Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Иммунитет растений 8
2.2. Программируемая гибель клеток 9
2.2.1. Современные представления о гибели клеток 9
2.2.2. Каспазы 14
2.2.3. Программируемая клеточная смерть (ПКС) у растений и животных 15
2.2.4. Участие митохондрий и хлоропластов в ПКС 16
2.2.5. Проникающие ионы, производные убихинона и пластохинона 24
2.2.6. ПКС в онтогенезе растений 26
2.2.7. Гиперчувствительный ответ клеток растений 28
2.3. Активные формы кислорода 33
2.4. NADPH-оксидаза 37
2.4.1. Формы и структура NADPH-оксидаз 37
2.4.2. Регуляция активности NADPH-оксидазы растений 43
2.4.3. Ингибиторы NADPH-оксидазы 45
2.5. Пероксндазы 46
2.6. Заключение 48
3. Экспериментальная часть 50
3.1. Объекты и методы исследования 50
3.1.1. Объекты исследования 50
3.1.2. Оксиметрия 51
3.1.3. Анаэробные условия 53
3.1.4. Инфильтрация и инкубация с реагентами 53
3.1.5. Световая микроскопия 54
3.1.6. Конфокальная микроскопия 55
3.1.7. Регистрация активных форм кислорода 55
3.1.8. Статистическая обработка данных 56
3.2. Результаты исследования 58
3.2.1. CN" как индуктор ПКС 58
3.2.2. Хитозан как индуктор ПКС 61
3.2.3. Действие SkQ 63
3.2.4. Действие проникающих ионов на ПКС 65
3.2.5. Действие разобщителей и фенольных соединений на ПКС 79
3.2.6. Действие доноров электронов для пероксидазы-оксидазы на ПКС 83
3.3. Обсуждение результатов 90
4. Заключение 98
5. Выводы 99
Литература 100
- Современные представления о гибели клеток
- Формы и структура NADPH-оксидаз
- Действие проникающих ионов на ПКС
- Обсуждение результатов
Введение к работе
Актуальность работы
В отличие от животных, у растений нет специализированных клеток, поглощающих и обезвреживающих патогенов. Каждая клетка растения обладает способностью к защите от патогена. При распознавании инфекционных возбудителей или их сигнальных соединений включается гиперчувствительный ответ (ГО), сопровождающийся продукцией активных форм кислорода (АФК), гибелью клеток растения и гибелью патогенного микроорганизма, вторгшегося в ткани растения. Это препятствует распространению инфекции на другие клетки. Программируемая клеточная смерть (ПКС) играет важную роль в онтогенезе и поддержании тканевого гомеостаза организма. Являясь составляющей иммунитета, ПКС вовлечена в защиту от инфекционных возбудителей как у животных, так и у растений. Важную роль в ПКС играют биоэнергетические структуры клетки. Для реализации ПКС необходимы АФК: анаэробиоз или антиоксиданты предотвращают ПКС (Самуилов и др., 2002; Васильев и др., 2009). Митохондрии - поставщики ряда белков, участвующих в ПКС. Дыхательная цепь митохондрий животных является одним из источников АФК, вызывающих клеточную гибель. АФК у растений образуются в электронтранспортных цепях хлоропластов и митохондрий, NADPH-оксидазой плазматической мембраны клеток и апопластной пероксидазой.
Принятные сокращения: АФК - активные формы кислорода; ГО - гиперчувствительный ответ; ДНФ - 2,4-динитрофенол; ДХФ - 2,4-дихлорфенол; ПК - пальмитиновая кислота; ПКС - программируемая клеточная смерть; ПХФ - пентахлорфенол; СК - салициловая кислота; УК - устьичные клетки; ХКФ - .-хлоркарбонилцианидфенилгидразон; ЭК - эпидермальные клетки; Ci2TPP+ - додецилтрифенилфосфоний; DCF - 2',7'-дихлорфлуоресцеин;
DCFH - 2',7'-дихлорфлуоресцин; DPI - дифенилениодоний; PCB- - фенилдикарбаундекаборан; SkQi - 10-(6'-пластохинонил) децилтрифенилфосфоний; SkQRi - 10-(пластохинонил)децилродамин 19; TB- - тетрафенилбор; TMRE+ - этиловый эфир тетраметилродамина; TPP+ - тетрафенилфосфоний; Ay - трансмембранная разность электрических потенциалов.
