозу. В качестве питательной среды для каллусов используют среды Мурасиге и Скуга, Уайта, Гамборга и Эвелега, Эллера (Калинин и др., 1980).
Исходный кусок ткани экспланта обладает гетерогенностью, кроме этого гетерогенность также может возникнуть непосредственно при культивировании каллусов (Валиева, Мардамшин, 1995). За счет этой разнокачественности путем клеточной селекции можно получить линии с различными свойствами. Клеточными линиями называют культуры, возникшие из одного экспланта и различающиеся по одному или нескольким признакам (Бутенко, 1977). Каллусные линии могут различаться по окраске, консистенции, скорости роста, содержанию вторичных метаболитов. По консистенции каллусы делятся на рыхлые и плотные. Плотные, в отличие от рыхлых, состоят из тесно упакованных клеток (Калинин и др., 1980). У плотных каллусов количество полисахаридов клеточной стенки выше такового у рыхлых. Рыхлые каллусы, как правило, характеризуются большей скоростью роста, чем плотные; при этом выявлена зависимость между содержанием вторичных метаболитов и скоростью роста каллусных тканей: чем выше их содержание, тем ниже скорость роста (Ржержабек, Горелова, 1986). Это может быть связано с более высокой дифференцировкой клеток у каллусов с плотной консистенцией, так как вторичные метаболиты синтезируются и накапливаются в специализированных клетках (которых меньше в рыхлых каллусных тканях) (Мардамшин и др., 1995а). Как плотные, так и рыхлые каллусные ткани можно получать путем регулирования состава питательной среды. Обнаружено, что плотные каллусы могут спонтанно переходить в рыхлые, а в обратном направлении этот процесс не идет (Torrey, Shigemura, 1957).
У большинства культур (женьшеня, стевии, живучки и др.) в процессе субкультивирования или даже при первом пассаже наблюдается значительное снижение содержания вторичных соединений (Носов. 1999). Это может быть связано с увеличением плоидности клеток в процессе длительного культивирования, с потерей более продуктивных клеток из-за их слабого роста, с ослаблением генетической информации о вторичном обмене (Запрометов, 1981; Morris et al, 1989; Козыренко и др., 1997; Румянцева и др., 1998). Однако известны случаи синтеза вторичных соединений на высоком уровне и при длительном культивировании. В частности, штаммы культуры клеток диоскореи дельтовидной {Dioscorea deltoidea) синтезировали стероидные гликозиды в большом количестве в течение почти 20 лет (Бутенко и др., 1992).
Каллусы можно выращивать как на свету, так и в темноте. Действие света имеет большую роль для процессов роста и развития культивируемых in vitro клеток, в частности он может инициировать процессы эмбриогенеза и тканевой дифференцировки (George, 1993). Свет является необходимым фактором для поддержания фотосинтетической активности культивируемых клеток (Widholm, 1992). Воздействие света на синтез вторичных метаболитов может иметь неоднозначный характер. С одной стороны, на свету увеличивается накопление вторичных соединений - это происходит у фототрофных культур за счет активизации ферментов, функционирующих в хлоропластах (Загоскина, Запрометов, 1991; Уразалиев и др., 1991). Например, в каллусной культуре чайного растения {Camellia sinensis) происходило увеличение содержания фенольных соединений при удлинении освещения с 16 до 24 часов (Загоскина и др., 2000). С другой стороны, иногда на свету можно наблюдать и уменьшение содержания вторичных метаболитов. В частности, в каллусных тканях воробейника {Lithospermum erithrorhizon) при освещении прекращался синтез нафтохинонов шиконинового типа (Tabata et al., 1974).
При длительном выращивании в темноте у клеточных культур растений обычно происходят нарушения фотосинтетического аппарата, клетки переходят на гетеротрофное питание. Одни культуры, постоянно пассируемые в темноте, при воздействии света могут восстанавливать фотосинтетический аппарат, у других нарушения этого аппарата принимают необратимый характер. Например, клеточная линия SB-P сои (Glycina max) выращиваемая в темноте, при выставлении на свет переходила с гетеротрофного на фототрофное питание (Erdus et al., 1990). Суспензия клеточной линии М 31-М мандрагоры (Mandragora turcomanicd) сохраняла способность к фотоиндуцируемому синтезу хлорофиллов на протяжении 9-10 пересадочных циклов, однако чем дольше культура клеток пассировалась в темноте, тем хуже происходил синтез хлорофиллов при её освещении. При дальнейшем культивировании в темноте (начиная с 12 цикла) у этой линии мандрагоры наблюдались необратимые изменения в фотосинтезируемом аппарате (Пахлавуни, 2000).
