Влияние условий культивирования на термотропное поведение липидов Pseudomonas putida и Yersinia pseudotuberculosis Попова Ольга Борисовна

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы 9

1.1. Строение мембран грамотрицательных бактерий 10

1.2 Характеристика липидов мембран грамотрицательных бактерий 10

1.2.1. Особенности липидного состава 10

1.2.1.1. Функции цвиттерионных липидов 12

1.2.1.2 Функции анионных фосфолипидов 13

1.2.2. Шаперонное действие бактериальных липидов 15

1.2.3. Особенности состава жирных кислот 16

1.3. Полиморфизм мембранообразующих липидов бактерий 19

1.4. Влияние внешних факторов на физико-химические свойства фосфолипидного матрикса мембран бактерий 23

1.4.1. Влияние температуры 25

1.4.2. Влияние тяжелых металлов 27

1.4.3. Влияние глюкозы и аэрации 29

2. Материалы и методы 31

2.1. Биологические объекты 31

2.1.1. Условия культивирования 31

2.2. Экстракция липидов 32

2.3. Микротонкослойная хроматография липидов 33

2.3.1. Системы растворителей для разделения липидов 33

2.3.2. Обнаружение липидов 33

2.4. Количественное определение липидов 34

2.4.1. Определение общих липидов 34

2.4.2. Определение фосфолипидов 34

2.4.3. Анализ состава жирных радикалов липидов 36

2.5. Калориметрический анализ липидов 36

2.6. Анализ бислойных липидных мембран 37

2.7. Атомно-адсорбционный анализ 37

2.8. ДСН-электрофорез и иммуноблоттинг 37

2.9. Количественный анализ результатов 38!

3. Результаты и обсуждение 39

3.1. Влияние ионов тяжелых металлов и температуры культивирования на термотропное поведение липидов металлрезистентных штаммов Pseudomonasputida 39

3.1.1. Сравнительная характеристика роста и липидного состава Pseudomonas putida IB28 и Pseudomonas putida IB 13 41

3.1.2. Сравнительная характеристика жирнокислотного состава Pseudomonas putida IB28 и Pseudomonas putida IB13 48

3.1.3. Фазовые переходы общих липидов мембран Pseudomonas putida;IB2& и Pseudomonas putida IB 13 51

3.1.4. Анализ сорбционной способности липидов Pseudomonas putida\KL% и Pseudomonas putida IB 13 56

3.1.5. Анализ проницаемости бислойных липидных мембран на основе липидов Pseudomonas putida IB28 57

3.2. Влияние условий культивирования на термотропное поведение липидов- Yersinia pseudotuberculosis 62

3.2.1. Влияние температуры, условий аэрации и глюкозы на липидный состав Yersinia Pseudotuberculosis 63

3.2.2. Влияние температуры, условий аэрации и глюкозы на жирнокислотныи-состав липидов Yersinia pseudotuberculosis 69і

3.2.3. Влияние температуры, условий аэрации- и глюкозы на фазовые переходы липидов Yersinia pseudotuberculosis 73

3 3.3. Влияние адаптационных изменений в содержании лизофосфатидилэтаноламина Yersinia pseudotuberculosis на конформацию OmpF-белка (порина) 82

Выводы 87

Список литературы 89

• Характеристика липидов мембран грамотрицательных бактерий
• Биологические объекты
• Влияние ионов тяжелых металлов и температуры культивирования на термотропное поведение липидов металлрезистентных штаммов Pseudomonasputida
• Влияние температуры, условий аэрации и глюкозы на липидный состав Yersinia Pseudotuberculosis

Введение к работе

Выяснение роли липидов в молекулярных механизмах адаптации бактерий к различным условиям существования является важной задачей современной физико-химической биологии, а также микробиологии и иммунологии.

Мембраны бактерий обеспечивают первичный контакт клеток с окружающей средой и являются универсальной системой передачи информации. Под действием внешних факторов в мембране может изменяться степень жидкостности липидного матрикса, возникать нарушение баланса между содержанием бислойных и небислойных липидов, и, в свою очередь, липид-белковых взаимодействий (Beney, Gervais, 2001; Epand, 2007), что приводит к запуску адаптационного механизма клетки. Именно на бактериях впервые было показано, что компенсаторные приспособления к различным условиям осуществляются за счет композиционных и внутримолекулярных перестроек мембранных липидов и направлены, на« поддержание жидкокристаллического состояния липидного матрикса, оптимального для функционирования мембран (Beney, Gervais, 2001; Cronan, 2006).

Известно, что поддержание жидкокристаллического состояния мембран является необходимым условием для активной жизни бактерий, их устойчивости к воздействию различных факторов окружающей среды. Этот феномен называется гомеовязкостной адаптацией, и впервые был изучен на липидах Escherichia coli (Sinensky, 1974). Изменения в составе мембранных липидов, особенно в жирнокислотномг составе липидного бислоя, играют главную* роль в этом процессе. В настоящее время вместо термина «гомеовязкостная адаптация» предлагается использовать более точное понятие «гомеофазная адаптация» (поддержание ламеллярной жидкокристаллической фазы липидов мембран) (Hartig et al., 2005). Несмотря на широкую известность этого феномена, работы по

7 гомеовязкостной/гомеофазной адаптации бактерий малочисленны и ограничены изучением немногих видов бактерий (Morein et al., 1996; Hartig et al., 2005; Baysse, CTGara, 2007).

Структурные и динамические характеристики липидного матрикса могут меняться под влиянием таких факторов как температура, давление, питательные вещества, рН, ионы, ксенобиотики, а также фазы роста культур бактерий (Beney, Gervais, 2001; Baysse, (TGara, 2007). Поэтому изучение влияния внешних факторов на липидный матрикс мембран, как ключевых элементов взаимосвязи между внешней средой' и внутриклеточными' ответами- микроорганизма, может прояснить вопросы резистентности, или, наоборот, уязвимости бактерий.

Функциональная, роль бактериальных липидов определяется их локализацией во внешних слоях клетки и зависимостью активности различных белков- мембраны от жидкостности липидного матрикса. Предполагается, что степень вовлечения липидов в,адаптационные процессы зависит от биологических особенностей различных видов бактерий, особенно у видов-с высокой экологической пластичностью (Hartig et al., 2005; Medeot et al., 2007). Распространенные бактерии, такие как Pseudomonas, способны модулировать экспрессию генов в ответ на широкий* круг стрессоров окружающей» среды, обеспечивая, физиолого-биохимическую адаптацию. Последние данные свидедельствуют о том, что бактериальные мембраны являются не только мишенями для внешних сигналов, но также первичными сенсорами и предшественниками вторичных мессенджеров при запуске адаптационного ответа мембран. Изменения в окружающей среде вызывают тонкие изменения мембранной жидкостности липидов-мембран;.в результате сигнал из окружающей среды трансформируется в активацию транскрипции стрессовых генов, вовлеченных в клеточный ответ, властности в изменение состава и физического состояния липидов* мембран (Vigh et al., 2007).

Большое внимание уделяется роли липидов и их.жирных кислот как таксономических маркёров, а также индикаторов, патогенности и биопродукции микроорганизмов.

Поскольку разнообразие: липидного состава; бактерий может обеспечивать различные механизмы гомеовязкостной/гомеофазной адаптации, то целью, нашей работы было изучение: изменения состава и термотропного.; поведения¹ липидов двух различных видов грамотрицательных бактерий: Yersinia pseudotuberculosis, и штаммов Pseudomonas putida IB28' и IB13_V изолированных из^? морской среды, под действием; температуры, а также: таких внешних факторов- как изменение режима, аэрации,, наличие в питательной среде глюкозы: (для Y. pseudotuberculosis) и ионов меди или кадмия -'(для''В.putida):; эффект которых: на термотропное поведение липидовїмембранпрактически не изучен:

Оба вида охарактеризуются болвшим^;іразнообразием условишобитанияі и_ь следовательно; обладают хорошими адаптационными' . возможностями, быстро: приспосабливаясь к изменениям в: окружающей" среде (Бузолева; 2000;: Regeard et аЬ, 2000; Spiers et al., 2000), поэтому представляют собой удобные модели для изучения влияния: абиогенных факторов- на, физико-химические свойства липидного матрикса бактериальных мембран.

Работа'выполнена при финансовой поддержке TiJS; GRDF и МОН РФ (гранты; RUX0-003-VL-06/BP2M03 и: ВР4М03 и РНП.2.1.1,2641); NATO-Collaboration: Linkage Grants (CLG № 978844; NR GLG 980842), РФФ№ (грант № 06-04-9605 6-р_восток_а) и проекта М0Н РФ №603 в рамках АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы на 2009/2010 гг».

9 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение мембран грамотрицательных бактерий

Клеточные стенки грамотрицательных бактерий обладают довольно
сложным строением. Одним из отличительных компонентов этих структур
является наружная мембрана, имеющая высокоасимметричное строение
липидногс" бислоя благодаря исключительной локализации

липополисахаридов, уникальных, компонентов грамотрицательных бактерий, в наружной половине бислоя, и преимущественному расположению¹ фосфолипидов во внутреннем монослое (Raetz, Dowhan, 1990; Murray et al., 2007). Белки наружной мембраны организованы, главным образом, в- й-структуру. К ним* относятся, каналообразующие белки - порины, осуществляющие транспорт малых гидрофильных, молекул (Huijbregts et al., 2000): Между наружной и плазматической- мембраной' находится периплазматическое пространство, включающее тонкий слой пептидогликана, прикрепленого пептидной связью к одному из главных компонентов, наружной мембраны - липопротеину Брауна (Nikaido, 1996). Функцией рыхлой трехмерной сети пептидогликана является предотвращение лизиса клетки в гипотонических средах, а также поддержание ее формы (Koch, 2007). Плазматическая мембрана, толщиной примерно 5-6 нм, ограничивает цитоплазму и обеспечивает транспорт веществ»между окружающей средой,и цитоплазмой. Помимо фосфолипидов, формирующих мембранный бислой, 40-60% сухого вещества плазматической мембраны представлено мембранными белками, которые обеспечивают мембранно-'ассоциированный транспорт и биохимические процессы, необходимые' для роста и деления бактериальных клеток (Raetz, Dowhan, 1990; Di Russo et al., 1999).

10 1.2. Характеристика липидов мембран грамотрицательных бактерий 1.2.1. Особенности липидного состава

Основной характеристикой бактериальных клеток является высокое содержание фосфолипидов (ФЛ) - от 70 до 90% от суммы общих липидов. Функциональная роль бактериальных липидов определяется их локализацией во внешних слоях клетки, сложностью их структуры и быстрым изменением состава во время приспособления микроорганизмов к меняющимся условиям внешней среды.

Полярные липиды, составляющие^ основу липидного матрикса клеточных мембран живых организмов, представляют собой сложные соединения, насчитывающие большое количество различных видов. Отличительные особенности классов липидов₍ основаны на различиях их полярных головных групп. Каждый класс состоит из ряда молекулярных видов, зависящих от длины жирнокислотных цепей, их позиции и количества двойных связей. Причина разнообразия, липидові и обоснованные биохимические процессы, поддерживающие гомеостаз липидного состава* морфологически различных мембран, подробно описаны в литературе (Dowhan, 1997; Wolf, Quinn, 2008).

Наружная и цитоплазматическая мембраны грамотрицательных
бактерий отличаются своим фосфолипидным составом. Так, в наружной
мембране Salmonella typhimurium основные фосфолипиды

фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилглицерол (ФГ) и

дифосфатидилглицерол (ДФГ) находятся в процентном соотношении 81:17:2. В цитоплазматической мембране соотношение данных фосфолипидов составляет 60:33:7 соответственно. Сходные данные были получены для мембран Escherichia coli К-12; Pseudomonas BAL-31 и Proteus mirabilis (Goldfine, 1984). У Е. coli состав фосфолипидов остается практически постоянным при довольно широком спектре условий роста: 70-80% приходится на долю ФЭ, 20-25% на долю ФГ и около 5% на долю ДФГ (Dowhan, 1997). Виды рода Pseudomonas тоже отличаются сравнительно

простым фосфолипидным составом: ФЭ - 69%, ФГ - 15% и ДФГ - 11%, являются главными липидами мембран. Характерной особенностью Yersinia pseudotuberculosis является сравнительно высокое содержание лизоформы ФЭ (от 7 до 35% в зависимости от способа культивирования и фазы роста) (Бахолдина и др., 2001) наряду с доминирующими фосфолипидами: ФЭ (26%), ФГ (23%) и ДФГ (14%).

Фосфатидилхолин (ФХ) - основной мембранообразующий липид эукариот, также найден во внешней и внутренней мембранах Pseudomonas aeruginosa и нескольких видов других грамотрицательных бактерий, и составляет около 4 % (Baysse et al., 2005). Предполагается, что* более 10 % микроорганизмов содержат ФХ (Baysse, 2007). Этот фосфолипид характерен для- тех бактерий, которые являются симбионтами или патогенами' эукариотических организмов (Lopez-Lara, Geiger, 2001). В обзоре С. Вилкинсона (Wilkinson, 1988) приводятся данные о том,, что грамотрицательные бактерии с высоким уровнем ненасыщенных жирных кислот (более 75%) и развитой системой внутриклеточных мембран содержат ФХ, образующийся при метилировании ФЭ S-аденозилметионином (Arondel et al., 1993), а также монометилфосфатидилэтаноламин (ММФЭ) или диметилфосфатидилэтаноламин (ДМФЭ), обеспечивающие вязкость липидного матрикса мембран. В частности, заметные количества ММФЭ и ДМФЭ были обнаружены в Yersinia pseudotuberculosis (Бахолдина и др., 2001).

В работе японских авторов (Inoue et al., 1997) показано, что у Е. coli поддержание липидного баланса мембран важно для различных мембранных функций и сохраняется на постоянном уровне. Большинство бактерий поддерживают баланс несущих заряда мембранных липидов, смещенный в сторону цвиттерионных липидов (ФЭ и ФХ), тогда как на долю анионных липидов ФГ, ДФГ, фосфатидилинозитола (ФИ) и фосфатидной кислоты (ФК) приходится менее 30%.

12 1'.2.Г.Г.-Функции цвиттерионных липидов<

Цвиттерионные липиды ФЭ и ФХ составляют основную часть мембранных фосфолипидов грамположительных и грамотрицательных бактерий. Полярные головные группы ФХ и ФЭ обладают дипольным-моментом' и могут .ориентироваться мембранным электрохимическим потенциалом (Seelig, 1993).