Перспективно исследование влияния митохондриально-направленных антиоксидантов-катионов, способных накапливаться в клетках и митохондриях в соответствии с мембранным потенциалом, который генерируется на цитоплазматической и митохондриальной мембранах (знак «минус» - на внутренней стороне). Их концентрация в митохондриях может увеличиваться на несколько порядков. Это позволяет их использовать в низких концентрациях, которые не являются токсичными. Первый антиоксидант такого типа - MitoQ (Murphy et al., 2007). Это убихинон, связанный с катионом децилтрифенилфосфония. Он может восстанавливаться компонетами дыхательной цепи и проявлять таким образом многократное действие. В.П.Скулачев предложил заменить убихинон в составе липофильного антиоксиданта на пластохинон, более сильный антиоксидант. Полученные производные пластохинона получили название SkQ, где Sk - проникающий катион, связанный через декановый или пентановый линкер с Q - пластохиноном (Скулачев, 2007). Митохондриально-направленные липофильные антиоксиданты позволяют исследовать образование АФК в митохондриях и их участие в гибели клеток. Цель и задачи исследования
Цель работы - исследовать роль дыхательной цепи митохондрий, NADPH- оксидазы плазматической мембраны и апопластной пероксидазы в образовании АФК в ПКС у растений. Были поставлены и решены следующие задачи:
-
Исследовать защитное действие хинона, ковалентно связанного с проникающими через мембраны митохондриально-направленными катионами (SkQ), на ПКС у растений, вызванную хитозаном и цианидом.
-
Выяснить действие катионов тетрафенилфосфония (ТРР), додецилтрифенилфосфония (Ci2TPP+) и этилового эфира тетраметилродамина (TMRE+), входящих в состав синтетических хинонов SkQ, на ПКС у растений. Сравнить действие катионов с действием проникающих анионов тетрафенилбора (TB) и фенилдикарбаундекаборана (PCB-).
-
Используя ингибиторы флавиновых ферментов (хинакрин и дифенилениодоний), исследовать роль NADPH-оксидазы в ПКС.
4. Исследовать действие фенольных соединений, субстратов апопластной пероксидазы, на ПКС у растений. Сопоставить действие фенольных соединений и протонофорных разобщителей окислительного фосфорилирования. Научная новизна
Митохондриально направленный синтетический проникающий хинон SkQl предотвращает программируемую гибель клеток растений индуцированную CN- или хитозаном. Проникающие катионы ТРР+, C12TPP+ и TMRE , входящие в состав митохондриально-направленных липофильных антиоксидантов SkQ, в фемто- и пикомолярных концентрациях предотвращали хитозан-индуцированное разрушение ядер в эпидермальных клетках эпидермиса из листьев гороха. Выявлено защитное действие проникающих анионов TB- и PCB-, предотвращающих хитозан- индуцированное разрушение ядер клеток. Их эфективность ниже, чем у проникающих катионов. Установлено, что ингибиторы флавиновых ферментов хинакрин и дифенилениодоний (DPI) предотвращают хитозан- и CN-индуцированное разрушение ядер клеток растений. В тех же концентрациях они не оказывали влияние на дыхание и фотосинтетическое выделение О2 нарезками листьев. Эти данные свидетельствовуют о NADPH-оксидазе плазматической мембраны в качестве источника АФК для ПКС у растений. Фенольные соединения, которые являются регенерируемыми субстратами пероксидазы, оказывают защитный эффект при хитозан-индуцированной клеточной гибели. Сходным действием обладают фенольные разобщители окислительного фосфорилирования. Практическое значение работы
Полученные данные расширяют представления об участии митохондрий, NADPH-оксидазы плазматической мембраны, апопластной пероксидазы и АФК в программируемой гибели клеток растений, действии митохондриально-направленных антиоксидантов. Результаты могут быть использованы в курсах лекций и практикумах по клеточной биологии, цитологии, биоэнергетике, физиологии растений и биохимии. Поскольку ПКС играет важную роль в фитоиммунитете, полученные данные могут в перспективе использоваться для создания новых сортов сельскохозяйственных растений, обладающих повышенной устойчивостью к патогенам.
Апробация работы и публикации
Диссертация апробирована и рекомендована к защите на заседании кафедр иммунологии и физиологии растений биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова в 2012 г. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), международной конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005), международной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2005), международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006), международной 14-ой Европейской биоэнергетической конференции (Москва, 2006), международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), IV съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008). По материалам диссертации опубликованы 6 работ в журналах, входящих в список ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Современные представления о гибели клеток
У всех живых существ существует физиологический процесс саморазрушения клеток, который относится к локальной приобретенной усточивости (Agrios, 2004). Он играет важную роль в реализации онтогенетической программы, иммунных реакций на инфекционных возбудителей, поддержании гомеостаза, реакции на стрессовые воздействия. Саморазрушение клеток осуществляется по программе, которая требует АТФ (Shimamoto et al., 1999) и генетического контроля (Greenberg, 1996).