Организация митохондриального генома растительной клетки
Митохондрии представляют собой двухмембранные органоиды размером около 1 мкм. Митохондрии очень подвижные, они постоянно меняют свою форму, сливаются друг с другом и затем разделяются (Албертс и др., 1994). Количество митохондрий в клетке у разных организмов варьирует довольно широко. Например, животные клетки содержат в среднем до тысячи митохондрий (Гаузе, 1977), а в растительных клетках их количество сильно варьирует. Так, у семейства тыквенных в одной клетке может насчитываться 110-140 митохондрий (Ward et al., 1981), тогда как в клетке апикальной меристемы корней кукурузы их число достигает тысячи (Clowes, Juniper, 1964).
Митохондрии являются обязательными компонентами клеток всех живых организмов, которые необходимы для протекания процессов дыхания. Поэтому они имеют сходное строение, обеспечивающее максимально эффективное расположение ферментов, задействованных в дыхании, с получением и запасанием энергоемких продуктов, в частности, АТФ. Наружная мембрана митохондрий имеет ровную поверхность, она проницаема для молекул небольшого размера и ионов. Между двумя мембранами находится межмембранное пространство. Внутренняя мембрана образует ряд ответвлений - крист, формирующих соединяющиеся между собой камеры. Внутренняя мембрана непроницаема для ионов, она содержит ферменты, катализирующие синтез АТФ, и ферменты дыхательной цепи. В матриксе находятся ферменты, обеспечивающие протекание цикла Кребса, окисление пирувата и жирных кислот, а также митохондриальная ДНК.
Митохондрии нельзя рассматривать как строго дискретные органеллы, так как возможно, что в отдельно взятой митохондрии содержится лишь какая-то часть митохондриального генома, поэтому предполагается, что в клетке постоянно идет процесс слияния митохондрий для обмена генетической информацией (Lonsdale et al., 1988).
Поскольку существенная часть генов митохондриальных белков закодировано в ядерной ДНК, то это со всей очевидностью говорит о вероятности процесса взаимопереноса генетического материала между органеллами и ядром.
Перенос митохондриальных генов в ядро может осуществляться по следующей схеме: вначале митохондриальные гены дублируются, одна копия перемещается в ядро и встраивается в его геном, затем копии генов в митохондриях перестают функционировать, поскольку они уже работают в ядре, и, в конечном счете, утрачиваются (Кембл и др., 1990; Brennicke et al., 1993). Такое перемещение генетической информации из митохондрий в ядро, вероятно, происходило лишь один раз у каждого организма за всю его эволюцию (лишь у сумчатого гриба Podospora это наблюдается каждый раз в течение одного жизненного цикла (Wright, Cummings, 1983)). В частности, у кукурузы с S-типом цитоплазматической мужской стерильности обнаружена линейная молекула S1 размером 6397 п.н., которая находится как в митохондриальном, так и в ядерном геноме. Последовательности S1, вероятно, были перенесены в ядро, но они ещё сохранились в митохондриях (Levings, Sederoff, 1983; Кембл и др., 1990).
Возможен и перенос генетической информации из ядра в митохондрии. Предположительно, плазмидоподобные ДНК размером 1913 п.н., находящиеся в митохондриальном геноме кукурузы, имеют ядерное происхождение, т.к. эти плазмидоподобные ДНК не имеют гомологии с высокомолекулярной ДНК митохондрий, а схожи с нуклеотидной последовательностью ядра (Kemble, Bedbrook, 1980; Abbort et al., 1985). Механизм переноса последовательностей ДНК пока до конца не ясен, хотя этот вопрос обсуждается в литературе (Лонсдейл, 1990; Юрина, Одинцова, 1998).
Митохондриальныи геном высших растений имеет ряд черт, отличающих его от такового у животных и грибов (Stern, Lonsdale, 1982; Neuton, 1988; Wolstenholme, Fauron, 1995; Юрина, Одинцова, 1998). Ниже мы перечислим главные, на наш взгляд, отличия.