Неламеллярные липиды, к которым относится доминирующий фосфолипид грамотрицательных бактерий ФЭ, а также его лизоформа лизофосфатидилэтаноламин (ЛФЭ), во» многом определяют физические свойства^ мембран и влияют на активность мембранных белков. По сравнению * с. ламеллярными липидами (ФХ), молекулы которых имеют цилиндрическую форму, они оказывают более высокое латеральное давление на мембранные белки благодаря- конической форме своих молекул. Вследствие этого неламеллярные липиды могут выполнять важную структурную функцию, удерживая-белки в*мембране (de Kruijff, 1997а). Так, активность протеинкиназы С выше. в. окружении- неламеллярных липидов,» формирующих кубическую фазу (Keller et al., 1996).

Распределение и функции ФЭ в плазматической мембране грамотрицательных бактерий в основном были изучены на бактериях Е. coli (Weber, Marahiel, 2002). Фосфатидилэтаноламин обладает уникальной, способностью претерпевать переходы бислой-небислой (Thurmond et al., 1991). Доказано, что ФЭ участвует в поддержании* активного транспорта лактопермеазы Е. coli в реконструированных протеолипосомах (Seto-Young et al., 1985) и тем самым выступает в роли липошаперона. Протеолипосомы, созданые на основе ФГ и ДФГ, но несодержащие ФЭ, обеспечивали только облегченный транспорт пермеазы. В свою очередь, ФХ не мог заменить ФЭ в обеспечении активного транспорта, а диметил- и монометил-ФЭ оказались менее эффективны, чем нативный- ФЭ. В' работе бельгийских ученых по влиянию липидного окружения на активность, мультитранспортного белка LmrP было показано, что данный белок активируется только в присутствии

13' : ' -ФЭблагодаря взаимодействию^ головной группой липида (Hakizimana et аГ.,

2008).

В; бактериальных клетках в небольших количествах могут встречаться свободные: лизофосфолипиды, которые . чащег всего представлены ЛФЭ; уровень которого достигает 2-5% от суммы: фосфолипидов. В> то: же время-некоторые виды бактерий- могут значительно: увеличивать содержание ЛФЭ -(до* 50% от общего количества фосфолипидов): в ответ, на действие таких, факторов^ каю низкая рН среды или- высокая-- температура (Bukholm et al'., 1997; Kern etal., 2001).

Лизоформы фосфолипидов) являются» интермедиатами фосфолипидного . метаболизма; функционируют как молекулытдетергенты, обеспечивающие более разупорядоченное - состояние липидногої матрикса мембран: (bange, Slayton; 1982);: а, также проявляют себя* как, биологически*, активные соединения* исполняя- роль= мультифункциональных факторов* клеточного-роста вэукарибтических.: клетках (Eukushima* et: al:,, 2001)/ Вї организме: млекопитающих им: принадлежат, важные регуляторные- функции; включая: участие в- воспалительных: процессах: и иммунитете; репродукции, функционировании нервной; системы:(Birgbauer, Chun; 2006): В клетках Е; соН лизофосфолипиды выступают в ролш липошаперонов., препятствуя тепловой ^агрегации белков (Kern et al:, 200 Г).

1.2.1.2. Функции анионных фосфолипидов

Основные" анионные: липиды OF и- ДФР присутствуют во¹ всех бактериальных мембранах. В. частности, эти липиды являются необходимыми: для мембранной организации, и активации белков: цитоплазмы грамотрицательных бактерий: Так, выключение гена; ответственного: за. синтез, ФР в клетках Е. соН, вызывало их гибель (Неасоск,. Dowhan;. 1987): Предполагается; что Ф1 и ДФЕ, обладающие: разными электрическими зарядами и синтезируемые^: из одного предшественника, необходимы для быстрых структурных изменений мембран бактерий в

14 зависимости от меняющихся условий внешней среды. В одной из работ было показано, что именно условия роста влияют на содержание анионных фосфолипидов в бактериальных мембранах (Heacock, Dowhan, 1989). Уровень ДФГ может несколько повышаться при достижении клетками стационарной фазы роста (Hiraoka et a 1., 1993). Анионный фосфолипид ФГ необходим клеткам бактерий не только как мембранный липид и предшественник синтеза ДФГ, а также аминокислотных эфиров ФГ, известно участие этого липида в регуляции синтеза липопротеинов (Heacock, Dowhan, 1987); ФГ и ДФГ необходимы для инициации репликации ДНК Е. coli (Crooke et al., 1992). В одной из работ по температурной адаптации цианобактерий было сделано предположение о роли ФГ с насыщенными жирнокислотными остатками в регуляции синтеза десатураз (Vigh et al., 1993).

ФИ - кислый безазотистый фосфолипид, типичный для растений и животных (Paulick, Bertozzi, 2008), редко встречается в мембранах бактерий. Присутствие в мембранах ФИ, как правило, свидетельствует о необычных свойствах данного микроорганизма (Roberts, 2006). Так, бактерии, проявляющие способность к образованию внутриклеточных кристаллов льда в суперохлажденной воде, характеризовались небольшим содержанием ФИ -0,1-1% от общих липидов (Kozloff et al., 1991). В одной из работ по изучению липидного состава Bradyrhizobium japonicum USDA ПО (Tang, Hollingsworth, 1998) были получены данные о синтезе ФИ в условиях низкой концентрации кислорода в питательной среде. ФИ может заменять основные анионные фосфолипиды Е. coli, обеспечивающие афинность DnaA белка к АТФ in vitro (Garner, Crooke, 1996).

В настоящее время известно, что головные группы анионных фосфолипидов ассоциированы со многими цитоплазматическими белками. Такое взаимодействие приводит к значительным конформационным изменениям белков (Carman et al., 1995). Еще не ясно, формируются ли домены анионных фосфолипидов в мембранах изначально, или их

15 образование вызвано действием положительно заряженных доменов периферических мембранных белков, но такое объединение отрицательно заряженных липидов обеспечивает более выгодные, по сравнению с цвиттерионными липидами, сайты связывания бактериальных мембран. Благодаря наличию заряженных групп анионные фосфолипиды проявляют свойства хелаторов, неспецифически связывая ионы двухвалентных металлов (Barton, 1968).

Известно, что анионные липиды могут играть решающую роль в перемещении белков в мембранах. Так, уровень перемещения предшественников белков,через мембрану одного из штаммов Е. coli in vivo был пропорционален уровню биосинтеза анионных фосфолипидов (Kusters et al., 1991). Инвертированные мембранные везикулы, в которых отсутствовал ФГ, были не способны поддерживать перемещение белков. Мембраны с низким содержанием анионных фосфолипидов' и неспособные к перемещению» белков могли реактивироваться инкорпорированием анионных фосфолипидов. Единственным условием такого замещения служил заряд головных групп, а специфичность и структура полярных голов роли не играли (Hendrick, Wickner, 1991; Kusters et al., 1991).

1.2.2. Шаперонное действие бактериальных липидов

Последние десятилетия уделяется все больше внимания активной роли липидов в определении структурных, топологических и функциональных свойств белков мембран (Dowhan et al., 2004; Zhang et al., 2005).

В работах по изучению топологии лактопермеазы (LacY) Е. coli впервые было показано, что у мутантного штамма Е. coli, в мембранах которого отсутствовал ФЭ, не функционировал восходящий транспорт лактозы, опосредуемый LacY, в то время как функционирование нисходящего транспорта оставалось неизменным (Bogdanov, Dowhan, 1995; Wang et al¹., 2004). При дальнейшем изучении топологии лактопермеазы in vivo в мембранах, содержащих и не содержащих ФЭ, были отмечены существенные

'.' / _# 16 .'.''.-

различия в- ориентации и расположении трансмембранных доменов EacY, зависящие именно от липидного состава мембран бактерии (Bbgdanov et al., 2002). Так, в отсутствие ФЭ происходила трансверсия VI трансмембранного . домена лактопермеазы,. но при добавлении ФЭ- топология нарушенного домена возвращалась в нормальное положение. В реконструированых протеолипосомах. наблюдалась та же^; зависимость. Интересно отметить, что независимо от того; синтезировался ли; данный, фермент в неизмененных, клетках^ или мутировавших (не способных к синтезу ФЭ), его ориентация¹ и функциональные особенности зависели только от присутствиячФЭл ФХ тоже был способен обеспечивать природную: конформацию» и трансмембранную^ топологию; лактопермеазы, но В; данном случае фермент не поддерживал. транспорт лактозьг в клетку (Wang etal;, 2002): Ферменты, обеспечивающие; транспорт фенилаланина и у-аминобутировой кислоты также нуждаются; в ФЭ*для* поддержания гоптимал ьного функционирования; и топологии¹; (Zhang et.al-i, 2003; 2005);

Керш с сотрудниками, (Kern et al;, 2001) в- работе по! шаперонному действию' лизофосфолипидов" показал, что лизофосфатидилэтаноламин, подобно: молекулярным и химическим шаперонам,. повышает рефолдинп белков: после денатурации мочевиной и эффективен в ренатурации и солюбилизации цитратсинтазы. Наряду с ЛФЭ;, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилинозитол и, в меньшей степени; лизофосфатиднаяі кислота: способны, защищать цитратсинтазу от тепловой денатурации; Было: сделано* предположение, что лизофосфолипиды оказывают антиагрегирующиш эффект на мембранные белки при тепловом шоке, и, возможно; других стрессах, приводящих к денатурации белков.

1.23; Особенности жирнокислотного состава*мембран бактерий

В: действительности, индивидуальные фосфолипиды биомембран являются смесями молекулярных видов і с одинаковой головнож группой и различными углеводородными радикалами. Функциональная роль такой

17 гетерогенности на сегодняшний день не ясна, возможно, это необходимо для создания оптимального липидного окружения для мембранных белков (Геннис, 1997) и регуляции их биохимических свойств. Многообразие молекулярных видов структурообразующих липидов мембран может зависеть и от других выполняемых ими функций. Фосфолипиды мембран чрезвычайно лабильны, их состав в бактериальных клетках меняется под влиянием самых различных факторов? и в различные фазы роста микроорганизмов (Correa et al., 1999; Beney, Gervais, 2001; Medeot, 2007). При этом наиболее чувствительной частью фосфолипидов являются- их жирнокислотные остатки.

Жирные' кислоты, мембран бактерий являются наиболее изученными, липидными компонентами. Значительные различия жирнокислотного состава у бактерий разных порядков и видов свидетельствуют о важном биологическом значении этих соединений для микроорганизмов (Fang et¹ al., 2000; Harvey et al., 2006).

Жирные кислоты присутствуют в бактериальной клетке обычно в связанной форме, тогда как в свободном состоянии находитсятолько 1-10%. Бактериальные жирные кислоты содержат, преимущественно, от 12 до 26 атомов углерода. Ранее считалось, что у бактерий, за некоторым исключением, отсутствуют полиненасыщенные жирные кислоты. Но последние данные по изучению Антарктических бактериальных сообществ показали довольно большое разнообразие видов у-протеобактерий, характеризующихся синтезом полиненасыщенных жирных KHorioT(Nichols, McMeekin, 2002; Harvey et al., 2006). Большинство из них психрофилы (нуждаются в низких температурах роста) и галофилы (нуждаются- в повышенных концентрациях солей). Насыщенные жирные кислоты с прямой цепью и числом углеродных атомов менее 10 и более 20 присутствуют в клетках бактерий в очень малых количествах. Грамотрицательные бактерии характеризуются высоким уровнем нормальных насыщенных кислот с четным числом углеродных атомов, ненасыщенных жирных кислот с

18 двойными связями в z/z/c-положении, а также с циклопропановым кольцом и нечетным числом атомов углерода в цепи (Grogan, Cronan, 1997; Hartig et al., 2005).

Высокая насыщенность жирных кислот фосфолипидов приводит к образованию плотно упакованных жидкокристаллических микродоменов внутри мембраны, а домены с высокой концентрацией фосфолипидов с ненасыщенными жирными кислотами находятся в более разупорядоченном состоянии (Simons, Toomre, 2000).

Циклопропановые разветвленные жирные кислоты встречаются в составе липидов, бактерий в. основном в sn-2 положении глицерина-(McGarrity, Armstrong, 1981), подобно антемзо-разветвленным и моноеновым жирным кислотам. В грамотрицательных бактериях 17:0_ср кислота синтезируется из C16:l_Cis реакцией частично обратимого протонирования, катализируемой CF-4-синтазами в поздней экспоненциальной» или .ранней стационарной фазах роста (Grogan, Cronan, 1997). При этом 99% циклопропановых жирных кислот, синтезированных in vivo, находятся в цис-конформации. Синтез циклопропановых жирных кислот может увеличиваться под дейстивем таких факторов как низкая рН среды, повышение температуры культивирования, низкий уровень аэрации бактерий (Grogan, Cronan, 1997). Было показано (Dufourc et al., 1983), что циклопропановые группы жирных кислот фосфолипидов ориентированы параллельно плоскости бислоя подобно г/ис-двойной связи мононенасыщенных жирных кислот (McGarrity, Armstrong, 1981). Поэтому температура фазового перехода (Т_с) ФХ, ацилированного циклопропановыми лактобацилловой или дегидростеркуловой кислотыми, существенно ниже (на 51 С) по сравнению с дистеароил-ФХ, но на 30С выше по сравнению с ненасыщенным ФХ, ацилированным z/wc-вакценовой или олеиновой кислотами. Таким образом, замена циклопропанового кольца на двойную связь приводит к понижению вязкости фосфолипидов мембран. В свободном

19 виде циклопропановые жирные кислоты также более тугоплавки, чем моноеновые.

От уровня содержания циклопропановых жирных кислот зависит устойчивость бактерий к действию органических растворителей (Zhao et al., 2003; Grandvalet et al., 2008), к процессу замораживания-оттаивания (Mufios-Rojas et al., 2006) и к окислительному стрессу (Grogan, Cronan, 1997).

Жирные кислоты бактериальных клеток играют основную роль в приспособлении к меняющимся и экстремальным условиям внешней среды, так как первыми вовлекаются в ответные реакции и могут служить маркерами тех или иных стрессовых факторов. Регуляция» степени ненасыщенности жирных кислот является универсальным защитным механизмом различных организмов.при изменении температуры или других факторов окружающей среды. Кроме того, степень,ненасыщенности жирных кислот бактерий меняется при- смене' фаз роста микроорганизма (Arneborg et al., 1993; Mannisto, Puhakka, 2001). Регуляция жидкостности мембран также может осуществляться- благодаря^ изомеризации г/г/с-двойной , связи ненасыщенных жирных кислот (Loffeld, Keweloh, 1996): Данный механизм используется клетками^ в условиях подавления биосинтеза липидов, когда модификация степени ненасыщенности невозможна (Diefenbach et al, 1992). Подробнее эти механизмы рассматриваются в разделе 1.4.