Термин «апоптоз» ввел Гиппократ (в переводе с греческого он означает опадание или отмирание листьев («апис» — лист, «птозис» -опадание) (Ванюшин, 2001). Сейчас под апоптозом понимают одну из форм ПКС. Первым исследователем апоптоза считается Вирхов, который в 1859 г. описал смерть клеток. С появлением возможности гистологического окрашивания препаратов Флеминг в 1895 г. более детально описал этот процесс (он выявил распад клеток на апоптозные везикулы). Многие термины, связанные с апоптозом, такие как автолиз, берут начало из исследований Вейгерта. Его работа была первым целенаправленным изучением апоптоза. В 1950 г. Глуксман сделал детальное морфологическое описание смерти эмбриональных клеток. До него описывали гибель клеток в тканях только взрослых особей. Глуксман предложил термин «программируемая клеточная смерть» (ПКС), показывающий, что она запрограммирована в развитии животных. Он полагал, что ПКС имеет принципиальные отличия от клеточной гибели у взрослых особей. Но современные исследования показали ошибочность этих представлений (Новожилова и др., 1996).
Другая важная работа - это работа Керра и др. (Kerr et al., 1972). В ней приводятся данные о существовании двух форм смерти клеток: апоптоза и некроза.
Нужно также отметить работу Ван Дорна и др. (van Doom et al., 2011), где авторы предлагают новую классификацию программируемой клеточной гибели у растений основанной на морфологических критериях. Авторы выделяют два типа ПКС: вакуолярная клеточная смерть (ВКС) и некроз. В процессе ВКС все клеточное содержимое уничтожается в процессе подобном автофагии с участием гидролазы из разрушенных литических вакуолей. Некроз авторы характеризуют по разрывам плазматической мембраны, сжатию протопласта и отсутствию признаков ВКС. ВКС по предположению авторов, типичный процесс при образовании или уничтожении тканей растения, когда некроз обычно наблюдается при абиотическом стрессе. Сами авторы признают, что некоторые примеры ПКС растений не подходят под эту классификацию и должны быть описаны отдельно. Так, например, ПКС при ГО на патоген при которой наблюдаются признаки обоих форм. В традиционной классификации описаны четыре разных морфологических типа клеточной смерти: апоптоз, автофагия, автолиз и некроз.
Апоптоз у животных сопровождается уменьшением объема клетки, появлением пузырьковидных выростов плазматической мембраны, уплотнением и маргинацией ядерного хроматина, межнуклеосомными разрывами ядерной ДНК и последующей фрагментацией ядер (Clarke, 2002; van Doorm, 2011). Наблюдается характерная картина деградации ядерного хроматина: ДНК разрезается специфической эндонуклеазой между нуклеосомами (Nagata, 2000; Nagata et al., 2003). Происходит фрагментация клетки на мембранные везикулы с внутриклеточным содержимым. Для апоптоза характерно участие каспаз, эволюционно закрепленного семейства цистеиновых протеаз, катализирующих расщепление белков после остатков аспартата.
Автофагия - это другой путь ПКС, который представляет собой деградацию части клеточных структур с участием гидролитических ферментов лизосом (у животных) или вакуолей (у грибов и растений). Этот процесс развивается, когда возникает опасная для клетки дисфункция органелл, например, повышенная генерация АФК или при недостатке питания (Klionsky and Emr, 2000; Levine and Kroemer, 2008; Singh and Cuervo, 2011). При этом на начальных этапах клетка элиминирует лишь часть собственных органелл, используя автофагию как средство для выживания. В ходе автофагии часть цитоплазмы изолируется мембранными пузырьками, называемыми автофагосомами. Мембрана образуется из участков эндоплазматического ретикулума, не содержащих рибосом (Dunn, 1990). Нередко в автофагосомах обнаруживаются митохондрии, хлоропласты и рибосомы. Автофагосомы в конечном счете сливаются с лизосомами, образуя таким образом автофаголизосомы, в которых происходит расщепление их полимерного содержимого до мономеров, которые клетка затем может использовать вторично (Yoshimori et al., 1991).
У дрожжей Saccharomyces cerevisiae имеются гены автофагии A TG -от gutpphagy-related gen (Reggiori and Klionsky, 2002; Klionsky et al., 2003). Многие белки Atg участвуют в формировании автофагосом. Автофагия в клетках растений осуществляется с участием вакуолей (Marty, 1999; Fukuda, 2000; Lam, 2004). При этом вакуоли поглощают участки цитоплазмы и органеллы - митохондрии и хлоропласты, что может привести к гибели клетки.
Метаболические нарушения, связанные с голоданием, исчерпанием факторов роста и гипоксией, как правило являются причиной автофагии как активного катаболического механизма. Разрушение отдельных участков цитоплазмы дает свободные амино- и жирные кислоты, которые могут вторично использоваться клеткой. Высвобождаемые аминокислоты используются для синтеза белков de novo, необходимых для адаптации к стрессу. Молекулярное обоснование функции вторичного использования субстратов при автофагии было получено с идентификацией белка Atg22 у дрожжей (Mizushima and Klionsky, 2007).
Существуют ингибиторы автофагии. К ним относится 3-метиладенин, действующий на фосфатидилинозитол-3-киназу, участвующую в формировании автофагосом (Blommaart et al., 1997; Takatsuka et al., 2004; Levine and Kroemer, 2008).