Во-первых, их очень большой размер. У животных размер митохондриального генома составляет 15-18 т.п.н., у грибов - 18-108 т.п.н., а у растений - 180-2400 т.п.н (Минченко, Дударева, 1990; Marienfeld et al., 1999). Причём отмечены значительные колебания в размере генома даже среди представителей одного семейства, например, у тыквенных: у арбуза -330 т.п.н., у огурца - 1500 т.п.н., у дыни - 2200 т.п.н. (Ward et. al., 1981; Lilly etal.,2001).
Во-вторых, это - гетерогенность митохондриального генома высших растений. У млекопитающих он представлен кольцевыми молекулами ДНК одного размера. У растений митохондриальныи геном является популяцией кольцевых и линейных молекул ДНК различного размера.
В-третьих, у некоторых видов растений встречаются в митохондриальном геноме маленькие по размеру линейные и кольцевые молекулы - плазмидоподобные ДНК и эписомоподобные ДНК. Плазмидоподобные ДНК - это низкомолекулярные ДНК, которые не способны встраиваться в высокомолекулярную ДНК, а эписомоподобные -способны встраиваться (Lonsdale, 1989).
В-четвертых, в митохондриальном геноме растений встречаются последовательности, гомологичные хлоропластной ДНК.
Интересно отметить в связи с этим, что митохондриальныи геном растений, в отличие от такового животных и грибов, содержит гены, кодирующие рибосомные белки, дополнительные субъединицы комплексов дыхательной цепи, а также гены, вовлекающиеся в биогенез цитохрома С (Wolff et al., 1994; Gray et al, 1998; Marienfeld et al., 1999).
До настоящего времени обсуждается две модели структурной организации митохондриального генома высших растений, которые, однако, противоречат друг другу.
Первую модель предложил Д. Лонсдейл (Lonsdale, 1989) на основании данных физического картирования митохондриального генома сурепицы (Brassica campestris) (Palmer, Shields, 1984) и кукурузы (Zea mays) (Lonsdale et al., 1984), согласно которой, у растений есть как гомогенный, так и гетерогенный митохондриальныи геном. Гомогенный митохондриальныи геном представлен гигантской молекулой ДНК - «мастер - хромосомой» и её производными молекулами. Эта «мастер - хромосома» равна по размеру всему митохондриальному геному, на ней находятся прямые и инвертированные повторы. Прямые повторы обеспечивают межмолекулярную рекомбинацию, а инвертированные внутримолекулярную. За счет рекомбинации возникают субгеномые молекулы ДНК, которые гомологичны участкам «мастер - хромосомы». В гетерогенный митохондриальныи геном входят молекулы ДНК, которые возникли при рекомбинации субгеномных молекул и которые могут не проявлять, в отличие от гомогенного генома, гомологии к «мастер -хромосоме» (плазмидоподобные ДНК).
Вторая модель, предложенная И. Смолом (Small et al., 1987), предполагает наличие нескольких митохондриальных геномов. Есть доминирующий функционирующий митохондриальныи геном, а есть «теневой», который представлен низким числом копий ДНК и не выполняет каких-либо функций. Последовательности ДНК в геноме поддерживаются в течение продолжительного времени с помощью процесса репликации. При определенных условиях возможно изменение организации митохондриального генома и «теневой» митохондриальныи геном становится доминирующим. Это может произойти путём амплификации молекул «теневого» генома с одновременным уменьшением числа копий молекул ДНК ранее доминирующего генома.
В литературе имеются данные как в пользу первой, так и второй модели организации михондриального генома, на которых мы остановимся ниже, однако сейчас стоит остановится на обсуждении вопроса о конформации молекул митохондриальной ДНК, который также остается пока открытым (Pring, Lonsdale, 1985; Bendich, 1996; Kubo et al., 1999; Oldenburg, Bendich, 2001).
По данным физического картирования с использованием клонированных в космидах последовательностей мтДНК, митохондриальный геном растений состоит из кольцевых молекул ДНК разного размера. По данным электронной микроскопии и пульс-электрофореза, этот геном представлен гетерогенной популяцией линейных молекул ДНК. Причем иногда данные по одному и тому же объекту противоречат друг другу.