1.3. Полиморфизм мембранообразующих липидов бактерий

В' зависимости от физиологических особенностей клетки бактерии способны регулировать функциональное состояние мембран с помощью изменений в липидном составе, что может приводить к формированию различных липидных фаз. Фосфолипиды, как амфифильные молекулы, могут формировать множество различных фаз, и, в зависимости от тех или иных условий, могут наблюдаться взаимные преобразования- этих фаз - фазовые переходы. Многообразие липидных суперструктур экспериментально

'' ²⁰

подтверждается сложными фазовыми диаграммами: полярных липидов, (Антонов, 2006).

При изменении температуры фосфолипиды претерпевают два основных фазовых перехода: кристалл (гель) —* жидкий кристалл, а также^: жидкий кристалл —> изотропное состояние: Первый фазовый переход .характеризует; термоадаптацию к пониженным температурам, второй - к повышенным температурам.. Кристаллическое (гелевое) состояние липидов обеспечивается плотной: упаковкой углеводородной части жирнокислотных остатков-, находящихся в Р-конфигурации. С повышением температуры происходит, фазовый переход вменее упорядоченную-а-конфигурацию .характерную для-жидкокристаллического состояния; В-результате фазового перехода.кристалл (гель)* —> жидкий кристалл толщина мембраны и: ее: удельная: плотность-.уменьшаются; а проницаемость увеличивается. Ири дальнейшем:повышении? температуры, упорядоченное динамическоежидкокристаллическое состояние: фосфолипидов переходит в разупорядоченное; изотропное состояние.! Кроме: основного фазового перехода кристалл (гель) —> жидкий, кристалл в мембране могут наблюдаться* мезофазные превращения* в пределах жидкокристаллического состояния. Различают следующие мезофазы:: ламеллярная* (L); кубическая (Q) и гексагональная- (Н).

Ламеллярная жидкокристаллическая фаза (Е_а) характерна для всех биологических мембран. Вї этой фазе липидные молекулы быстро перемещаются и вращаются в пределах бислоя. Под. влиянием внешних факторов, таких как температура, давление, гидратация, присутствие-ионов, . динамические характеристики бислоя меняются. Так, понижение: температуры или повышение: давления' приводит к снижению подвижности, молекулярных зондов- экспериментально' инкорпорированных В; мембраны,, что⁸ интерпретируется^ как:снижение: жидкостности мембраны. (MacDonald et. aL, 1988) и при определенной температуре, соответствующей: температуре: фазового перехода (Т_тах); мембрана претерпевает переход в гелевую фазу (Lp). Во время фазового перехода или при фазовом разделении липидов,

21 барьерные свойства липидного бислоя меняются, что приводит к увеличению проницаемости фосфолипидных везикул для гидрофильных растворов (Komatsu, Okada, 1995). Меру жидкостности мембраны обычно определяют с помощью поляризации флуоресцентных зондов, которая понижается- с повышением жидкостности мембраны. Когда измеряется анизотропия липидного бислоя, сформированного из одного липида, наблюдается четкий переход из одного состояния в другое при определенной температуре, интерпретируемый как фазовый переход. Однако мембраны клеток вместо четких фазовых переходов показывают непрерывное изменение их жидкостности с изменением температуры (Welti, Glazer, 1994).

Другой тип перехода (мезофазный) из L_a фазы наблюдается в простых липидных моделях под действием высыхания, повышения температуры, в присутствии ионов, и представляет собой переход из ламеллярного состояния в неламеллярное (Shalaev, Steponkus, 1999): Несмотря на то, что существование неламеллярных фаз в нативных мембранах все еще остается-под вопросом, многие авторы описывают их потенциальное биологическое значение (Lindblom, Rilfors, 1989; De Kruijff, 1997b; Luzzati, 1997). Известно, что неламеллярные фазы дестабилизируют липидный бислой вследствие искривления плоскости слоя (Lewis, McElhaney, 2000; Wolf et al., 2001), и непосредственно влияют на физические свойства ламеллярной фазы (Epand, 1998). Смещение равновесия в сторону образования небислойной фазы может воздействовать на активность ферментов (Lietal., 1995) и скорость информационных процессов (Escriba et al., 1997; Martini, Disalvo, 2003). Некоторые исследователи предполагают, что липидный состав мембран Е. coli регулируется с условием формирования именно неламеллярной гексагональной фазы (Ни) в липидном матриксе (Rietveld et al., 1993). Эта тенденция особенно необходима для активации ферментов (Li et al., 1995; Epand, 1998). Предполагается, что небислойные липидные структуры-способствуют большей стабильности мембранных белков (Williams, 2002). Например, это показано в экспериментах по реконструкции

22 бактериородопсина в биконтинуальную кубическую фазу липидов (Noll'ert et al., 2001; Rowinski, 2003).

Динамические и структурные характеристики мембран могут меняться как под влиянием меняющихся условий внешней среды, так и при изменении молекулярного состава мембран или добавлении экзогенных молекул, взаимодействующих с мембранными компонентами. Такие изменения на уровне жидкостности мембран (например, переход жидкокристаллической ламеллярной фазы в гелевую ламеллярную фазу) влияют на функционирование мембранных белков, меняя их липидное окружение. Также, эти изменения могут участвовать в клеточном* ответе на стрессовые ситуации, например, в активации сигнальных путей, опосредованных липид-белковыми взаимодействиями.. Известно, что некоторые белки, например; транспортные, способны функционировать только в жидкой ламеллярной фазе липидного окружения (Russel, 1990). Изменения.физических параметров* липидов мембран могут влиять и на барьерную^ функцию, мембраны,.так как фазовое разделение липидов приводит к нарушению гидрофобного барьера;

Фазовое разделение липидов и образование- микродоменов, существование которых подтверждается сложным характером фазовых переходов, возникает благодаря' гетерогенности состава липидного матрикса биологических мембран. В настоящее время установлено, что формирование доменных структур мембран характерно не только для мембран млекопитающих, но и биологических мембран в целом (Epand, Epand, 2009).

Имеющиеся данные свидетельствуют о разнообразных функциях липидных микродоменов в клеточных процессах, включая трансцитоз и эндоцитоз, проникновение токсинов, бактерий и вирусов через мембраны, гомеостаз кальция, сортировку белков и трансдукцию сигналов (Zajchowski, Robbins, 2002; Milejkovskaya, Dowhan, 2005; Matsumoto et al., 2006). В частности, домены кислых фосфолипидов могут выполнять функцию инициатора хромосомной репликации в клетках Е. coli (Aranovich et al., 2007).

23 Предполагается, что кластеризация липидов может быть причиной кластеризации ионных каналов и рецепторных белков, что в свою очередь повышает сигнальные способности клетки. Поэтому оптимальные-сигнальные способности клетки, вероятно, определяются размерами кластеров и расстояниями между ними (Shuai, Jung, 2003).

1.4. Влияние внешних факторов на физико-химические, свойства фосфолипидного матрикса мембран бактерий

Условия среды оказывают заметное влияние на морфологию, химический состав и биологические свойства бактерий. Мембраны бактерий являются первичной мишенью для стрессовых факторов. В ответ на физико-химические изменения; происходящие в клетке под действием¹ внешних факторов, микроорганизмы,включают защитные механизмы, в том числе и на молекулярном уровне (Denich etal., 2003).

Физиологическое и биохимическое поведение бактериальных клеток часто зависит от температуры, роста и обеспечивается посредством терморегулируемых доменов. Такая регуляция наблюдалась при синтезе липаз и протеаз Pseudomonas fluorescens MFO (Guillou, Guespin-Michel, 1996). А у психротрофной бактерии Aeromonas hydrophila при низкой, средней и оптимальной температуре роста регистрировался синтез различных наборов белков (Imbert, Gancel, 2004). Обширные литературные данные свидетельствуют, что при акклиматизации пойкилотермных организмов к низкой температуре, как правило, идут значительные внутриклеточные перестройки, включая увеличение размера клеток (Atkinson, Sibly, 1997; Mufios-Rojas et al., 2006), повышение активности ферментов и изменение состава мембран (Klein et al., 1999; Los, Murata, 2004; Medeot et al., 2007).

Адаптационные изменения на уровне мембранных липидов и жирных кислот известны как «гомеовязкостная адаптация» (Sinensky, 1974), позволяющая клетке контролировать жидкостность мембранного матрикса путем изменения липидного состава мембран. На сегодняшний день ученые

24 предлагают использовать понятие гомеофазной адаптации, подчеркивая важность поддержания' именно ламеллярной жидкокристаллической фазы (Hartig et al., 2005). Многие эксперименты показали, что выживаемость, бактериальных клеток в меняющихся условиях окружающей среды зависит от поддержания физических характеристик мембран. Работы, показывающие зависимость между жидкостностью липидного матрикса бактериальных мембран и устойчивостью клеток к стрессам, побудили некоторых авторов использовать величину жидко стности мембран для прогнозирования устойчивости клетки к стрессу (Swan, Watson, 1999; Laroche et al., 2001).

Имеющиеся в литературе данные, полученные при исследовании бактерий, показали, что основная роль в гомеофазной- адаптации отводится углеводородной^ части липидов биологических мембран, изменение структуры которых влияет на фазовое состояние липидов (Morein et al., 1996; Garabet al., 2000). Механизмы гомеофазной адаптации можно разделить на две группы: (1) процессы пост-синтетической модификации (наиболее быстрый^ способ регулирования* жидкостности), включающие в себя работу десатураз (Los, Murata, 2004), изомеризацию двойной связи жирных кислот из цис в транс конфигурацию (Heipieper, de Bont, 1994; Halverson, Firestone, 2000; Hartig et al., 2005), образование циклопропановых жирных кислот (Mufios-Rojas et al., 2006). Эти изменения представляют первую линию защиты бактериальных клеток в условиях стресса; (2) изменение степени ненасыщенности, длины цепи и разветвления жирных кислот в синтезе de novo (Loffeld, Keweloh, 1996; Loffhagen et al., 2004). К адаптационным механизмам относят и изменения структуры головных групп фосфолипидов (Melchior, 1982; Medeot et al., 2007). Правда, такие изменения довольно редки и менее эффективны в изменении мембранной жидкостности. В связи с этим особое значение приобретают физические и химические характеристики фосфолипидов с различным строением как полярной, так и неполярной, (углеводородной) частей.

25 1.4.1. Влияние температуры

Температура является одним из важнейших факторов, регулирующих целый ряд биохимических характеристик микроорганизмов, в том числе их липидный состав (Beney, Gervais, 2001). Изменения температуры роста бактерий отражаются на уровне жидкостности мембранных липидов, напрямую зависящей от степени насыщенности ацильных цепей (Los, Murata, 1998; Mansilla et al'., 2004).

При повышенных температурах наблюдается увеличение содержания длинноцепочечных и насыщенных жирных кислот мембранных липидов бактерий. С понижением температуры роста в мембранных липидах, наоборот, повышается содержание короткоцепочечных, разветвленных и ненасыщенных ацильных цепей (Keweloh et al., 1991; Suutari, Laakso, 1994). Причем у ненасыщенных жирных кислот наблюдается увеличение длины цепи. Так, синтез пальмитолеиновой кислоты 16:1 заменяется синтезом цис-вакценовой кислоты 18:l_cisn (Russel, 1984).

При холодовом стрессе благодаря синтезу десатураз de novo наблюдается увеличение числа двойных связей ацильных цепей. Данный механизм поддержания жидкокристаллического состояния липидного матрикса препятствует фазовому переходу мембранообразующих липидов в гелевую фазу, при которой микроорганизмы-погибают (Hazel, 1995). Удачной моделью для изучения влияния температуры на жидкостность мембран являются цианобактерии Synechocystis sp. Обширные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что повышение ригидности мембран при пониженной температуре стимулирует усиление экспрессии трех из четырех известных генов десатураз цианобактерии (desA, desB и desD). Высокий уровень транскрипта desC поддерживается независимо от температуры, что свидетельствует о коститутивной^ экспрессии этого гена и важной роли образования первой двойной связи в жирных кислотах при изменении физических свойств мембранных липидов (Лось, 2001; Vigh et al., 1993;.Los et al., 1997, Los, Murata, 1998; Los, Murata, 2004).

Японские авторы показали, что при выключении двух генов десатураз desA и desD клетки Synechocystis sp. утрачивали способность адаптироваться к низким температурам (Tasaka et al., 1996). При инкорпорировании гена desA в мутантные клетки другой цианобактерии Synechococcus sp., характеризующиеся наличием только одной А9 десатуразы, в липидах появлялись жирные кислоты с двумя двойными связями (Wada et al., 1990), что приводило к увеличению жидкостности мембран и повышению адаптивной способности бактерий при низких температурах.

Хендерсон с сотрудниками (Henderson et al., 1993) установили, что при понижении температуры роста бактерии Vibrio sp. с 20С до 5 С в общелипидном составе возрастала доля неламеллярного ФЭ, сопровождающаяся увеличением индекса ненасыщенности.

Сравнительное исследование синтеза липидов Y. pseudotuberculosis в зависимости от температурных условий культивирования на различных средах показало, что температура является основным индуцирующим фактором, влияющим на синтез липидов и жирных кислот (Дзадзиева и др., 1999). При культивировании иерсиний псевдотуберкулеза на минеральных и органических средах в условиях низкой температуры липидный состав не менялся, но при температуре 6С преобладал синтез ненасыщенных жирных кислот, тогда как при 37С образовывались в основном насыщенные жирные кислоты.

При действии высоких температур или органических растворителей в мембранах бактерий также отмечается цис-транс изомеризация ненасыщенных жирных кислот (Loffeld, Keweloh, 1996). Такое изменение жирнокислотного состава способствует понижению жидкостности мембран и их стабилизации. В работе немецких авторов (Hartig et al., 2005) приводятся данные, подтверждающие, что цис-транс изомеризация является экстренным механизмом, возникающим в ответ на резкое изменение условий, когда клетки не имеют возможности адаптироваться к новым условиям путем синтеза жирных кислот de novo. А сама реакция цис-транс изомеризации

27 конкурирует с z/zfc-циклопропановой конверсией ненасыщенных ацильных цепей.

На клетках Е. coli показано, что повышение температуры приводит к активации CpxA-CpxR системы, представленной белками-ферментами, отвечающими за фолдинг и деградацию периплазматических белков, где СрхА является гистидинкиназой, a CpxR — регулятор ответа генов, индуцируемых теплом (Di Giuseppe, Silhavy, 2003). Причем активность гистидинкиназы СрхА, состоящей из двух трансмембранных доменов, напрямую зависит от состава и физического состояния липидного окружения (Mileykovskaya, Dowhan, 1997). Важно отметить, что данная стресс-индуцибельная регуляторная система характерна только для Е. coli, Salmonella typhimurhtm и Yersinia pestis и не была найдена в других видах бактерий (De Wulf et al., 2000).