Автолиз клеток, часто наблюдаемый у микроорганизмов, вероятно, является результатом массированной автофагии (Самуилов, 2005).
Важная роль автофагии заключается в защите от инфекции и воспаления (Mihalache, Simon, 2012). Ксенофагия предназначена для удаления внутриклеточных бактерий, проникших извне; бактерий и паразитов, которые пребывают в цитозоле, фагосомах, а также вновь образованных вирионов во время их выхода в цитоплазму (Levine and Deretic, 2007; Huang and Klionsky, 2007). Это говорит о пластичности автофагии, которая может быть адаптирована к элиминированию микробов, превосходящих по размеру органеллы.
Автолиз - ферментативное саморазрушение клеточного содержимого, происходящее до или после клеточной гибели. Этот путь характерен для микроорганизмов (Самуилов и др., 2000 Б). При реализации автолиза происходит разрушение мембран клетки с последующим высвобождением гидролитических ферментов, и затем накопление продуктов деградации в среде (Alexandre et al., 2001; Pillidge et al., 2002). Автолиз, возможно, является механизмом программируемой гибели бактериальных клеток (Самуилов и др., 2000 Б; Lewis, 2000; Гордеева и др., 2004) и грибов (White et al., 2002). При автолизе происходит распад клеточных компонентов, нарушение проницаемости плазматической мембраны и таким образом выброс продуктов деградации клетки во внешнюю среду. При действии антибиотиков (пенициллина, ванкомицина) происходит индукция автолиза у бактерий. Показано, что некоторые гидролазы муреина (основного компонента клеточной стенки грамположительных бактерий), к которым относятся амидазы, эндопептидазы, карбоксипептидазы и литические трансгликозилазы (Koraimann, 2003), принимают участие в автолизе клеток бактерий. Такие ферменты были названы автолизинами. У грамотрицательной Escherichia coli основные автолизины — 3 трансгликозилазы и 3 эндопептидазы. Активация этих ферментов ведет к автолизу. При снижении активности муреиновых гидролаз апоптоз, индуцированный пенициллином, предотвращается (Holtje, 1995; Rice and Bayles, 2003).
Формы и структура NADPH-оксидаз
NADPH-оксидазы животных структурно подразделяются на три группы (рис. 3): 1) NOX 1-4 - трансмембранные белки, гомологичные белку gp91p ох (glycoprotein with molecular mass 91. kDa of phagocytic oxidase) NOX 2, который на цитоплазматической поверхности связывает NADPH и FAD, в трансмембранной части содержит два гема цитохрома Ь55Я, расположенные во внутреннем и наружном монослоях мембраны, а на наружной поверхности образует 02 , 2) NOX 5 - белок, гомологичный gp91phox, содержащий на цитоплазматической поверхности кальмодулин-подобный домен с четырьмя участками связывания Са + (EF-участками); NADPH-оксидаза 5 у человека регулируется кальмодулином (Tirone, Сох, 2007), 3) DUOX (dual oxidases) - двойные оксидазы, составленные из домена, гомологичного NADPH-оксидазе 5 с двумя EF-участками связывания Са"+, и пероксидазного домена на наружной поверхности мембраны клетки (Lambeth, 2004; Sumimoto, 2008). Оксидазы, подобные DUOX, возможно, имеются и у растений (Papadakis и Roubelakis-Angelakis, 1999).
NOX. У фагоцитов (гранулоцитов и макрофагов) ферментный комплекс NOX состоит из двух цитозольных компонентов p47phox и р67р1юх, трансмембранного гликопротеина gp91p ох, флавоцитохрома bi58 и двух GTP-связывающих белков Rac (Lambeth, 2004; Cross and Segal, 2004; Segal, 2008; Nauseef, 2008).
Флавоцитохром 6558 - мембранный гетеродимерный белок, состоящий из трансмембранного белка p22phox и трансмембранного гликопротеина gp91phox. Цитозольный NADPH окисляется FAD. Затем FADFL. окисляется двухгемовым цитохромом 6558, восстанавливающим 02 до Ог на внешней поверхности плазматической мембраны. Гемовые группы имеют разный окислительно-восстановительный потенциал. Рассмотрим свойства белковых компонентов NOX фагоцитов.
р22р ох - мембранный белок, пересекающий мембрану два (возможно, и четыре) раза. Цитоплазматический гидрофильный С-конец содержит богатый пролином домен - место связывания p47phox с флавоцитохромом bs58- Вероятно, p22phox имеет только одну функцию - предоставлять высокоаффинные участки связывания для цитозольных субъединиц NADPH-оксид азы.