Анализ скорости роста линий каллуснои ткани солодки голой в зависимости от времени года
В основе явления сомаклональной изменчивости каллусов, терминологическое понятие которого ввели П. Ларкин и В. Скаукрофт (Larkin, Scowcroft, 1981), лежат изменения на генетическом уровне (Скаукрофт; 1990). Генетически различные формы могут по-разному реагировать на изменяющиеся условия внешней среды. Поэтому можно было предположить, что в зависимости от времени года скорость роста каллусной ткани может изменяться. С этой целью нами проведен сравнительный анализ относительного прироста биомассы разных линий в январе, апреле, июле и октябре (1999 г). Для этого каллусы взвешивали перед пассажем и на 30-й день субкультивирования. Данные анализа достоверности различий по приросту биомассы каллусов по сезонам года и между различными линиями в зимний, весенний, летний, осенний сезоны и за год приведены в приложении (табл. I- VI) Из табл. 10 и рис. 6 видно, что все исследованные линии заметно различаются между собой по приросту, в то же время этот показатель подвергается значительным изменениям в зависимости от времени года проведения анализа.
Ни одну из линий нельзя охарактеризовать как абсолютно стабильно растущую в зимний, весенний, летний и осенний периоды. Наиболее стабильным ростом обладает линия 10, у которой достоверные различия наблюдались только между каллусами, выращиваемыми в весенний и летний периоды, а также в весенний и осенний периоды (приложение, табл. I). Относительно стабильным ростом характеризуются 1, 2, 5, 8, 9 линии. Самый нестабильный рост отмечен у 4, 14, 15, 16, 17 линий, у которых различия по приросту биомассы статистически достоверны по всем временам года (табл.1).
На рис. 7 приведены данные коэффициентов вариации по приросту каллусов за год, которые демонстрируют наиболее нестабильный рост у линии 17 (у нее, например, летний прирост был в 8 раз выше осеннего), тогда как линии 5 и 10 характеризуются относительно стабильным ростом в течение всего года. Причем следует отметить, что нестабильность роста каллусных культур сильно ограничивает их практическую ценность.
Далее мы попытались сгруппировать все исследованные линии с учетом их скорости роста, стабильности роста в течение года и консистенции каллусной ткани (табл. 11).
Все исследованные нами линии каллусов заметно различаются между собой по величине прироста биомассы. Наибольший среднегодовой прирост имеет линия 2, причем независимо от времени года, наименьший, особенно зимой, — линия 18. Слабым приростом характеризуются по временам года также линия 6 (весна), линия 11 (лето) и линия 15 (осень). Причем скорость роста клеток зависит от консистенции каллусной ткани. Как следует из табл. 2 и 10, рыхлая каллусная ткань в целом обладает более высокой скоростью роста по сравнению с плотной, что полностью согласуется с общепринятым мнением (Калинин и др., 1980; Мардамшин и др., 1995а).
При анализе полученных данных трудно провести четкую корреляцию между морфологическими характеристиками линий каллусной ткани и влиянием времени года на интенсивность их роста. Вместе с тем, следует отметить, что линии, характеризующиеся относительно стабильным приростом, имеют рыхлую консистенцию, хотя это, скорее всего, и не имеет причинно-следственной связи, так как, например, линии 4 и 17, проявляющие нестабильный рост, обладают рыхлой консистенцией.
Как видно из табл. 10, для большинства линий максимальный прирост биомассы наблюдается в весенне-летний периоды, а минимальный - в осенне-зимний, то есть налицо картина, характерная для роста растений в природных условиях. Казалось бы, что в этом есть некоторая странность, поскольку каллусная ткань солодки культивировалась in vitro до момента проведения этого опыта в течение восьми лет и можно было бы ожидать, что клетки уже адаптировались к росту в искусственных условиях. Однако подобная картина наблюдалась также и у каллусной культуры линии кукурузы ДК 675, пассируемой в течение пяти лет (Пиралов, Абраимова, 2000). У этой линии кукурузы максимальный рост приходился на весенний период, а минимальный - на осенний.