1.4.2. Влияние тяжелых металлов

К тяжелым металлам относят металлы с плотностью более 5 г/см , согласно Весту (Weast, 1989), к ним относят 53 элемента. Так как d-орбитали тяжелых металлов заполнены не полностью, их катионы способны к комплексообразованию. Ионы некоторых металлов в минимальных концентрациях (0,01- 10 цМ) необходимы для нормального функционирования клеток бактерий. Так, недавно было показано, что замещение цинка редким для биологических систем кадмием в активном центре некоторых ферментов приводит к увеличению их активности (Mirams et al., 2008). В океане, где цинк почти отсутствует, кадмий может использоваться организмами для катализа (Xu et al., 2008). Но в более высоких концентрациях в свободной ионной форме металлы оказывают токсическое действие. Токсичность тяжелых металлов проявляется в виде окислительного стресса, нарушения фолдинга белков (Hureau et al., 2008), что в результате приводит к нарушению их функций (Nies, 1999). При повышенных концентрациях ионов тяжелых металлов у металлорезистентных бактерий происходит увеличение

проницаемости цитоплазматической мембраны (Theuvenet et al., 1987), что обычно сопровождается утечкой внутриклеточного калия и уменьшением электропроводности цитоплазмы (Иванов и др., 1999; ABmann et al., 1996). Следствием этих процессов является лизис бактериальных клеток.

Бактерии могут аккумулировать катионы тяжелых металлов с помощью двух процессов: сорбции металлов на клеточной поверхности благодаря физико-химическим свойствам клеточных стенок, или энергозависимого транспорта металлов через цитоплазму (Gadd, 1992). Энергозависимый перенос катионов металлов протекает медленнее и реализуется только при определенных условиях, в которых бактериальные клетки способны поддерживать функциональную активность. Более эффективная пассивная сорбция, металлов реализуется в более широком, спектре условий, внешней среды как в живых, так и мертвых клетках, и идет по хемиосмотическому градиенту (Pardoet al., 2003).

Грамотрицательные бактерии- обладают меньшей сорбционной* способностью, чем грамположительные, так как отличаются тонким» пептидогликановым слоем и отсутствием тейхоевых и тейхуроевых кислот (Remade; 1990). Но грамотрицательные бактерии в, целом более устойчивы, чем грамположительные, к антибактериальным агентам и ксенобиотикам. Относительная резистентность грамотрицательных бактерий к ксенобиотикам часто объясняется наличием липополисахаридного слоя внешней мембраны, как дополнительного барьера. Благодаря* низкой текучести липополисахаридных оболочек, скорость трансмембранной диффузии липофильных агентов в периплазматическое пространство значительно снижается (Сазыкин и др., 1999).

Клетки грамотрицательных бактерий обладают целым рядом механизмов устойчивости к повреждающему действию тяжелых металлов (Cervantes, Gutierez-Corona, 1994; Nies, 1999). В большинстве случаев устойчивость бактерий к действию тяжелых металлов детерминируется плазмидами (Cooksey, 1994). Наряду с хромосомными и плазмидными системами защиты

29 от высоких концентраций металлов могут существовать и другие механизмы резистентности, такие как хелатирование ионов металлов мембранными компонентами, синтез внутриклеточных металлотионеинов.

Так, в штамме P. putida, устойчивом к кадмию, был найден белок, аналогичный кадмий-связывающему металлотионеину, способствующий внутриклеточной аккумуляции этого металла (Higham et al., 1984). Некоторые бактерии рода Pseudomonas проявляют резистентность к действию меди, так как у них обнаружен сор оперон, отвечающий за синтез белков, связывающих катионы меди: сорА, сорВ, сорС и copD. Белки сорА и сорС являются периплазматическими и могут связывать 11 и 1 атом меди соответсвенно. СорВ представляет собой белок наружной мембраны, который может участвовать в межмембранном транспорте меди (Cha, Cooksey, 1991). Металлоустойчивые штаммы Pseudomonas, выращенные на средах с высоким содержанием меди отличаются голубой окраской клеток^-благодаря аккумуляции катионов во внешней мембране и периплазматическом пространстве (Cooksey, 1993).

Несмотря на то, что повреждающее действие тяжелых металлов связывают с повышением проницаемости мембран бактерий, тем не менее, до сих пор роль фосфолипидов бактериальных мембран в этом процессе остается непонятной.

1.4.3. Влияние глюкозы и аэрации

Исследования липидного состава Y. pseudotuberculosis показали, что присутствие в культуральной среде глюкозы вызывает значительные изменения в составе полярных липидов иерсинии. Влияние глюкозы на процесс синтеза липидов бактерий псевдотуберкулеза зависит от температуры. На холоду глюкоза стимулирует синтез ФЭ, тогда как при 37С наблюдается ингибирование этого процесса. Однако зависимость влияния глюкозы на синтез нейтральных липидов и ЛФЭ от температуры имеет противоположный характер (Бахолдина и др., 2001; Красикова и др., 2001).

Бактерии псевдотуберкулеза, культивированные на разных средах при низкой температуре, содержали, примерно, равные количества общих липидов. Но среда культивирования заметно влияла на содержание фосфолипидов. Максимальное количество фосфолипидов (4,6%) синтезировалось в клетках, культивируемых на глюкозосодержащем питательном бульоне. На среде, не содержащей глюкозы, наблюдалось подавление синтеза фосфолипидов, которое компенсировалось увеличением доли НЛ, становившихся преобладающими в этих условиях. Совершенно другой характер изменений липидного состава, вызванных присутствием глюкозы в питательном бульоне, наблюдался при 37С. Присутствие глюкозы в культуральной среде «тепловых» вариантов бактерий ингибировало синтез фосфолипидов. Таким образом, присутствие глюкозы в питательной среде оказывает существенное влияние на состав фосфолипидов Y. pseudotuberculosis, характер которого зависит от температуры.

В работе норвежских микробиологов (J0stensen, Landfald, 1996) отмечалось, что в условиях культивирования на среде, содержащей глюкозу, клетки Vibrio sp. содержали больше нормальных ацильных цепей с четным числом атомов, а количество разветвленных жирнокислотных остатков резко снижалось.

Однако в литературе отсутствуют данные об интегральном эффекте обнаруженных изменений в липидном составе бактерий на физическое состояние мембран.

2. Материалы и методы

2.1. Биологические объекты

Штаммы Pseudomonas putida IB 13 (EF581813, GenBank) и Pseudomonas putida IB28 (EF581812, GenBank), использованные для данной работы, были любезно предоставлены доцентом Отделения общей экологии, к.б.н. Безвербной И.П. Данные штаммы были изолированы из морской воды бухты Золотой Рог (зал. Петра Великого, Японское море) и охарактеризованы как штаммы, проявляющие множественную высокую резистентность к различным тяжелым металлам (Си, Cd, Zn, Со). Идентификацию и анализ морфологических и физиолого-биохимических свойств штаммов проводили на основе стандартных тестов API-20NE (bioMerieux, Франция), а также использовали метод сидеротипирования (Meyer, 2000).

Штамм KS 3058 Yersinia pseudotuberculosis (серовар 0:1b) (Шовадаева и др., 1991), был изучен в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии СО РАМН и любезно предоставлен научным сотрудником Лаборатории химии неинфекционного иммунитета СИ. Бахолдиной. Штамм микроорганизма был типичен по своим морфологическим, культуральным, биохимическим, антигенным свойствам и не содержал плазмид.

2.1.1. Условия культивирования

Культивирование штаммов Pseudomonas putida IB 13 и Pseudomonas putida IB28 проводили при 4С и 24С на среде, адаптированной для морских бактерий. Состав среды (г/л): СаС0₃ - 1,0; MgS0₄ - 1,0; пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0; глюкоза - 1.0, К₂НР0₄ - 0,2; агар - 15,0; Н₂0 морская - 500 мл, Н₂0 дистиллированная - 500 мл, рН - 7,8-8,1 (КОН). Металлосодержащие среды готовили на основе указанной среды с добавлением хлоридов меди или кадмия в концентрациях 300 и 80 мг/л соответственно. Использованные концентрации солей были выбраны на

32
основе предварительных экспериментов по определению минимальных
ингибирующих концентраций (MIC), подавляющих рост

металлочувствительных бактерий, изолируемых из прибрежных морских вод (Безвербная и др., 2003). Указанные концентрации при оптимальной температуре не вызывали видимых физиологических изменений. Биомассу бактерий в конце экспоненциальной фазы роста смывали 0,85% раствором NaCl, осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 5000 об/мин, промывали дважды 0,85% раствором NaCl (рН 5,5), содержащим 50 дМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA).

Бактерии Yersinia pseudotuberculosis культивировали на питательном бульоне (ПБ, Махачкала, Россия) и питательном бульоне с добавлением 0,5% глюкозы (ПБ+Glc) в аэробных и анаэробных условиях в колбах объемом 1 л на качалке (180 об/мин), либо в таких же колбах в аэробных условиях без перемешивания. Анаэробные условия создавали путем продувания аргона через вакуумированные колбы объемом 1 л со 150 мл стерилизованной среды. Стерилизацию вводимого аргона осуществляли с использованием насадки с ультрафильтром с размером пор 0,2 мкм. По достижении стационарной фазы роста через одни сутки при 37 С («тепловые» варианты) и через 6 суток при 8 С («холодовые» варианты) бактерии убивали 1%-ным раствором фенола в течение 20 мин и отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин, полученный осадок клеток дважды промывали 0,85% раствором NaCl (рН 5,5).

2.2. Экстракция липидов

Общие липидные экстракты из отмытой бактериальной массы были получены по методу Фольча (Folch et al., 1957). Сырую бактериальную массу заливали смесью растворителей хлороформ-метанол (2:1 об/об) и оставляли в склянке из темного стекла на 2 ч на магнитной мешалке. Затем полученную суспензию бактериальных клеток центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Супернатант (липидный экстракт) сливали, а осадок бактериальных

зз . клеток вновь заливали системой и дважды повторяли предыдущие этапы! экстракции.. Экстракты, растворенные в хлороформе, стабилизировали 0,05% 2,6-дигтрет-бутил-л-крезолом и хранили в морозильной камере в^; плотное закрытой посуде темного стекла.,

2.3. Микротонкослойная хроматография липидов

Суспензии 2-х часовой фракции силикагеля, приготовленной; по методу В.И.^: Светашева и В.Е. Васьковского (Svetashev, Vaskovsky, 1972); смешивали с 10% гипса и наносили по Л,5 мл на стеклянные пластинки размером 6x6 см. Пластинки.высушивали; на- воздухе и перед применением активировали, 1 ч-при 110С в сушильном^шкафу.

2.3.1: Системы> растворителей для разделения липидов

Для разделения фосфолипидов, бактерий с помощью двумерношМТСХ; на силикагеле в первом направлении применяли: систему хлороформг метанол - бензол - 28% аммиак (65:30:10:6 об/об) (все соотношения указаны в_; объемах растворителей). Во втором, направлении; использовали систему хлороформ - метанол - бензол - уксусная* кислота - ацетон - вода (70:30:10:5:4:1 об/об) (Vaskovsky, Terekhova, 1979). Для разделения нейтральных' липидов от фосфолипидов с помощью одномерной МТСХ использовали систему гексан-диэтиловый эфир^муравьиная кислота (80:20:2 об/об). Для анализа фосфолипидов методом одномерной ТЄХ использовали водную систему: хлороформ — метанол - вода (65:25:4 об/об).

2.3;2. Обнаружение липидов

Для обнаружения; липидов использовали неспецифические и. специфические реагенты. В качестве неспецифического реагента использовали; 10%-ный раствор H2SO4 в. метаноле с последующим нагреванием пластинки на электроплитке при температуре 250-300С до появления темных пятен на белом фоне.

34' . ..-.

Из специфических реагентов применяли: а) молибдатный реактив, б) 0,2%-ный- раствор нингидрина в ацетоне, в) реактив Драгендорфа_; Молибдатный реактив, приготовленный-по методу В.Е. Васьковского и Э.Я. Костецкого (Vaskovsky et al:, 1975)^ использовали для обнаружения фосфолипидов:. Через 1.-2' мин после опрыскивания хроматограммы этим реактивом фосфолипиды обнаруживаются в виде синих пятен на белом фоне: 0^2%7ный; раствор нингидрина в: ацетоне использовали для обнаружения аминосодержащих соединений: После опрыскивания раствором нингидрина пластинку помещали в пары кипящей, воды на: 1-2 мин; Липиды, содержащие свободную, аминогруппу,, окрашивались в розовый цвет. Для обнаружения холинсодержащих и< других соединений^ с четвертичными аммониевыми группировками использовали; реактив Драгендорфа (Wagner et¹, al., 1969): После опрыскивания хроматограммі этим реактивом? холинсодержащие соединения окрашивались в оранжевый цвет.

2.4І Количественное определение липидов

2.4.1. Определение общих липидов

Количество общих липидов в экстракте определяли весовым методом, доводя аликвоту высушенного под вакуумом липидного экстракта до постоянного веса.

2.4.2. Определение фосфолипидов

Для количественного определения отдельных классов фосфолипидов в общелипидных экстрактах использовали, универсальный молибдатный реагент (Vaskovsky et al;, 1975), для которого готовили рабочие реагенты 1 и

2. '

1. К 4 мл: исходного реактива, добавляли 48 мл 1, Н серной кислоты и доводили объем до 100 мл дистиллированной водой.

2. К 5,5 мл исходного реактива добавляли 26 мл 1 Н серной кислоты и доводили объем дистиллированной водой до 100 мл. Реактив устойчив при хранении в склянке из темного стекла при комнатной температуре одну неделю.

После разделения смеси фосфолипидов отдельные классы выявляли 10%-ной серной кислотой в метаноле при сжигании на электроплитке при 180-200С. Зоны, содержащие фосфолипиды, перемещали в пробирки из жаростойкого стекла, заливали 0,05 мл 72%-ной (или 0,07 мл 57%-ной) хлорной кислоты. Для контрольных проб отбирали силикагель в зонах пластинки, не содержащих липидов. Пробу помещали в алюминиевый блок для сжигания при 180-200С и выдерживали в течение 15-20 мин.

После охлаждения в пробирки добавляли 0,45 мл рабочего реагента 2 (исходная разность объемов хлорной кислоты разной концентрации уравнивается при сжигании за счет испарения воды). Смесь в пробирке тщательно перемешивали с помощью вортекса, пробирки помещали в кипящую водяную баню на 15 мин, после образования фосфомолибденовой сини- пробирки охлаждали, силикагель осаждали центрифугированием (10 мин при 3000 об/мин) и фотометрировали при 815 нм. В случае изменения количества хлорной кислоты, необходимой для сжигания пробы, пропорционально изменяется и количество рабочего реагента (на 0,07; 0,14; 0,21 мл 57% хлорной кислоты добавляют 0,45; 0,90; 1,35 мл рабочего реагента соответственно). Контрольная проба для каждого измерения берется отдельно. Поглощение контрольной пробы не должно превышать 0,04-0,05 единиц оптической плотности. В качестве стандарта для построения калибровочной кривой использовали раствор однозамещенного фосфата калия и ФХ, выделенного из яичного желтка. Для расчета процентного содержания фосфолипидов использовали пересчетный фактор 25.