После обнаружения p47phox и p67phox стало понятно, что их недостаточно для активации оксидазы. RAC1 — внутриклеточный белок из суперсемейства GTPa3, относится к «малым» G-белкам. RAC2 — GDP-зависимый фактор, включающий оксидазную активность и действующий совместно с р67р1юх и p47phox. Белки RAC могут находиться в двух состояниях: активном, связанном с GTP, и неактивном, связанном с GDP. В активной форме они взаимодействуют с рядом эффекторных белков в клетке, что ведет к регуляции различных клеточных процессов (Beckers et al., 2010; Sawada et al., 2010).
p67Phox (NOXA). Подобно другим цитозольным phox-белкам, p67phox богат мотивами, участвующими в белок-белковых взаимодействиях. p67phox связывается с p40phox и RAC. Компонент p67phox необходим для электронного транспорта через флавоцитохром и поэтому был назван NOXA (NOX Activator).
p47phox (N0x02) _ белок, подвергающийся фосфорилированию при активации нейтрофилов. Он содержит ряд доменов и по меньшей мере один богатый пролином мотив. Этот белок стабилизирует и организует оксидазный комплекс и поэтому назван NOXO (NOX Organizer). При внедрении патогена р47рЬох фосфорилируется, затем вместе с белком p67phox мигрирует к плазмалемме и образует активный комплекс фермента (Тарчевский, 2002).
p40phox - белок гомологичный Р47рЬох. Возможно, этот белок действует как переносчик р67р ох на мембрану вакуоли фагоцита.
При активации NADPH-оксидазы компоненты, находящиеся в цитозоле, транслоцируются к плазматической мембране и формируют активный комплекс фермента (рис. 4) (Sumimoto, 2008). Величина Кт для NADPH составляет 25—35 мкМ в плазматической мембране нейтрофилов и немного ниже для изолированного флавоцитохрома b558 (Cross, Segal, 2004). Неактивный комплекс Активный комплекс
Слева - компоненты NADPH-оксидазы в состоянии покоя, справа -активный комплекс. При образовании активного комплекса p47ph0 фосфорилируется по остаткам серина, близким к С-терминальному концу. В белке Rac GDP обменивается на GTP при участии фактора GEF (guanin nucleotide exchange factor - фактор обмена гуаниновых нуклеотидов) связанного с мембраной, и GDI (GDP dissociation inhibitor - ингибитор диссоциации GDP). Белок Rho-GDI - негативный регулятор белка GDI поддерживает Rho/Rac в неактивном состоянии, формируя комплекс с GDP (по Cascales Angosto, 2005; Sumimoto, 2008).
NADPH-Оксидаза играет важную роль в иммунитете. Мутация NADPH-оксидазы фагоцитов, ведущая к потере ее функции, вызывает у человека хронический грануломатоз, характеризующийся длительными и периодическими инфекциями (Torres and Dangl, 2005). NADPH-Оксидаза в кровяных сосудах является основным источником АФК, которые участвуют в сигнальных каскадах (Li, 2001; Dusting, 2005). NADPH-Оксидаза может участвовать в чувствительных к кислороду процессах, лежащих в основе сужения кровеносных сосудов легких при гипоксии из-за нарушения энергозависимых процессов, вызванных подавлением образования АТФ и последующим энергодефицитом, пролиферацией клеток гладкомышечной мускулатуры, действием сонной артерии и хеморецептора дыхательных путей, генной экспрессией эритропоэтина (Jones, 2000).
DUOX - двойные оксидазы, обладающие 02" -образующей и пероксидазной активностью. Они были обнаружены у животных в клетках щитовидной железы и слизистой трахей и бронхов. Обладают пероксидазной активностью и имеют, помимо субъединицы, гомологичной NOX 2, специфический домен, который содержит участки связывания Са2+ и активируется Са2+ (Lambeth, 2004; Ameziane-El-Hassani et al., 2005).
Доменом, гомологичным gp91ph0\ DUOX образует 02 , который быстро превращается в Н2О2 в супероксиддисмутазной реакции (Ameziane-El-Hassani et al., 2005; Sumimoto, 2008). У человека DUOX играет роль в биосинтезе тиреоидных гормонов, недостаток которых ведет к гипотиреоидизму (Leto and Geiszt, 2006).
Ферменты защиты от АФК - супероксиддисмутаза (СОД), пероксидазы и каталаза - имеются у прокариот, NOX/DUOX появляется в эволюции позже. NADPH-оксидаза 3 является эволюционно наиболее древней. Регулируемые Са2+, содержащие EF-участки NADPH-оксидазы появляются очень рано в эволюции эукариот. Физиологическая роль NOX 2 и DUOX состоит в реализации врожденного иммунитета и кроме того DUOX принимает участие в биосинтезе гормонов щитовидной железы (Kawahara, 2007).