В литературе встречаются данные о влиянии времени года на накопление вторичных метаболитов в длительно культивируемых тканях растений. В частности, в тканях дурмана индейского (Datura innoxia) и скополии гималайской (Scopolia stramonifolia) наибольшее накопление алкалоидов отмечено в летнее время, наименьшее - в зимнее, что характерно и для интактных растений (Дмитрук, 1971). У каллусной культуры стебля чайного растения (Camellia sinensis) как после одного, так и после девяти лет пассирования наибольшее содержание фенольных соединений приходилось также в летнее время (июль), а наименьшее - в зимнее (февраль), что совпадает и с данными по интактным растениям (Загоскина и др., 1990). В культуре ткани раувольфии змеиной (Rauwolfia serpentina), выращиваемой в течение трех лет, максимальное содержание алкалоида аймалина наблюдалось в зимне-весенний сезон, а минимальное - в летне-осенний, правда, эти данные не совсем соответствуют таковым у интактных растений, у которых повышенное содержание алкалоидов приходится на осенний период, хотя пик активности накопления алкалоидов у культуры ткани раувольфии, как полагают авторы, вполне может сдвинуться на зимний период (Панарина и др., 2000).
Пока не ясно, в чем причина выявленной нами вариабельности линий по приросту биомассы каллусов в зависимости от времени года. Не исключено, что каллусная ткань солодки имеет некую эпигенетическую систему для определения сезонности, которая досталась от исходного растения. Например, по мнению Н.В. Загоскиной и др. (1990), влияние сезонности культивирования на образование вторичных соединений особенно четко должно проявляться в культурах клеток и тканей многолетних лиственных растений, которые в зимний период находятся в состоянии покоя и резко снижают активность метаболитических процессов. Так как солодка голая является многолетним лиственным растением с периодом покоя, а скорость роста напрямую связана с процессами метаболизма, то наши данные вполне согласуются с высказанным ранее предположением (Загоскина и др., 1990).
Для выявления сходства между линиями по результатам относительного прироста каллусных клеток за год мы провели кластерный анализ (рис. 8). Как и следовало ожидать, линия 2, характеризующаяся наибольшим приростом, находится на значительном расстоянии от других линий по этому показателю. Отдельную группу составляет линия 8 с относительно большим приростом. Независимую группу от оставшихся линий формирует и линия 1. Оставшиеся пятнадцать линий можно разбить на два субкластера: в первый входят линии 5 и 10, во второй - все остальные.
Результаты кластерного анализа (рис. 8) находятся в противоречии с родословной всех 18 линий каллусов солодки голой (рис. 1), что, возможно, обусловлено приобретением ими генетической разнородности в ходе длительного культивирования.
Содержание фитогормонов в каллуснои ткани солодки голой
Фитогормоны - это эндогенные низкомолекулярные вещества, присутствующие в растениях в крайне низких концентрациях, с помощью которых осуществляется взаимодействие различных клеток, тканей и органов. Фитогормоны вызывают разнообразные физиологические эффекты, в частности, они оказывают влияние на рост клеток (деление и растяжение), на биосинтез вторичных соединений, на протекание клеточного цикла и т.д. (Муромцев и др., 1987).
В связи с тем, что исследуемые линии каллусов солодки голой сильно отличались по скорости роста, можно было ожидать, что это связано с различием состояния их гормонального статуса. Для проверки этого предположения мы провели анализ гормонального баланса во всех линиях каллусов после 10 лет субкультивирования, результаты которого представлены на рис. 11-13.
Можно видеть, что линии каллусов различаются по содержанию всех исследованных нами свободных форм фитогормонов - цитокининов, ИУК и АБК.
Так, обнаружено, что 13, 14, 15, 16 линии имели повышенный уровень цитокининов (рис. Па), причем эти линии были получены вследствие добавления в питательную среду спустя два года после получения первичного каллуса из экспланта БАП, являющегося синтетическим аналогом зеатина (рис. 1).
Однако есть линии, выращиваемые на среде, содержащей дрожжевой экстракт, также характеризующиеся довольно значительным уровнем цитокининов - это 7 и 17 линии, тогда как остальные линии содержат следовые количества данной группы фитогормонов (рис. Па). При этом важно отметить, что повышенным содержанием этих гормонов характеризуются именно плотные по консистенции каллусные ткани (за исключением 17 линии), имеющие самую низкую скорость роста (табл. 11), тогда как рыхлые ткани содержат меньше цитокининов, почти в 3 - 4 раза (рис. Па).