36-2.4;3: Анализ состава жирных радикалов липидов

Анализ- ацильных цепей липидов производили с; помощью ГЖХ. Жирные кислоты конвертировали- в метиловые эфиры (МЭЖК) с помощью транс-метилирования липидов-5% НС1 в метаноле (Garreau, Dubacq, 1978) с последующей очисткой с помощью^; ТСХ. Анализ метиловых эфиров; жирных кислот¹ проводили на хроматографе Schimadzu GG-9A с: пламенно-ионизационным детектором* а также на хроматографах; Agilent- GG6898 с пламенно-ионизационным детектором и Agilent MS5973MI с масс-селективным детектором. Капиллярная колонка 25 м х 0,2: мм, неподвижная -фаза; Garbowax 20М< газ-носитель, - гелий (Не),, температура - 200С. Процентное, содержание- каждой¹ кислоты рассчитывали по методу Кэррола

(Garroli 19610.

Идентификацию- МЭЖК проводили" путем: сравнения; относительного времени/ удержания- с таковыми аутентичных- стандартов; и^ значениями; EGE (Kramer etal., 1985; Ghristie, 1988).

2.5. Калориметрический анализ липидов

Необходимое количество липидов, растворенных в- хлороформе,
переносили в стандартные алюминиевые контейнеры и высушивали под
вакуумом до постоянного веса 6-8. мг. Затем;к образцам добавляли равное по
весу количество смеси вода-этиленгликоль (1:1, об/об). Температурную
зависимость теплопоглощения липидов исследовали с помощью
дифференциального сканирующего калориметра ДСМ-2М (GKB БП* РАЩ
Пущино). Полученные гидратированные образцы герметично запаковывали в
специальные микроконтейнеры и помещали в измерительную; ячейку
дифференциального сканирующего калориметра. Образцы

нагревали/охлаждали; в температурном интервале от -40С до 60G при чувствительности 40 мВт со скоростью Г6?С/мин;. G помощью этого метода определяли температурный интервал перехода и температуру фазового

37 перехода T_max по температуре максимума теплопоглощения. Температурную область измерений калибровали по нафталину, ртути и индию.

2.6. Анализ бислойных липидных мембран

Бислойные липидные мембраны (БЛМ) получали по методу Мюллера (Mueller et al., 1962). Водная фаза - 0,1 М NaCl в трис-HCl, рН 8,0. Регистрацию тока проводили с помощью хлор-серебряных электродов в режиме фиксации потенциала на мембране. Мембранный потенциал измеряли в диапазоне 20-250 мВ. Мембраны формировали из 1% раствора 1-олеилглицерина (ГМО) в гептане или из смеси липидов (по 50% ГМО и липидной фракции).

2.7. Атомно-адсорбционный анализ

Количественный анализ содержания тяжелых металлов в липидах бактерий проводили, как описано ранее (Julshamn, Andersen, 1979), с использованием атомно-адсорбционного спектрофотометра Schimadzu 660IF (Япония).

2.8. ДСН-электрофорез и иммуноблоттинг

Конформационные изменения белков изучали методом электрофореза в 10% или 12% нативном (не содержащем додецил сульфат натрия) полиакриламидном геле (Bio-RAD Laboratories) по стандартной методике Лэммли (Laemmli, 1970). Идентификация белков, разделенных гель-электрофорезом, была выполнена методом иммуноблоттинга (Bogdanov et al., 2009). Визуализацию проводили с помощью Fluor-S Max Multilmager (Bio-Rad). Для обработки изображений использовали программное обеспечение Quantity One версий 4.6.5.094 и 4.4.1 (Bio-Rad).

38 2. 9. Количественный анализ результатов

Полученные количественные данные представлены как общие средние величины из совокупности значений (п = не менее 3). В значениях до 10% стандартное отклонение не превышает 0,5%, а в значениях свыше 10% - не превышает 0,8%.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние ионов тяжелых металлов и температуры культивирования на термотропное поведение липидов металлорезистентных штаммов Pseudomonas putida

Проблема биоремедиации и биоутилизации поллютантов становится все более актуальной в связи с постоянно возрастающим загрязнением окружающей среды. Последнее время микроорганизмы все чаще рассматриваются как возможные биоремедиаторы токсических соединений (Mandal, 2006) и биоиндикаторы загрязнения морских акваторий. Известно, что металлорезистентные бактерии являются эффективным и экономичным биоматериалом для. извлечения' тяжелых металлов из загрязненных вод. Но» для их широкого использования в биоремедиации необходимо четкое понимание механизмов сорбции ионов, бактериальными клетками, а также молекулярных механизмов их адаптации к высоким концентрациям» токсичных металлов.

Бактерии выработали различные механизмы резистентности к повреждающему действию тяжелых металлов, в числе которых сорбция катионов металлов и их аккумуляция внутри клеток (Chen et al., 2007). Сорбцию тяжелых металлов микроорганизмами связывают с взаимодействием их ионов с функциональными' группами белков, липидов и углеводов, составляющих клеточные мембраны бактерий (Crist et al., 1981; Greene et al., 1986). При повышенных концентрациях ионов тяжелых металлов происходит изменение проницаемости цитоплазматической мембраны у металлрезистентных бактерий (Theuvenetet a 1., 1987), хотя причина остается неясной. Ранее было показано, что внутренние и внешние мембраны Pseudomonas putida 5-х. способны адсорбировать тяжелые металлы из окружающей среды. Было сделано предположение, что довольно высокое содержание фосфолипидов в наружной мембране может являться основной причиной ее высокой сорбционной способности (Wang et al., 2006). Известно

40 также, что резистентность к тяжелым металлам зависит от температуры, окружающей среды (Cervantes, Gutierez-Corona, 1994).

Устойчивость бактерий к неблагоприятным условиям среды в большой степени определяется их способностьюj к быстрому изменению физико-химических свойств мембран, с которыми связаны многие жизненно важные процессы в клетке. Эти компенсаторные приспособления осуществляются за счет композиционных и внутримолекулярных перестроек мембранных липидов и направлены на поддержание жидкокристаллического состояния липидного матрикса, оптимального для функционирования мембран (Hazel, Williams, 1990; Nagamachi et al., 1991). Поэтому изучение эффектов катионов тяжелых металлов на липидный матрикс мембран, являющихся ключевым элементом взаимосвязи между внешней средой и внутриклеточными ответами микроорганизма, может прояснить многие вопросы резистентности, или, наоборот, уязвимости бактерий.

Жидкокристаллический липидный матрикс цитоплазматических мембран бактерий выполняет функции стресс-детектора, поскольку очень чувствителен к различным факторам окружающей среды (Beney, Gervais, 2001). Наиболее изучено влияние температуры на физико-химическое состояние липидного матрикса бактериальных мембран, тогда как сведения о действии других абиотических факторов ограничено. В связи с этим было проведено комплексное исследование состава- и термотропного поведения общих липидов, выделенных из двух штаммов морской бактерии P. putida IB28 и IB 13, характеризующихся высокой устойчивостью к различным тяжелым металлам, для выяснения физико-химических свойств липидов, позволяющих бактериям выживать в условиях предельных концентраций Си и Gd при разных температурах окружающей среды.

41 3.1.1. Сравнительная характеристика* роста и липидного состава штаммов P. putida IB28 и IB13

Как видно из таблиц 1 и 2, низкая температура и ионы тяжелых металлов заметно влияют на рост P. putida IB28 и IB 13. Понижение температуры с 24С до 4С вызывало снижение бактериальной массы Р. putida IB28 и IB 13 в 1,4 и 2 раза соответсвенно, что совпадает с полученными ранее данными о низкой физиологической активности разных видов Pseudomonas при пониженных температурах (Pinkart, White, 1997; Николаев и др., 2000).

Добавление в культуральную среду (КС) ионов СіГ*" и С(Г усиливало эффект понижения температуры: биомасса снижалась в 2,5 и 5,5 раза для Р. putida IB28. В P. putida IB 13 подобный эффект наблюдался^для ионов Си -биомасса снижалась в 2,8 раза, тогда¹ как добавление Cd²⁺ не оказывало > дополнительного влияния; Таким образом, снижение температуры и включение тяжелых металлов в культуральную среду, в основном, аддитивно ингибируют рост штаммов P. putida.

При постоянных температурах Cd" , как правило, более эффективно снижал биомассу бактерий по сравнению с Си" , что согласуется с литературными данными о различии токсического действия Си и Cd (Nies, 1999). Однако снижение биомассы, вызванное понижением температуры, было одинаковым (в 2,3 раза), независимо от того, какой металл присутствует в среде роста P. putida IB28 в отличие от штамма P. putida IB 13, где ингибирование роста при снижении температуры наблюдалось только в присутствии Си²⁺, но не Cd²⁺.

Отмеченные изменения биомассы. бактерий сопровождались следующими перестройками, в липидном составе. Одновременно с ростом бактерий P. putida IB28 при повышении температуры возрастало процентное содержание общих липидов (в 1,1 раза), что отмечалось ранее и в других бактериях (Medeot et al., 2007). Эффект усиливался при комплексном действии с Си и особенно с Cd (в 1,5 и 1,8 раза соответственно).

Общие липиды

Фосфолипиды

(ФЛ>

Нейтральные:

липиды(НЛ)

ФЛ/НГО

Таблица 1 Эффект температуры культивирования и ионов тяжелых металлов; (Си"⁺ и Cd^B составе культуральной среды (KG) на биомассу и содержание, липидов Pseudomonas putida IB28

Стандартное'отклонение.составляло,менее 0;8% для трех повторностеш

Таблица! Эффект температуры; культивирования' и? ионов? тяжелых металлов, (Си и Cd²⁺) в составе: культуральной среды; (КС) на биомассу т содержание:

липидов Pseudomonas putida IB Г З

. 4С 24С '

Показатель^ _KC+Gu2+_KG+C(f_+KG КС+Cu²⁺ KC+Cd^z"

^Б^мг^гу^{а 497}' ^З53' 490,0 994,0 794,0 404^0
Содержание липидов (% от сухого бактериального веса)

Общие липиды

Фосфолипиды

(ФЛ)

Нейтральные

липиды (НЛ)

ФЛ/НЛ Стандартное отклонение составляло менее 0,8% для трех повторностей

"7-1-

Большее стимулирующее влияние Cd на синтез: общих липидов .Р. putida IB28 также наблюдалось в рядах KCr

43 общих липидов штамма IB 13 повышалось под действием тяжелых металлов аналогично штамму IB28, эффект изменения температуры как в присутствии, так и в отсутствии тяжелых металлов был противоположным по сравнению со штаммом IB28 (Табл. 2). Тем не менее, увеличение массы общих липидов штамма IB 13 при комбинированном действии повышенной температуры и тяжелых металлов свидетельствует о доминирующем эффекте¹ тяжелых металлов.

Содержание фосфолипидов обоих штаммов психротрофной P. putida подобно психрофильной Yersinia pseudotuberculosis, а также другим ранее изученным/бактериям (Medeot et al., 2007) повышалось (в 1,3-1,4 раза) при-понижении температуры. Тяжелые металлы также стимулировали синтез

фосфолипидов при постоянной температуре, за. исключением. КС+Cu при 4С (IB28) и KC+Cd²⁺ при-24С (IB 13). Причем, под влиянием ионов тяжелых металлов уровень фосфолипидов* P. putida IB28 заметнее повышался- при * 24С. Повышение уровня> фосфолипидов Pi putida IB13 под действием тяжелых металлов было, наоборот, более выраженным при пониженной температуре. Вероятно, увеличение содержания фосфолипидов можно-рассматривать как один из общих механизмов резистентности бактерий' к Си²⁺ и Cd²⁺, зависимость которого от температуры реализуется по-разному у исследованных штаммов P. putida.

В соотношении фосфолипиды/нейтральные липиды (ФЛ/НЛ) отмечалась более сложная зависимость. Так, соотношение фосфолипиды/нейтральные липиды для P. putida IB28 снижалось более чем в> 3 раза при повышении температуры культивирования. При низкой температуре добавление Cd не влияло на соотношение фосфолипиды/нейтральные липиды, а ионы меди вызывали существенное снижение, соотношения фосфолипиды/нейтральные липиды с 3,7 до 1,1. Наоборот, при 24С соотношение фосфолипиды/нейтральные липиды увеличивалось при добавлении обоих ионов, но особенно резкое, десятикратное повышение отношения фосфолипиды/нейтральные липиды вызывали ионы меди. Увеличение доли

.''. .. -44.. '';...''...;"

фосфолипидов, вероятно^ способствует формированию клеточных мембран: и
противостоянию токсичному . действию ионов меди при 24С,; что
выражалось в сравнительно небольшом снижении биомассы P. putida IB28
при данных, условиях культивирования, по сравнению с чистой КЄ. И;
наоборот, уменьшение: соотношения фосфолипиды/нейтральные липиды
более чем- в 3 раза: под влиянием: С1г⁺ при низкой температуре
сопровождалось двукратным; снижением: биомассы бактерий: Для ионов;
кадмия: подобная зависимость между соотношением'

фосфолипиды/нейтральные липиды: и биомассой. бактерий^ не
прослеживалась.- ' '

Для;P.putida IB13 соотношение, фосфолипиды/нейтральные липиды как при 4Є, так: и прш,24Є свидетельствовало* о- том, что клетки- данного штамма;.как'гіравило, не:способны^адекватно реагировать на;повреждающее действие' тяжелых; металлов*: повышением; синтеза фосфолипидов относительно! синтеза нейтральных липидов. Особенно заметно .ингибйрующее действие: кадмия; при, 24С,. когда уровень, фосфолипидов- и* соотношения: фосфолипиды/нейтральные липиды. был самым низким, что отразилось и на биомассе бактерий: Интересно также отметить, что в отличие от штамма^ ІВ28 наблюдалось трехкратное снижение, а не повышение соотношения фосфолипиды/нейтральные липиды при понижении температуры, культивирования: В результате биомасса; P. putida 1В13^: снижалась "резче по сравнению со штаммом IB28: (в 2 и 1,4 раза, соответственно): Хотя в обоих штаммах комбинированное действие-повышенной/пониженной температуры и ионов тяжелых металлов было аналогичным: при; повышении/понижении температуры добавление ионов меди, в культуральную среду приводило к увеличению/понижению соотношения; фосфолипиды/нейтральные липиды, а кадмия - наоборот, к: уменьшению/повышению соответственно:.