Rboh. У растений обнаружены гомологи NADPH-оксидаз, известные под аббревиатурой Rboh (respiratory burst oxidase homologue). Rboh обнаружена у риса, резуховидки Таля, картофеля и других растений (Doke, 2003; Groom et al., 1996; Kanafy et al., 2001; Sagi and Fluhr, 2001; Torres et al., 1998; Yoshioka et al., 2003). У A. thaliana - 10 изоформ Rboh (Keller et al., 1998). У растений найдены только гомологи gp91phox и один цитозольный GTP-зависимый регулятор (Torres et al., 2002; Torres, Dangl, 2005). Впервые вклад гомолога gp91phox в продукцию АФК был обнаружен в клетках табака (Simon-Plas, 2002). Другие компоненты NADPH-оксидазного комплекса P22phox, p40phox, p47phox и p67phox не обнаружены в геноме резуховидки Таля (Dangl, Jones, 2001), однако по некоторым данным в цитоплазме присутствуют белковые компоненты, подобные p67phox и р47р1юх животных, которые при узнавании клеткой патогенного гриба перемещаются к плазмалемме (Xing et al., 1997).
АФК, образованные Rboh, играют важную роль в фитоиммунитете (Bedard et al., 2007; Sumimoto, 2008; Marino et al, 2012). H202 усиливал CN -индуцированный ПКС УК в эпидермисе листьев гороха, еще большее действие оказывало добавление Н2О2 и NADH — субстратов пероксидазы клеточной стенки растений (Самуилов и др., 2008). По-видимому, NADPH-оксидаза плазматической мембраны является источником АФК для реализации С№-индуцированной клеточной смерти УК гороха (Самуилов и др., 2006; Самуилов и др., 2008).
Предполагается, что Rboh имеет шесть трансмембранных доменов, соответствующих таковым у gp91phox, и содержит на N-терминальном конце два EF-участка, связывающих Са2+ (рис. 3) (Kobayashi et al., 2007). Ингибиторы NADPH-оксидазы клеток животных хинакрин и DPI также были эффективны на клетках растений (Van Gestelen et al., 1997).
Действие проникающих ионов на ПКС
Проникающие катионы тетрафенилфосфония (ТРР+), додецилтрифенилфосфония (СігТРР+) и этиловый эфир тетраметилродамина (TMRE), накапливаясь в митохондриях по градиенту Д\/, могут снижать его величину и таким образом влиять на образование АФК.
Образование АФК в митохондриях зависит от мембранного потенциала, его уменьшение на 10-15% снижает скорость образования АФК в 10 раз (Korshunov et al., 1997). На рис. 12 додецилтрифенилфосфоний (С ТРР ) в низких концентрациях подавляет образование АФК, регистрируемое по флуоресценции дихлорфлуоресцеина (DCF). На рис. 13, а показано, что, подобно DTPP -производным хинонов (Васильев и др., 2011), С)2ТРР+ предотвращает хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК. Его защитное действие максимально при 10"1 —10" Ми снижается при дальнейшем увеличении концентрации. Разрушение ядер ЭК предотвращалось также катионами тетрафенилфосфония (ТРР+) и этилового эфира тетраметилродамина (TMRE4}, защита была максимальна соответственно при 10 -10" и 10" -10" М и снималась при 10 М (рис. 13, б, в).
Ингибитор флавиновых ферментов дифенилениодоний (DPI+) также является одновалентным катионом, однако в концентрациях ниже 10" М он не влияет на хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК, а в концентрации выше 10 7 М подавляет его (рис. 13, г), возможно, как ингибитор NADPH-оксидазы плазматической мембраны (Van Gestelen et al., 1997; Papadakis and Roubelakis-Angelakis, 1999; Frahry and Schopfer, 2001; Dat et al., 2003; Васильев и др., 2009). Испытано действие DPI и хинакрина на дыхание, фотосинтетическое выделение СЬ и разрушение ядер УК и ЭК вызванное СК и хитозаном. Хинакрин, как и DPI является ингибитором флавиновых ферментов (Van Gestelen et al., 1997).
DPI не влияет на дыхание и фотосинтетическое выделение 02 НЛ гороха в концентрации до 100-200 мкМ (рис. 14, а, б), но в концентрации 50-100 мкМ предотвращает С1М -индуцированное разрушение ядер УК и хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК в пленках эпидермиса листьев в темноте и на свету (рис. 14, в-д).
Хинакрин не влияет на поглощение Ог в концентрации меньше 1 мМ, а в концентрации меньше 0,1 мМ - на фотосинтетическое выделение СЬ нарезками листьев. В более высоких концентрациях хинакрин вызывает торможение дыхания в темноте и выделения 02 на свету (рис. 15, а, б). В концентрации 10-50 мкМ хинакрин подавляет разрушение ядер, вызванное CN и хитозаном (рис. 15, в-г).
Рис. 16, а демонстирует Н202-зависимое образование флоуресцирующего DCF в пленках эпидермиса. Каталаза подавляла и предотвращала Н202-зависимое увеличение флуоресценции DCF. Менадион, как и Н202, вызывает рост флуоресценции DCF (рис. 16, б, в). Индуцированный менадионом рост флуоресценции DCF подавляется нитросиним тетразолием - НСТ (рис. 16, в), окисляющим 02 (Auclair and Voisin, 1985) и таким образом предотвращающим образование Н202. Хинакрин подавляет и предотвращает Н202- и менадион индуцированный ответ DCF (рис. 16, г-ё), зависимый от Н202.
