Введение к работе
Актуальность проблемы. Повышенные или пониженные температуры являются ведущими факторами, определяющими рост, развитие растений и ареалы их распространения. Изучение механизмов адаптации к низким температурам злаков, имеющих важное в хозяйственном отношении значение, всегда находилось в центре внимания исследователей. Такой интерес продиктован необходимостью изучения механизмов устойчивости растений к действию низкой температуры.
Ответ растений на низкотемпературный стресс сопровождается многочисленными физиологическими и биохимическим изменениями, общий механизм которых направлен на адаптацию и предотвращение повреждений, вызванных низкими температурами. Хорошо изученными в этом отношении представляются изменения липидного состава, повышение ненасыщенности жирных кислот, накопление криопротекторных веществ, таких как сахара и аминокислоты. Эти изменения, обусловленные изменением активности соответствующих ферментов, способствуют стабилизации клеточных мембран и предотвращают их повреждения. При этом возрастают энергозатраты клетки, связанные с усиленным использованием ассимилятов и энергии, и происходит усиление эффективности дыхания (Семнхатова, 1995). Усиление эффективности дыхания, в свою очередь, связано со структурно-функциональными изменениями митохондриального аппарата (Войников, 1987; Хохлова и др., 1993; Кислюк и др., 1995), происходящими при низкотемпературном воздействии.
Существенным ответом клеточного метаболизма на низкотемпературный стресс является индукция синтеза специфических белков, названных белками холодового шока (БХШ). Одни из этих белков выполняют криопротекторную функцию, другие предотвращают повреждения, возникающие при обезвоживании клетки, третьи функционируют как белки-шапероны и разобщающие белки типа UCP, вызывают разобщение процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях.
Одним из стрессовых белков, синтез которого индуцируется низкими температурами (Колесниченко и др., 1996) и который, как предварительно показано в экспериментах in vitro, выполняет функцию разобщения окислительного фосфорилирования в митохондриях (Побежимова и др., 1996; Vomikov et al., 1998), является стрессовый белок с мол. массой 310 кДа (БХШ 310). Как известно, ареал распространения злаков достаточно велик и поэтому в ходе эволюции у них должны были возникнуть механизмы,
способствующие приспособлению к низким температурам. Возможно, какая-то доля в приспособлении злаков к низким температурам принадлежит механизму, связанному с БХШ 310.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение функции и локализации стрессового белка БХШ 310 в митохондриях растений. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) изучить зависимость между содержанием БХШ 310 в растительных митохондриях и их переходом в низкоэнергетическое состояние во время низкотемпературного стресса; 2) определить в условиях in vitro реакцию митохондрий озимой пшеницы на действие конститутивно синтезируемой и стрессовой, форм БХШ 310; 3) установить, происходит ли ассоциация БХШ 310 с митохондриями озимой пшеницы in vitro; 4) определить внутримитохондриальную локализацию белков, иммунохимически родственных БХШ 310 озимой ржи, в митохондриях озимой пшеницы; 5) определить влияние БХШ 310 на активность митохондрий однодольных и двудольных растений; 6) определить действие антисыворотки против БХШ 310 на активность митохондрий, изолированных из растений различных видов; 7) изучить влияние БХШ 310 на функционирование отдельных комплексов дыхательной цепи митохондрий озимой пшеницы; 8) сравнить разобщающее действие БХШ 310 с действием "классических" разобщающих белков.
Научная новизна. В настоящей работе проведено исследование одной из функций стрессового белка БХШ 310 - функции разобщения окисления и фосфорилирования митохондрий растений; изучены характеристики разобщающего действия данного белка; его внутримитохондриальная локализация.
Впервые установлено, что у злаков стрессовый белок БХШ 310 во время низкотемпературного стресса запускает механизм перехода митохондрий в низкоэнергетическое состояние. Впервые показано, что разобщающее действие БХШ 310 происходит за счет его ассоциации с митохондриями во время низкотемпературного стресса. Стрессовая форма БХШ 310, по сравнению с конститутивно синтезируемой формой БХШ 310, обладает более сильным разобщающим действием. Антисыворотка, полученная против БХШ 310, прецигштирует БХШ 310 и элиминирует его разобщающий эффект. Механизм разобщающего действия БХШ 310 отличается от механизма действия "классических" разобщающих белков и не связан с "циклическим оборотом" жирных кислот. Установлено, что наиболее сильное разобщающее действие БХШ 310 связано с комплексом I дыхательной
цепи растительных митохондрий. Впервые обнаружено, что в митохондриях озимой пшеницы полипептиды, иммунохимически родственные БХШ 310, представлены набором 66, 60, 58, 55 и 23 кДа. Эти полипептиды локализованы в основном во внутренней мембране.
Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые проведенное в работе изучение функции и локализации стрессового белка 310 кДа в митохондриях растений позволяет более глубоко понять механизмы функционирования стрессовых белков в растительной клетке при низкотемпературном стрессе. Полученные результаты могут служить основой для дальнейшего развития технологий в сельскохозяйственной деятельности для выведения хозяйственно ценных сортов растений, устойчивых к низким температурам.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 работы. Результаты исследований по теме диссертации были представлены на четвертом съезде физиологов растений (Москва, 1999), на семинарах лаборатории физиологической генетики СИФИБР СО РАН (1998-2000), на научном межлабораторном семинаре СИФИБР СО РАН (2000), на отчетных сессиях СИФИБР СО РАН (1998, 2000).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 174 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 15 рисунков; состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части, заключения, выводов и библиографии. Библиография включает 245 наименований, из них 112 на русском языке.