Изучение¹ состава» мембранных, фосфолипидов особенно важно» для^: понимания молекулярных механизмов адаптации к действию тяжелых

45 металлов, так как фосфолипиды, благодаря отрицательно заряженным группам, способны участвовать в сорбции металлов на уровне мембран (Wang et al., 2006), а также могут выполнять функции мессенджеров, передающих информацию внутрь клетки об изменениях окружающей среды (Vigh et al., 2007). Важно отметить, что информация по липидному, и особенно фосфолипидному составу различных видов Pseudomonas очень противоречива и ограничена (Николаев и др., 2000; Pinkart, White, 1997). Фосфолипидный состав бактерий может различаться даже в пределах одного вида, что свидетельствует о гетерогенности группы псевдомонад.

Нами были идентифицированы четыре фосфолипида мембран штаммов P. putida IB28 и P. putida IB13: ФЭ, ФГ, ДФГ, ФИ (Табл. 3, Табл. 4). Важно* отметить, что ФИ в бактериях рода Pseudomonas ранее не идентифицировался, за исключением P. syringae, содержащей небольшие количества этого- фосфолипида (Kozloff et al., 199 Г). Обнаружение-значительных количеств ФИ (от 9,0 до 19,5% от общих фосфолипидов) в Р. putida ІВ28-И IB 13 может быть связано с особыми условиями существовать этих морских штаммов (Tang, Hollingsworth, 1998; Roberts, 2006).

Изменение содержания цвиттерионного ФЭ и анионных фосфолипидов (ФГ, ДФГ и ФИ) под влиянием температуры и металлов было реципрокным. Уровень ФЭ в «Холодовых» образцах P. putida IB28 и P. putida IB 13, как видно из Таблиц 3 и 4, был самым высоким и составил 67,3% и 80% от суммы фосфолипидов^ соответственно, но добавление ионов тяжелых металлов и, особенно, повышение температуры культивирования, как правило, снижали его. Противоположным образом действовало только добавление ионов меди и кадмия при 24С на содержание ФЭ P. putida IB 13.

Суммарный уровень кислых фосфолипидов (ФГ, ДФГ и ФИ), наоборот, был заметно ниже при 4С, чем при 24С (особенно в штамме IB 13 - более чем в 2 раза), тогда как добавление в среду металлов вызывало¹ его увеличение. Но и в этом случае, исключением был штамм IB 13, сумма

46 кислых липидов которого снижалась при добавлении ионов тяжелых металлов при 24С.

Таблица 3

Эффект температуры культивирования и ионов тяжелых металлов (GiT и
Cd²⁺) в составе культуральной среды- (КС) на фосфолипидный состав
Pseudomonas putida IB28 (% от суммы ФЛ)

Стандартное отклонение составляло менее 0,8%.для трех повторностей

Таблица 4 Эффект температуры культивирования и ионов тяжелых металлов (Си и Cd²⁺) в составе культуральной среды (КС) на фосфолипидный состав*

Pseudomonas putida IB 13 (% от суммы ФЛ)

4С 24С

ФОСФОЛИПИДЫ -_{КС КС+Сц}2+ _KC+Cd2_{+ кс кс+Сц}2_{+ кс +Q}^

55,2 52,3

23,1 25,6

3,9 13,4

17,8 8,7

27,0 39,0

44,8 47,7

1,2 1,1

Стандартное отклонение составляло менее 0,8% для трех повторностей

Содержание ФИ, известного предшественника вторичных мессенджеров (Kanaho, Suzuki, 2002), немного увеличивалось в обоих штаммах под действием тяжелых металлов при низкой температуре. При более высокой температуре (24С) эта тенденция усиливалась, и в штамме IB28 отчетливее проявлялось большее стимулирующее действие Cd"⁺ по сравнению с Си" . То

'.".''.' 47 есть,, на более токсичный металл бактериальные клетки отвечали усилением синтеза ФИ- и, вероятно^ соответствующей активацией фосфоинозитидной сигнальной системы. Повышение температуры . культивирования' незначительно снижало содержание. ФИі в штамме ІВ28; Аналогичный; эффект наблюдался в присутствии Си"⁺, но при:наличии Cd"⁺ в. окружающей; среде содержание ФИ заметно* повышалось '(в:.. 1,6 раза). Более резкое . увеличение содержания ФИ в присутствии Cd" наблюдалось> в штамме IB 13^: (более;. чем в 6 раз), причем; даже: больший стимулирующий эффект повышенной⁵ температуры на* синтез ФИ отмечался в отсутствии ионов.и; особенно, при* наличии ЄиГ в культуральной среде (в 10,5 и. 13-,7 раза;. соответственно):

Вероятно, разнонаправленные адаптационные изменения; bs содержании^ ФЭ и кислых липидов-связаны;с их различнойфолью'в,мембране (Vanounou* et: al;, 2003;. Domenech et al:, 2007):. НеламеллярнышФЭ) дестабилизирует липидныш бислой (Wolf et al;, 2001;, Lewis; McElhaney,: 2000)* и; следовательно,- может компенсировать конденсирующее действие низкой? температуры.

Анионные липиды, наоборот, снижают способность липидов-формировать неламеллярные фазы, то есть стабилизируют липидный, бислой: (Lewis, Elhaney, 2000); Вероятно, поэтому ранее отмечалась прямая, зависимость между низким- содержанием кислых фосфолипидов- и чувствительностью роста бактерий к низкой температуре (Shiba et al:, 2004). Следовательно, увеличение уровня?кислых фосфолипидов должно, наоборот,, способствовать росту бактерий при высоких температурах. Кислые фосфолипиды также обеспечивают значительный;, усиливающий эффект на проводимость белковых ионных каналов-(Park et al., 2003),.что-соответствует данным по повышенной аккумуляции тяжелых металлов; в. клетках бактерий при:высоких температурах.культивации (Laddaga,. Silver, 1985). Вероятно;.это также свидетельствует: и об инициации другого адаптивного механизма к действию тяжелых металлов, так как известно, что заряженные фосфолипиды

48 обладают высокой сорбционной способностью (Barton, 1968; Wang et al., 2004). Сохранение высокого уровня анионных фосфолипидов под действием металлов при 24С, вероятно, способствует резистентности бактерий' к тяжелым металлам, что может быть связано с противоапоптозным действием белков теплового шока (Saydam et al., 2003).

3.1.2. Сравнительная характеристика жирнокислотного состава P. putida IB28 и Р:putida IB13

Состав, жирных кислот общих липидов P. putida IB28 (Табл. 5) и Р. putida IB 13 (Табл. 6) был типичным для данного вида бактерий (Hartig et al., 2005). В липидах бактерий обоих штаммов-были идентифицированы четыре доминирующие жирные кислоты (16:0,- 16:1п-7, 18:1п-7 и 17:0_ср), содержание которых в сумме составляло 73,5-95,3%. В липидах P. putida IB28 сумма ненасыщенных жирных кислот была в 1,5-3,9 раза выше, чем сумма насыщенных жирных* кислот.

Уровень насыщенных жирных кислот, который практически полностью-определялся содержанием пальмитиновой кислоты, резко падал при понижении температуры культивирования бактерий приблизительно в 1,5 и 2 раза для липидов штаммов P. putida IB28 и IB 13 соответственно. В противоположность этому сумма ненасыщенных жирных кислот увеличивалась в 1,2 и 2,2 раза соответственно, в основном за счет увеличения уровня 16:1п-7 в 1,8 и 6,5 раза (Табл. 5 и 6).

В результате соотношение ненасыщенные/насыщенные жирные кислоты было заметно выше при 4С, чем при 24С, что является классическим гомеовязкостным ответом бактериальных клеток (Вепеу et al., 2004) и других эктотермных организмов¹ (Sanina, Kostetsky, 2002; Sanina et al., 2008) на понижение температуры окружающей среды. Это согласуется с предыдущими работами; выполненными как на P. putida, так и других видах бактерий (Jostensen, Landfald, 1996; Hartig et al., 2005).

Таблица 5
Эффект температуры культивирования и ионов тяжелых металлов (Си~⁺ и
Cd~⁺) в составе культуральной среды (КС) на состав жирных кислот (ЖК)
общих липидов P. putida IB28 (% от суммы ЖК)

*ЖК менее 0;5 % в таблицу не включены. Стандартное отклонение составляло менее 0,8 % для трех повторностей.

Одновременно, более чем в 2 и 5 раз снижалось содержание 17:0_ср в липидах P. putida IB28 и IB 13 соответственно, что также способствует разжижению липидного бислоя, поскольку циклопропановые жирные кислоты, образующиеся путем метилирования ненасыщенных жирных кислот, в значительно меньшей степени снижают Т_тах фосфолипидов, чем ненасышенные кислоты (McGarrity, Armstrong, 1981).

При 24С тенденция увеличения насыщенности жирных кислот липидов штамма IB28 усиливалась под влиянием тяжелых металлов, причем эффект Cd был более выраженным по сравнению с Си" . В ряду KC2+2+ происходило увеличение не только уровня насыщенных жирных кислот, но и 17:0_ср; особенно заметное увеличение 17:0_ср (более чем в 2 раза) наблюдалось в присутствии Gd" в культуральной среде. Также Cd²⁺ более эффективно, чем Си7⁺, стимулировал изменение уровней других основных жирных кислот (16:0, Г6:1п-7 и 18:1п-7).

Таблица б

2+

Эффект температуры культивирования и ионов тяжелых металлов (Си" и

j2+

Cd ) в составе культуральной среды (КС) на состав жирных кислот (ЖК)
общих липидов P. putida IB 13 (% от суммы ЖК)

Г2+

2+

КС КС+ОГ KC+Cd^z" КС КС+СіГ KC+Cd

36,0 39,0

1,1

23,3

70,4

3,0

42,1 33,2 0,8

21,3

73,5

3,5

21,9

70,9

3,2

35,7

35,3

1,0

І нас. ЖК Z ненас. ЖК Ненас./нас.ЖК

*ЖК менее 0,5% в таблицу не включены. составляло менее 0,8% для трех повторностей

Стандартное отклонение

Таким образом, присутствие обоих ионов тяжелых металлов в КС усиливало эффект высокой температуры как на уровень 17:0_ср, так и насыщенность жирных кислот, что способствует большей стабильности липидного бислоя. Однако при низкой температуре реализуется только один из этих механизмов - увеличение насыщенности жирных кислот, но в сравнительно меньшей степени, чем при 24С. Содержание 17:0_ср наоборот, заметно снижалось под действием ионов тяжелых металлов, то есть усиливался эффект низкой температуры.

Противоположный эффект катионов тяжелых металлов наблюдался при^ низкой температуре культивирования бактерий штамма IB 13: уровень 17:0_ср повышался (Табл. 6), что препятствует механизму поддержания

51 жидкостности мембраны, и, тем самым, снижает способность бактериальных клеток адаптироваться к низкой температуре.

При 24С добавление ионов тяжелых металлов в культу рал ьную среду также противоположным образом, по сравнению со штаммом IB28, влияло на насыщенность жирных кислот, но аналогично стимулировало синтез главной циклопропановой кислоты 17:0_ср.

3.1.3. Фазовые переходы общих липидов штаммов Pseudomonas putida IB28 и IB13

Изменения в составе липидов и/или их жирных кислот влияют на

термодинамические параметры фазовых переходов гель - жидкий кристалл (Abbas, Card, 1980), которые' позволяют оценить эффективность меж- и внутримолекулярных адаптационных преобразований в липидах (Hazel, Williams, 1990), направленных на поддержание жидкокристаллического состояния, необходимого для нормального функционирования мембран.

Поэтому для сравнения адаптивных возможностей клеток P. putida IB28 и IB 13 к присутствию ионов тяжелых металлов в окружающй среде при различных температурах культивирования были исследованы калориметрические фазовые переходы гель - жидкий кристалл липидов этих бактерий. Термограммы фазовых переходов, полученные методом дифференциальной сканирующей калориметрии, располагались в интервале температур от -22 до 34С для P. putida IB28 (Рис. 1) и от -14 до 42С для Р. putida IB 13 (Рис.2).

Куполообразный профиль калориметрического перехода образца,
полученного после культивирования бактерий при 4С (Рис. 1Б), проявлялся
₍ в интервале температур от -14 до 32С с максимумом теплопоглощения (Т_тах)

при 8С. Таким образом, Т_тах приходилась на середину интервала и была близка к температуре культивирования. Такое положение Т_тах является обычным для бактериальных липидов. При этом бактерии как бы

і р

52 существуют «внутри фазового перехода», хотя это правило не является обязательным (Ивков, Берестовский, 1981).

-40 -30 -20 -10 О 10 20 30 40 50 60

-40 -30 -20 -10 О 10 20 30 40 50 60

Температура, С

Рис. 1. Термограммы фазовых переходов гидратированных общих липидов, выделенных из P. putida IB28, культивированных при 24С (А) и 4С (Б), в

присутствии меди ( ), кадмия (—) или без металлов ( — ). По оси ординат

- теплопоглощение. Соотношение между липидами и смесью вода: этиленгликоль (1:1, об/об) составляло 1:2, по весу. Скорость сканирования: 16С/мин. Масса липидов в образцах: 5 мг

Согласно точке зрения Морейна и др., липидныи состав бактерии регулируется таким образом, чтобы липиды мембран бактерий функционировали в интервале температур между двумя термоиндуцированными фазовыми переходами: гель - ламеллярный жидкий кристалл и ламеллярный жидкий кристалл - неламеллярная фаза (Morein et al., 1996). Более того, близость температуры роста к температуре перехода ламеллярный жидкий кристалл - инвертированная гексагональная фаза может быть особенно важной при регуляции динамических свойств мембраны, существенных для клеточных процессов, зависящих от слияния мембран (Paiement et al., 1994). Эта гипотеза подтверждается экспериментальными данными, полученными на микроорганизмах, липидныи состав которых изменялся в зависимости от температуры роста таким образом, что температура перехода в Нц фазу оказывалась на 10С

53 выше-температуры роста (Andersson et al., 1996). Хотя фазовое поведение: липидов мембран температурно-акклимированных эукариот исследовано в меньшей степени (Hazel et аГ., 1998), имеющиеся: данные также позволяют говорить, об участии теплового перехода, липидов ламеллярная -неламеллярная фаза в процессе их термоадаптации.-

Добавление Си, в КС мало влияло на. интервал перехода, но: заметно усложняло профиль термограммы.; Кроме основного- пика теплопоглощения при: 18С на термограмме проявлялся^ менее интенсивный, пик-при -12Є, что свидетельствовало о фазовом .разделении липидов (Mouritsen; Kinnimen., 1996): Ионы Cdr также вызывали- расщепление пика* на два= слабо-разрешенных максимума¹ теплопоглощения.