Действие Са +
Наряду с ТРР+, Ci2TPP+ и TMRE, широком диапазоне концентраций испытанны катионы Са2+, регулирующие многие клеточные процессы. Они не оказывают защитного действия от хитозана, хотя подавляют разрушение ядер ЭК при 0,1-1 мМ (рис. 17). В отсутствие хитозана Са + не оказывал влияния на ядра ЭК.
Действие Ag+
В соответствии с данными, полученными ранее в нашей группе, CN" вызывает разрушение клеточных ядер растений в аэробных условиях, предотвращаемое в анаэробных условиях (рис. 18). AgNC 3, сам по себе не влияющий на состояние ядер УК в пленках эпидермиса из листьев гороха, значительно стимулирует Сг4 -индуцированное разрушение ядер УК в аэробных и индуцирует его в анаэробных условиях. Процесс специфичен к Ag+ и не происходит при замене AgN03 на NaN03 (рис. 19).
Обсуждение результатов
Цианид и хитозан
Некоторые растения могут образовывать CN-: синтезировать цианогенные гликозиды (амигдалин, прунасин и их изомеры: неоамигдалин, самбунигирин) в качестве защитных метаболитов от патогенных возбудителей и токсинов для травоядных животных (Banea-Mayaambu et al., 2000; Vetter, 2000). Ферментативный гидролиз этих соединений приводит к высвобождению HCN. Растений, содержащих цианогенные гликозиды, насчитывают около 2500 видов (Vetter, 2000). В основном это растения семейств Fabaceae, Rosacaea, Linaceae, Compositae и др. Цианогенные гликозиды содержатся в семенах яблок, персиков, миндаля, вишни (Campa et al., 2000). Большое сельскохозяйственное значение в тропических странах имеет цианогенное растение маниок Maniot esculenta (Vetter, 2000).
CN нарушает метаболизм клетки: ингибирует гемовую каталазу и пероксидазы (рис. 8), митохондриальную цитохром с-оксидазу и хлоропластную Рубиско (рис. 7). CN вызывает ПКС у растений с признаками апоптоза (Самуилов и др., 2000; Бакеева и др., 2005; Дзюбинская и др., 2006): межнуклеосомной фрагментацией ДНК, фрагментацией ядер, характерными цитостоструктурными изменениями.
Другие соединения, вызывающие ПКС, — элиситоры, сигнальные соединения патогенов. Их специфическое распознавание приводит к морфофизиологическим перестройкам и гибели клеток. В качестве элиситора, индуктора гиперчувствительного ответа, моделирующего взаимодействие клеток растения с патогенами грибов, мы использовали хитозан - продукт гидролиза хитина, компонента клеточной стенки грибов (Tada et al, 2001; Iriti et al., 2006). В плазматической мембране клеток у различных растений содержится рецептор, который с высоким сродством связывает хитиновые олигосахариды (Day et al., 2001; Okada et al., 2002). Этот рецептор представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 75 кДа. Нокдаун рецепторного белка приводит к подавлению хитозан-индуцированного образования Н202 (Katu et al., 2006).
Защитное действие SkQ и проникающих ионов от разрушения клеточных ядер, вызванного хитозаном
Испытанные катионные производные хинонов по эффективности предотвращения ПКС (рис. 11) были гораздо более активны в сравнении с известными ранее соединениями. Концентрации для полумаксимального подавления ПКС этими соединениями лежали в нано- и пикомолярном интервале. SkQl (производное пластохинона) вызывал торможение ПКС, вызванной хитозаном.
Катионы, способные проникать через мембраны, вызывают деэнергизацию митохондрий, генерирующих A\\i со знаком «минус» внутри, но не влияли на субмитохондриальные частицы, в которых Ді/ генерируется со знаком «плюс» внутри. Напротив, проникающие анионы деэнергизуют субмитохондриальные частицы, но не митохондрии (Grinius et al., 1970; Bakeeva et al., 1970).
Ранее показано, что генерация 02 в дыхательной цепи митохондрий у животных зависит от Д\у (Скулачев, 2009). При ПКС, индуцированной АФК, часто происходит увеличение Ду (Banki et al., 1999; Nagy et al., 2003). Также справедливо и обратное. Небольшое снижение Аці ведет к уменьшению генерации АФК митохондриями.