Поскольку известно, что в плотных каллусах число клеток на единицу объёма больше, чем в рыхлых (Калинин и др., 1980), повышенное содержание цитокининов в плотных каллусах может объясняться их необходимостью, поскольку одним из самых характерных свойств данных фитогормонов является стимуляция клеточного деления. Действительно, данные корреляционного анализа межу консистенцией каллусов и содержанием цитокининов подтверждают эту закономерность (рис. 116).
В специальных опытах, проведенных совместно с к.б.н. Р.А. Фатхутдиновой, мы провели оценку размера паренхимных клеток контрастных по содержанию цитокининов и консистенции каллусных тканей. Это линия 2 (рыхлая каллусная ткань, имеющая очень низкий уровень цитокининов) и линия 7 (плотная каллусная ткань, имеющая высокий уровень цитокининов). Результаты опытов показали, что размер клеток рыхлого каллуса (линия 2) составляет 34,9 мкм + 1,75, тогда как плотного (линия 7) - 19,0 мкм + 0,95, согласующиеся с представлениями о важной роли цитокининов в делении клеток в культуре.
Из рис. 11а видно, что линия 17 резко отличается от всех других линий с рыхлой консистенцией ткани, поскольку она имеет повышенное содержание цитокининов, вместе с тем она характеризуется очень нестабильным ростом, более того, как будет показано ниже, она занимает особое место при анализе полиморфизма митохондриальной ДНК. Хотя в целом эта линия скорее относится к слаборастущим линиям каллуса, чем даже к умереннорастущим (табл. 11). По размеру клеток каллусная ткань линии 17 занимает промежуточное положение между линиями 2 и 7 и составляет 28,4 мкм2 + 1,42.
Значительно меньшим уровнем различия характеризуются все исследованные линии каллусных клеток по содержанию ИУК, хотя следует подчеркнуть, что все рыхлые каллусы имеют относительно высокую концентрацию ИУК (рис. 12а). Наибольшее содержание ИУК отмечено у линии 2, которая отличается наибольшим приростом биомассы (табл. 10). Такой результат не явился для нас неожиданным, поскольку уже хорошо известно, что ИУК играет важную роль в регуляции роста клеток растяжением. Действительно, прирост биомассы каллусов находятся в прямой зависимости от содержания в них ИУК (рис. 126).
Все исследованные линии каллусов различаются также и по содержанию АБК. Наибольшим содержанием по этому гормону характеризуется линия 11 (рис. 13 а), которая имеет самую короткую продолжительность роста при субкультивировании (табл. 7). Из рис. 136 видно, что количественный уровень АБК и прирост биомассы каллусов находятся в обратной зависимости, что неудивительно, поскольку для АБК, как известно, характерен ингибирующий эффект на ростовые процессы клеток.
На рис. 14 показана прямая взаимосвязь между отношением ИУК/АБК в каллусах солодки и их приростом. Можно с большой долей вероятности предположить, что различия в скорости прироста биомассы в исследуемых линиях действительно зависят от содержания в них гормонов, поскольку изменение коэффициента ИУК/АБК в сторону ИУК приводит к увеличению роста. Правда в с вязи с этим следует вновь отметить линию 17, которая характеризуется высоким значением коэффициента ИУК/АБК, однако, как уже отмечалось выше, она же обладает и высоким уровнем цитокининов, поэтому, вероятно, средние показатели по приросту биомассы клеток этой линии определяются соотношением цитокининов, ИУК и АБК.
Таким образом, в основе регуляции ростовых процессов разных по консистенции линий солодки голой лежат изменения в их гормональном статусе, который стал им присущ в результате произошедших различий в ходе длительного культивирования in vitro.
В связи с тем, что изменения морфофизиологических и биохимических признаков культуры клеток in vitro связаны с генетическим аппаратом (Скаукрофт, 1990; Кокаева и др., 1997; Sadoch et al., 2000; Осипова и др., 2001), нами была проведена оценка произошедших изменений на уровне ДНК в разных линиях солодки голой, полученных их одного экспланта, культивировавшихся в течение длительного времени - после 9-10 лет