Отмеченные изменения? профиля?.термограмм липидов^; мало-' влияли_; на-:, долюшлощади, приходящуюся- на зону ниже .температурьъ культивирования* бактерии. 0на:оставалась\ низкой* (10-18%) независимо от присутствия ионов?.. металлов в: КС. Следовательно; причиной! небольшой: биомассы P.⁵ putidat IB28 при: низкой-; температуре культивирования, вероятно, является? то;. что/ при этой температуре лишь небольшая часть липидов находится в оптимальном, для функционирования: жидкокристаллическом СОСТОЯНИИ;. Фазовое разделение липидов также может быть причиной ухудшения роста бактерий под: влиянием; ионов, тяжелых металлов, поскольку приводит к увеличению проницаемости мембран (Williams, 1990).

С повышением температуры культивирования до 24С температурные интервалы фазовых переходов липидов P. putida IB28 мало изменялись. В: отсутствие ионов металлов- в культуральной: среде Т_тах повышалась с 8 до 12С (Рис. .ГА);. При этом; происходило, резкое увеличение: доли площади термограммы;, (до 92%), приходящейся на температуры ниже температуры культивирования - 24С. Таким; образом, повышение температуры, не оказывая- существенного влияния на термотропное поведение липидов; способствовало образованию оптимального для функционирования мембран жидкокристаллического состояния практически всей массы липидов. Эффект

54 Си и Cd на термотропное поведение липидов P. putida IB28, выращенных при 24С был подобен таковому в липидах бактерий, культивированных при

4С. Причем, Си способствовал большему разрешению пиков теплопоглощения по сравнению с ионами Cd при обеих температурах культивирования.

Влияние температуры и ионов тяжелых металлов на термотропное поведение общих липидов P. putida IB 13 (Рис. 2) было принципиально сходным с P. putida IB28. T_max (12С) фазового перехода липидов, полученных после культивирования P. putida IB 13 при 4С (Рис. 2А), приходилась на середину температурного интервала перехода (-10-30С).

і і і

Температура, С

Рис. 2. Термограммы фазовых переходов гидратированных общих липидов, выделенных из P. putida IB 13, культивированных при 24С (А) и 4С (Б), в

присутствии меди ( ), кадмия (—) или без металлов ( — ). По оси ординат

- теплопоглощение. Соотношение между липидами и смесью вода: этиленгликоль (1:1, об/об) составляло 1:2, по весу. Скорость сканирования: 16С/мин. Масса липидов в образцах: 5 мг

Добавление ионов меди существенно изменяло профиль термограммы общих липидов. В результате регистрировались два хорошо разрешенных максимума теплопоглощения при 4С и 36С соответственно, свидетельствующие о наличии фазового разделения липидов. Добавление

55 .

ионов Gd также приводило к фазовому разделению липидов' но. в> значительно'меньшей-степени, судя по*двум слаборазрешенным максимумам теплопоглощения на. соответствующей' термограмме (Рис. 2Б). Кроме того;.. наблюдалось заметное понижение высокотемпературной: границы; фазового перехода с 30С (без ионов) и 40G (с Gu?⁺) до 22Є. ;

Результатом. повышения температуры культивирования было существенное: уширение температурного интервала, фазового перехода липидов,Р: putida IB 13 за счет сдвига верхней, границы интервала с 30^?С до; 42СІ Максимальное теплопоглощение наблюдалось при 20-24G, что совпадало с температурой культивирования: Положение: термограммы относительно'Температурной: шкалы свидетельствовало о том, что: прш24С (в.отличие. откультивирования, при 4G) большая .часть липидов находилась, в < оптимальном для функционирования- мембран? жидкокристаллическом; состоянии- так,' как. около 70% площади термограммы, приходилось на: температуры ниже температуры выращивания: бактерий. Это согласуется? с существенным^ увеличением биомассы бактерии при 24G по сравнению» с: 4С (Табл:. 1): Как и в штамме 1В28^ ионы меди индуцировали, более выраженное фазовое разделение липидов P. putida IB 13 по сравнению с ионами кадмия, хотя эти различия выглядели более сглаженно при повышенной температуре культивирования:

Фазовое разделение липидов^ которое возникает в присутствии металлов, вероятно, может служить в качестве адекватного объяснения одного из механизмов токсического действия- меди и кадмия на клетки: Р. putida. В основе фазового разделения липидов может лежать, как непосредственное связывание- ионов- тяжелых металлов с кислыми липидами и образованием более ригидных кластеров, так и; изменения в: составе липидов..

56- ." ;

3;1.4. Анализ сорбционной способности numij\OKPseudomonas putida \Ъ2& иІВІЗ .

Для установления, причины фазового разделения и роли фосфолипидовв-механизмах аккумуляции металлов^ общие липиды и их фракции (ФЭ* и ФГ+ДФЕ+ФИ), выделенныеиз Р: putida IB28 и IB 13 после культивирования-, бактерий в KG,. KC+Cu²⁺ и KG+Gd²⁺, были; исследованы, методом* атомно-адсорбционного анализа. Как: видно из таблицы 7, ионы меди и кадмия'в_; различной- степени аккумулируются; в общих липидах, цвитеррионном ФЭ и анионных липидах ФГ+ДФГ+ФИ;

Таблица 7 Концентрация ионов меди и_; кадмия в липидах Pseudomonas putida IB28- и IB13, выращенных- в культуральной среде (КС) в, присутствии СіГ⁺ (KC+Gu^z+) илиСё²⁺ (KG+Cd²⁺) при различных температурах, мкг/мг липида^

* - измерения не проводились

При 24G количество ионов меди; связанных с общими липидами Р.
putida IB28; и IB13 и их фракциями, было-в, 1<2",5-50 раз больше, чем ионов
кадмия, что, вероятно, связано с:большей константой ассоциации фосфатных
групп фосфолипидов; с; Gu; , чем-с Gd^r (Barton, 1968). В^: результате, ионы
меди индуцировали более выраженное фазовое разделение липидов P. putida
по сравнению*с ионами:кадмия, (Рис. 1 ш2). Интереснояотметить, что менее
резистентный; к. действию-^ тяжелых металлов, штамм. IB 13 отличался более:
высокою, сорбционнош способностью общих липидов; особенно? для ионов:,
меди; . . , ,' .' . :'

G другой стороны, суммарные фракции анионных липидов; ФК, ДФГ и ФИ обоих штаммов сорбировали в 2-4,5 раза больше как Gu~⁺, TaK,HiGd~⁺ по

57 сравнению с цвиттерионным ФЭ. Следовательно, наблюдаемое усложнение профилей термограмм общих липидов P. putida является результатом сорбции ионов тяжелых металлов, прежде всего кислыми фосфолипидами. Известно, что-именно.кислые фосфолипиды, связываясь с двухвалентными ионами, уплотняются, образуя более ригидные домены. При этом ионные мостики образуются между двумя липидными молекулами (Lee, 1977). Сегрегация липидов в липидных смесях приводит к фазовому разделению и увеличению проницаемости бислоев (Williams, 1990). Кроме того, отрицательно заряженые фосфолипиды могут также опосредованно увеличивать ионную проводимость мембран, влияя на конформацию белковых ионных каналов (Park et al., 2003).

3.1.5. Анализ проницаемости бислойных липидных мембран на основе липидов Pseudomonasputida IB28

Влияние Gu"⁺ и Cd²⁺, добавленных в КС, на ионную проницаемость мембран из бактериальных липидов было изучено с помощью техники бислойных липидных мембран (БЛМ) для выяснения роли фазового

0-4- "?4-

Характеристика липидов мембран грамотрицательных бактерий

Основной характеристикой бактериальных клеток является высокое содержание фосфолипидов (ФЛ) - от 70 до 90% от суммы общих липидов. Функциональная роль бактериальных липидов определяется их локализацией во внешних слоях клетки, сложностью их структуры и быстрым изменением состава во время приспособления микроорганизмов к меняющимся условиям внешней среды.

Полярные липиды, составляющие основу липидного матрикса клеточных мембран живых организмов, представляют собой сложные соединения, насчитывающие большое количество различных видов. Отличительные особенности классов липидов( основаны на различиях их полярных головных групп. Каждый класс состоит из ряда молекулярных видов, зависящих от длины жирнокислотных цепей, их позиции и количества двойных связей. Причина разнообразия, липидові и обоснованные биохимические процессы, поддерживающие гомеостаз липидного состава морфологически различных мембран, подробно описаны в литературе (Dowhan, 1997; Wolf, Quinn, 2008). Наружная и цитоплазматическая мембраны грамотрицательных бактерий отличаются своим фосфолипидным составом. Так, в наружной мембране Salmonella typhimurium основные фосфолипиды фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилглицерол (ФГ) и дифосфатидилглицерол (ДФГ) находятся в процентном соотношении 81:17:2. В цитоплазматической мембране соотношение данных фосфолипидов составляет 60:33:7 соответственно. Сходные данные были получены для мембран Escherichia coli К-12; Pseudomonas BAL-31 и Proteus mirabilis (Goldfine, 1984). У Е. coli состав фосфолипидов остается практически постоянным при довольно широком спектре условий роста: 70-80% приходится на долю ФЭ, 20-25% на долю ФГ и около 5% на долю ДФГ (Dowhan, 1997). Виды рода Pseudomonas тоже отличаются сравнительно простым фосфолипидным составом: ФЭ - 69%, ФГ - 15% и ДФГ - 11%, являются главными липидами мембран. Характерной особенностью Yersinia pseudotuberculosis является сравнительно высокое содержание лизоформы ФЭ (от 7 до 35% в зависимости от способа культивирования и фазы роста) (Бахолдина и др., 2001) наряду с доминирующими фосфолипидами: ФЭ (26%), ФГ (23%) и ДФГ (14%).

Фосфатидилхолин (ФХ) - основной мембранообразующий липид эукариот, также найден во внешней и внутренней мембранах Pseudomonas aeruginosa и нескольких видов других грамотрицательных бактерий, и составляет около 4 % (Baysse et al., 2005). Предполагается, что более 10 % микроорганизмов содержат ФХ (Baysse, 2007). Этот фосфолипид характерен для- тех бактерий, которые являются симбионтами или патогенами эукариотических организмов (Lopez-Lara, Geiger, 2001). В обзоре С. Вилкинсона (Wilkinson, 1988) приводятся данные о том,, что грамотрицательные бактерии с высоким уровнем ненасыщенных жирных кислот (более 75%) и развитой системой внутриклеточных мембран содержат ФХ, образующийся при метилировании ФЭ S-аденозилметионином (Arondel et al., 1993), а также монометилфосфатидилэтаноламин (ММФЭ) или диметилфосфатидилэтаноламин (ДМФЭ), обеспечивающие вязкость липидного матрикса мембран. В частности, заметные количества ММФЭ и ДМФЭ были обнаружены в Yersinia pseudotuberculosis (Бахолдина и др., 2001).

В работе японских авторов (Inoue et al., 1997) показано, что у Е. coli поддержание липидного баланса мембран важно для различных мембранных функций и сохраняется на постоянном уровне. Большинство бактерий поддерживают баланс несущих заряда мембранных липидов, смещенный в сторону цвиттерионных липидов (ФЭ и ФХ), тогда как на долю анионных липидов ФГ, ДФГ, фосфатидилинозитола (ФИ) и фосфатидной кислоты (ФК) приходится менее 30%. 1 .2.Г.Г.-Функции цвиттерионных липидов

Цвиттерионные липиды ФЭ и ФХ составляют основную часть мембранных фосфолипидов грамположительных и грамотрицательных бактерий. Полярные головные группы ФХ и ФЭ обладают дипольным-моментом и могут .ориентироваться мембранным электрохимическим потенциалом (Seelig, 1993).

Неламеллярные липиды, к которым относится доминирующий фосфолипид грамотрицательных бактерий ФЭ, а также его лизоформа лизофосфатидилэтаноламин (ЛФЭ), во» многом определяют физические свойства мембран и влияют на активность мембранных белков. По сравнению с. ламеллярными липидами (ФХ), молекулы которых имеют цилиндрическую форму, они оказывают более высокое латеральное давление на мембранные белки благодаря- конической форме своих молекул. Вследствие этого неламеллярные липиды могут выполнять важную структурную функцию, удерживая-белки в мембране (de Kruijff, 1997а). Так, активность протеинкиназы С выше. в. окружении- неламеллярных липидов,» формирующих кубическую фазу (Keller et al., 1996).

Биологические объекты

Штаммы Pseudomonas putida IB 13 (EF581813, GenBank) и Pseudomonas putida IB28 (EF581812, GenBank), использованные для данной работы, были любезно предоставлены доцентом Отделения общей экологии, к.б.н. Безвербной И.П. Данные штаммы были изолированы из морской воды бухты Золотой Рог (зал. Петра Великого, Японское море) и охарактеризованы как штаммы, проявляющие множественную высокую резистентность к различным тяжелым металлам (Си, Cd, Zn, Со). Идентификацию и анализ морфологических и физиолого-биохимических свойств штаммов проводили на основе стандартных тестов API-20NE (bioMerieux, Франция), а также использовали метод сидеротипирования (Meyer, 2000).

Штамм KS 3058 Yersinia pseudotuberculosis (серовар 0:1b) (Шовадаева и др., 1991), был изучен в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии СО РАМН и любезно предоставлен научным сотрудником Лаборатории химии неинфекционного иммунитета СИ. Бахолдиной. Штамм микроорганизма был типичен по своим морфологическим, культуральным, биохимическим, антигенным свойствам и не содержал плазмид. Условия культивирования

Культивирование штаммов Pseudomonas putida IB 13 и Pseudomonas putida IB28 проводили при 4С и 24С на среде, адаптированной для морских бактерий. Состав среды (г/л): СаС03 - 1,0; MgS04 - 1,0; пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0; глюкоза - 1.0, К2НР04 - 0,2; агар - 15,0; Н20 морская - 500 мл, Н20 дистиллированная - 500 мл, рН - 7,8-8,1 (КОН). Металлосодержащие среды готовили на основе указанной среды с добавлением хлоридов меди или кадмия в концентрациях 300 и 80 мг/л соответственно. Использованные концентрации солей были выбраны на основе предварительных экспериментов по определению минимальных ингибирующих концентраций (MIC), подавляющих рост металлочувствительных бактерий, изолируемых из прибрежных морских вод (Безвербная и др., 2003). Указанные концентрации при оптимальной температуре не вызывали видимых физиологических изменений. Биомассу бактерий в конце экспоненциальной фазы роста смывали 0,85% раствором NaCl, осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 5000 об/мин, промывали дважды 0,85% раствором NaCl (рН 5,5), содержащим 50 дМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA).