Ингибирование хитозан-индуцированного разрушения ядер ЭК катионами ТРР+, Сі2ТРР+ и TMRE+ (рис. 13), вероятно, обусловлено снижением Аці в митохондриях и, как следствие, подавлением генерации АФК (рис. 12). Н+-АТРаза плазматической мембраны клеток растений генерирует Ду (со знаком «минус» внутри), величина которой может превышать 200 мВ (Hirsch et al., 1998; Fischer, 2000; Sondergaard et al., 2004). Такое значение Ai/ на плазматической мембране по уравнению Нернста приведет к более, чем 10 -кратному накоплению проникающих катионов в цитоплазме. При величине Дц/ на митохондриальной мембране в 180 мВ градиент концентрации проникающих катионов в митохондриях относительно цитоплазмы составит 103, а относительно среды инкубации клеток превысит 10 . Надо учитывать также и коэффициенты распределения гидрофобных катионов между водной средой и липидной фазой мембран. Эти коэффициенты могут быть больше 104. В итоге, концентрация катионов, накапливающихся в клетках и митохондриях, составит 1010.
Проникающие катионы с анионами жирных кислот обладают высокой протонофорной активностью (Severin et al., 2010). Жирная кислота в комбинации с СігТРР+ значительно подавляет хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК, проникающие анионы оказывают разобщающее действие, транспортируясь через мембраны совместно с NH4+ (рис. 24). Так, защитное действие ТВ" на хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК усиливается при добавке NH4C1 (рис. 25). Не вызывает сомнений, что в нормальных клетках эпидермиса, изолированного из листьев, присутствуют эндогенные жирные кислоты и NH4+, вследствие чего защитное действие проникающих катионов и анионов может проявляется и без их добавления (рис. 13, 22).
Подавление хитозан-индуцированного разрушения ядер ЭК с увеличением концентрации Са (рис. 17), связано, по-видимому, с нарушением барьерной функции плазматической мембраны клеток. Са2+ как активатор NADPH-оксидазы усиливает образование АФК и тем самым стимулирует ПКС (Киселевский и др., 2009).
Ранее было показано, что CNT-индуцированное разрушение ядер УК зависит от комбинированного действия АФК и восстановленных хинонов ЭТЦ митохондрий или хлоропластов, которые, вероятно, вызывают активацию протеинкиназ и последующее включение ПКС (Самуилов и др., 2002). Можно предположить, что при ПКС УК, индуцированной CN вместе с Ag+, Ag+ выполняет роль акцептора электронов. Известно, что Ag+ восстанавливается альдегидами, спиртами, сахарами, соли серебра окрашивают белки и РНК. Ag+, по-видимому, может служить акцептором электронов для NADPH-оксидазы плазматической мембраны, который конкурирует с СЬ за взаимодействие с NADPH-оксидазой. Ag+, подобно хинакрину, подавляет хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК (рис. 21). Хитозан-индуциро ванная гибель ЭК реализуется АФК, образованными NADPH-оксидазой плазматической мембраны (Васильев и др., 2009).
Защитное действие проникающих катионов и разобщителей снималось при увеличении их концентрации. Эти соединения, во-первых, могут оказывать детергентное действие в повышенных концентрациях, которое приводит к нарушению липидного бислоя мембран. Во-вторых, может происходить подавление окислительного фосфорилирования в митохондриях, которое приводит к включению программы гибели клеток по пути некроза (Izyumov et al., 2004; Skulachev, 2006). Подавление синтеза АТФ в митохондриях может быть связано не только с детергентным действием испытанных соединений, но и вытеснением хинонных компонентов дыхательной цепи митохондрий с мест их локализации в мембранах. Например, DCMU и фенольные гербициды (бромоксинил, иоксинил), вытесняя вторичный пластохинон QB из фотосинтетической цепи переноса электронов в хлоропластах и вызывая изменение величины Е0 первичного пластохинона QA, блокируют перенос электронов в фотосистеме II (Rutherford, Krieger-Liszkay, 2001). Защитное действие разобщителей и фенольных соединений от разрушения ядер, вызванного хитозаном
Как уже отмечалось, образование АФК в митохондриях зависит от мембранного потенциала, его уменьшение на 10-15% снижает скорость образования АФК в 10 раз (Korshunov et al., 1997). Разобщители окислительного фосфорилирования, будучи переносчиками Н+ через мембраны, подавляют образование Д\/ и АФК в митохондриях (Skulachev etal., 1967; Korshunov et al., 1997).
Разобщители-протонофоры ХКФ, ПХФ и ДНФ предотвращали хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК (рис. 27). Образование Н202, которое регистрировали по флуоресценции DCF, ингибировалось ХКФ в митохондриях УК (рис. 26). Это соответствует данным, полученными на митохондриях животных (Korshunov et al., 1997; Vinogradov, Grivennikova, 2005). В освещенных хлоропластах УК ХКФ вызывал генерацию Н202 (Васильев и др., 2009). Остановка синтеза АТФ в присутствии ХКФ подавляет окисление NADPH в реакциях зависимого от АТФ восстановления С02 в хлоропластах. Дефицит NADP+ в хлоропластах ведет к восстановлению компонентов фотосинтетической ЭТЦ и к образованию 02 в фотосистеме I и затем к последующему образованию Н202. Аналогичный эффект наблюдался при воздействии CN , инактивирующего Рубиско (Ishida et al., 1998).