Бактерии Yersinia pseudotuberculosis культивировали на питательном бульоне (ПБ, Махачкала, Россия) и питательном бульоне с добавлением 0,5% глюкозы (ПБ+Glc) в аэробных и анаэробных условиях в колбах объемом 1 л на качалке (180 об/мин), либо в таких же колбах в аэробных условиях без перемешивания. Анаэробные условия создавали путем продувания аргона через вакуумированные колбы объемом 1 л со 150 мл стерилизованной среды. Стерилизацию вводимого аргона осуществляли с использованием насадки с ультрафильтром с размером пор 0,2 мкм. По достижении стационарной фазы роста через одни сутки при 37 С («тепловые» варианты) и через 6 суток при 8 С («холодовые» варианты) бактерии убивали 1%-ным раствором фенола в течение 20 мин и отделяли от культуральной жидкости центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин, полученный осадок клеток дважды промывали 0,85% раствором NaCl (рН 5,5).

Общие липидные экстракты из отмытой бактериальной массы были получены по методу Фольча (Folch et al., 1957). Сырую бактериальную массу заливали смесью растворителей хлороформ-метанол (2:1 об/об) и оставляли в склянке из темного стекла на 2 ч на магнитной мешалке. Затем полученную суспензию бактериальных клеток центрифугировали 15 мин при 3000 об/мин. Супернатант (липидный экстракт) сливали, а осадок бактериальных зз . клеток вновь заливали системой и дважды повторяли предыдущие этапы! экстракции.. Экстракты, растворенные в хлороформе, стабилизировали 0,05% 2,6-дигтрет-бутил-л-крезолом и хранили в морозильной камере в; плотное закрытой посуде темного стекла.,

Суспензии 2-х часовой фракции силикагеля, приготовленной; по методу В.И.: Светашева и В.Е. Васьковского (Svetashev, Vaskovsky, 1972); смешивали с 10% гипса и наносили по Л,5 мл на стеклянные пластинки размером 6x6 см. Пластинки.высушивали; на- воздухе и перед применением активировали, 1 ч-при 110С в сушильном шкафу.

Для разделения фосфолипидов, бактерий с помощью двумерношМТСХ; на силикагеле в первом направлении применяли: систему хлороформг метанол - бензол - 28% аммиак (65:30:10:6 об/об) (все соотношения указаны в; объемах растворителей). Во втором, направлении; использовали систему хлороформ - метанол - бензол - уксусная кислота - ацетон - вода (70:30:10:5:4:1 об/об) (Vaskovsky, Terekhova, 1979). Для разделения нейтральных липидов от фосфолипидов с помощью одномерной МТСХ использовали систему гексан-диэтиловый эфир муравьиная кислота (80:20:2 об/об). Для анализа фосфолипидов методом одномерной ТЄХ использовали водную систему: хлороформ — метанол - вода (65:25:4 об/об).

Влияние ионов тяжелых металлов и температуры культивирования на термотропное поведение липидов металлрезистентных штаммов Pseudomonasputida

Проблема биоремедиации и биоутилизации поллютантов становится все более актуальной в связи с постоянно возрастающим загрязнением окружающей среды. Последнее время микроорганизмы все чаще рассматриваются как возможные биоремедиаторы токсических соединений (Mandal, 2006) и биоиндикаторы загрязнения морских акваторий. Известно, что металлорезистентные бактерии являются эффективным и экономичным биоматериалом для. извлечения тяжелых металлов из загрязненных вод. Но» для их широкого использования в биоремедиации необходимо четкое понимание механизмов сорбции ионов, бактериальными клетками, а также молекулярных механизмов их адаптации к высоким концентрациям» токсичных металлов.

Бактерии выработали различные механизмы резистентности к повреждающему действию тяжелых металлов, в числе которых сорбция катионов металлов и их аккумуляция внутри клеток (Chen et al., 2007). Сорбцию тяжелых металлов микроорганизмами связывают с взаимодействием их ионов с функциональными группами белков, липидов и углеводов, составляющих клеточные мембраны бактерий (Crist et al., 1981; Greene et al., 1986). При повышенных концентрациях ионов тяжелых металлов происходит изменение проницаемости цитоплазматической мембраны у металлрезистентных бактерий (Theuvenetet a 1., 1987), хотя причина остается неясной. Ранее было показано, что внутренние и внешние мембраны Pseudomonas putida 5-х. способны адсорбировать тяжелые металлы из окружающей среды. Было сделано предположение, что довольно высокое содержание фосфолипидов в наружной мембране может являться основной причиной ее высокой сорбционной способности (Wang et al., 2006). Известно также, что резистентность к тяжелым металлам зависит от температуры, окружающей среды (Cervantes, Gutierez-Corona, 1994).

Устойчивость бактерий к неблагоприятным условиям среды в большой степени определяется их способностьюJ к быстрому изменению физико-химических свойств мембран, с которыми связаны многие жизненно важные процессы в клетке. Эти компенсаторные приспособления осуществляются за счет композиционных и внутримолекулярных перестроек мембранных липидов и направлены на поддержание жидкокристаллического состояния липидного матрикса, оптимального для функционирования мембран (Hazel, Williams, 1990; Nagamachi et al., 1991). Поэтому изучение эффектов катионов тяжелых металлов на липидный матрикс мембран, являющихся ключевым элементом взаимосвязи между внешней средой и внутриклеточными ответами микроорганизма, может прояснить многие вопросы резистентности, или, наоборот, уязвимости бактерий.

Жидкокристаллический липидный матрикс цитоплазматических мембран бактерий выполняет функции стресс-детектора, поскольку очень чувствителен к различным факторам окружающей среды (Beney, Gervais, 2001). Наиболее изучено влияние температуры на физико-химическое состояние липидного матрикса бактериальных мембран, тогда как сведения о действии других абиотических факторов ограничено. В связи с этим было проведено комплексное исследование состава- и термотропного поведения общих липидов, выделенных из двух штаммов морской бактерии P. putida IB28 и IB 13, характеризующихся высокой устойчивостью к различным тяжелым металлам, для выяснения физико-химических свойств липидов, позволяющих бактериям выживать в условиях предельных концентраций Си и Gd при разных температурах окружающей среды. 3.1.1. Сравнительная характеристика роста и липидного состава штаммов P. putida IB28 и IB13

Как видно из таблиц 1 и 2, низкая температура и ионы тяжелых металлов заметно влияют на рост P. putida IB28 и IB 13. Понижение температуры с 24С до 4С вызывало снижение бактериальной массы Р. putida IB28 и IB 13 в 1,4 и 2 раза соответсвенно, что совпадает с полученными ранее данными о низкой физиологической активности разных видов Pseudomonas при пониженных температурах (Pinkart, White, 1997; Николаев и др., 2000).

Добавление в культуральную среду (КС) ионов СіГ " и С(Г усиливало эффект понижения температуры: биомасса снижалась в 2,5 и 5,5 раза для Р. putida IB28. В P. putida IB 13 подобный эффект наблюдался для ионов Си -биомасса снижалась в 2,8 раза, тогда1 как добавление Cd2+ не оказывало дополнительного влияния; Таким образом, снижение температуры и включение тяжелых металлов в культуральную среду, в основном, аддитивно ингибируют рост штаммов P. putida.

При постоянных температурах Cd" , как правило, более эффективно снижал биомассу бактерий по сравнению с Си" , что согласуется с литературными данными о различии токсического действия Си и Cd (Nies, 1999). Однако снижение биомассы, вызванное понижением температуры, было одинаковым (в 2,3 раза), независимо от того, какой металл присутствует в среде роста P. putida IB28 в отличие от штамма P. putida IB 13, где ингибирование роста при снижении температуры наблюдалось только в присутствии Си2+, но не Cd2+.

Влияние температуры, условий аэрации и глюкозы на липидный состав Yersinia Pseudotuberculosis

Для оценки влияния глюкозы и условий аэрации на липидный состав Y. pseudotuberculosis было проведено сравнительное изучение липидного профиля клеток, выращенных на питательном бульоне и на питательном бульоне с добавлением глюкозы при перемешивании и без перемешивания. Исследование проводили при двух температурах - 8 и 37С, соответствующих сапрофитической и паразитической фазам существования бактерий.

Так, при 37С выход биомассы был, примерно, в 2-4 раза меньше, чем при 8С. Почти такой же эффект оказывало культивирование без перемешивания, что, вероятно, связано с резким падением концентрации растворенного кислорода, который, как известно, является главным лимитирующим фактором клеточного роста (Глик, Пастернак, 2002). Максимальный же эффект добавления глюкозы в питательный бульон выражался в уменьшении биомассы бактерий в 1,5-1,8 раза в сравнении с выходом на среде без глюкозы.

Таким образом, низкие температуры являются предпочтительными для роста этих бактерий, что подтверждают ранее полученные данные (Бахолдина и др., 2001). Глюкоза, наоборот, ингибировала рост клеток, причем в наибольшей степени этот эффект проявлялся при высокой температуре культивирования без перемешивания и при перемешивании на холоду. При этом умеренный рост бактерии можно рассматривать как приспособительный признак.

Клетки, культивируемые при 8С без перемешивания, также характеризуются уменьшением выхода биомассы в 2,3 - 3,9 раза в сравнении с клетками, выращенными при интенсивном перемешивании. Низкий выход биомассы на обеих средах в этих условиях, вероятно, связан с резким падением концентрации растворенного кислорода, что, как известно (Глик, Пастернак, 2002), является главным лимитирующим фактором клеточного роста.

Таким образом, низкие температуры являются предпочтительными для роста этих бактерий. Глюкоза являлась ингибитором роста клеток, причем в наибольшей степени этот эффект проявлялся при высокой температуре культивирования в стационарных условиях и при перемешивании на холоду. В результате выход биомассы снижался в 1,5 и 1,2 раза соответственно при 37 и 8С (Табл. 9). При этом умеренный рост бактерии на этой стадии можно рассматривать как приспособительный признак.

Как правило, такая же тенденция наблюдается и в отношении общих липидов и фосфолипидов. В Y. pseudotuberculosis содержание общих липидов, основная часть которых представлена фосфолипидами, возрастает с падением температуры роста, что подтверждают и литературные источники (Salamah, АН, 1995). В обеих питательных средах при температуре культивирования 8С колонии содержали больше общих липидов и фосфолипидов, чем «тепловые» бактерии, за исключением бактерий, культивированных без перемешивания бульона с глюкозой и без нее соответственно.

Из таблицы 9 (колонки 1, 2 и 4) видно, что преобладающими при 8С в обеих средах являлись фосфолипиды, превосходившие по массе нейтральные липиды в 17, 10 и 1,1 раз соответственно, тогда как при 37С доминирование фосфолипидов (в 2,6-3,6 раза) наблюдалось только в отсутствии глюкозы независимо от режима аэрации. Присутствие глюкозы в питательном бульоне ингибировало синтез фосфолипидов при обеих температурах и различных режимах аэрации, но максимальный эффект наблюдался при 37С. Уровень фосфолипидов в этих клетках падал почти в 2 раза, а уровень нейтральных липидов, наоборот, повышался во столько же раз в присутствии глюкозы. Таким образом, присутствие глюкозы в среде смещает синтез в сторону накопления запасных липидов:

Содержание НЛ в клетках, выращенных при 8С, было самым низким и практически не изменялось при добавлении глюкозы в среду роста (0,4 и 0,5% от сухой бактериальной массы соответственно) при перемешивании. Вероятно, увеличение продукции фосфолипидов и уменьшение содержания нейтральных липидов у «Холодовых» вариантов бактерий связано с потребностью клеток в строительном материале, так как биомасса интенсивно увеличивалась. Ограничение доступа кислорода, когда культуральная среда не перемешивалась, и добавление глюкозы аддитивно действовали на снижение биомассы «Холодовых» вариантов, что и отразилось в накоплении нейтральных липидов (колонки 3 и 4). У «тепловых» вариантов бактерий содержание нейтральных липидов также заметно повышалось под действием этих факторов. По-видимому, в условиях ограниченного роста клеток нейтральные липиды выполняют функции запасных веществ.

Сравнительный анализ липидных экстрактов Y. pseudotuberculosis показал, что качественный состав фосфолипидов сохраняется в «Холодовых» и «тепловых» вариантах бактериальных клеток независимо от наличия глюкозы или режима аэрации питательного бульона. Все четыре идентифицированных фосфолипида (ФЭ, ЛФЭ, ФГ и ДФГ) присутствовали в значительных количествах. В большинстве «холодных» вариантов также содержался монометиловый эфир ФЭ (МеФЭ). Количественный состав фосфолипидов менялся под действием всех трех факторов: температуры, присутствия глюкозы в питательном бульоне и режима аэрации. Как правило, доминирующим фосфолипидом был ФЭ. Но его количество при культивировании без перемешивания питательного бульона при низкой температуре падало в 2,9-3,5 раза и не превышало 30%. Одновременно уровень ЛФЭрезко возрастал до 33,2-45,6% по сравнению с 2,1-7,7% при перемешивании культуральной" среды. Повышению уровня ЛФЭ также способствовало добавление в питательный бульон глюкозы, особенно при 37С, когда одновременно с увеличением содержания ЛФЭ в 3,7-7,5 раза происходило уменьшение количества ФЭ в 1,5 раза как при перемешивании, так и без него.

Похожие диссертации на Влияние условий культивирования на термотропное поведение липидов Pseudomonas putida и Yersinia pseudotuberculosis

Иммунобиологические свойства порообразующего белка из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosisПортнягина, Ольга Юрьевна

Эколого-биохимический анализ изменчивости озимой пшеницы в зоне влияния линий электропередачи в условиях Среднего ПоволжьяМичурина Надежда Юрьевна

Реакция эндокринной системы и морфо-функциональное состояние костной ткани под влиянием постоянного магнитного поля в условиях тепловой нагрузкиИванов Дмитрий Геннадьевич

Влияние мелатонина на липидные показатели кожи крыс в условиях водно-иммобилизационного воздействияКостюк Наталья Валериевна

Влияние производных имидазола на состояние клеточных мембран в условиях воздействия серосодержащих соединенийКузнецова, Ольга Алексеевна

Биохимические механизмы влияния полихлорированных бифенилов на морфофункциональное состояние сперматогенеза в экспериментальных условияхБулыгин Кирилл Владимирович

Влияние факторов окружающей среды на перекисное окисление липидов в условиях натурного и камерального экспериментовМищенко, Татьяна Михайловна

Биохимические механизмы влияния полихлорированных бифенилов на морфофункциональное состояние сперматогенеза в экспериментальных условияхБулыгин Кирилл Владимирович

ВЛИЯНИЕ ХЛОРХОЛИНХЛОРИДА НА КАЧЕСТВО ЗЕРНА ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПРИМЕНЕНИЯ МИНЕРАЛЬНЫХ УДОБРЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ОРОШЕНИЯГохар, Гусейн Ага-кызы

Влияние биовермикулита на выведение тяжелых металлов из организма и нормализацию обмена веществ у коров в условиях техногенной зоныСмекалов, Михаил Андреевич