Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Кислород - двуликий Янус 19
1.1.1. Активные формы кислорода: образование и биохимические свойства 23
1.1.2. Токсическое действие АФК: Окислительное повреждение макромолекул 30
1.1.2.1. Перекисное окисление липидов 31
1.1.2.2. Окислительное повреждение нуклеиновых кислот 33
1.1.2.3. Окислительное повреждение белков 35
1.1.3. Регуляторные эффекты АФК 36
1.2. Окислительный взрыв в растительных клетках 42
1.2.1. Источники АФК в растительных клетках 45
1.2.1.1. Редокс системы плазмалеммы 49
1.2.1.1.1. Цитохромы 6-типа в плазматической мембране 54
1.2.1.1.2. НАДФ-Н -утилизирующие флавоферменты плазматической мембраны растений 56
1.2.1.2. Пероксидаза как стрессовый фермент 61
1.2.1.2.1. Продукция АФК экстраклеточными пероксидазами 64
1.2.1.2.2. Физиологические функции экстраклеточных пероксидаз при окислительном стрессе 69
1.2.1.2.3. Каталаза-подобная активность пероксидаз 71
1.3. Патоген-индуцированный стресс в клетках растений 78
1.4. Обезвоживание клеток высших и низших растений 86
1.5. Раневой стресс в клетках растений 100
1.6. Роль АФК в системе сигнальной трансдукции: связь с ионной проницаемостью плазмалеммы и энергетическим обменом растительных клеток 112
1.6.1. АФК и проницаемость мембран для Са2+, К+, Н* 113
1.6.2. Термогенез. Энергетические потери клетки как составляющая часть энергетического баланса 122
2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования 127
2.2. Методы исследования 129
3. Результаты исследования и обсуждение
3.1. Патоген-индуцированный окислительный взрыв в растительных клетках 140
3.1.1. Трех-компонентная система патоген-индуцированного окислительного взрыва в суспензионной культуре клеток фасоли 141
3.1.2. Сигнальные события при патоген-индуцированном окислительном взрыве в клетках фасоли 151
3.1.3. Окислительный взрыв в клетках хлореллы при инфицировании микоплазмой Acholeplasma laidlawii 162
3.2. Эффекты обезвоживания на продукцию АФК в клетках лишайников и бриофитов 166
3.2.1. Окислительный взрыв в клетках лишайников подотряда Peltigerineae, индуцированный обезвоживанием 167
3.2.2. Окислительный взрыв в клетках печеночника Dumortiera hirsuta, индуцированный обезвоживанием и регидратацией 181
3.2.3. Стехиометрия продукции АФК в тканях D. hirsuta 184
3.3 Продукция АФК в растительных клетках и тканях при раневом стрессе 187
3.3.1. Роль супероксидного радикала в стрессовых ответах корней пшеницы при раневом стрессе 188
3.3.2. Регуляция продукции и содержания 02"~ в корневых клетках при поранении 191
3.3.3. Возможные источники генерации супероксидного анион-радикала поверхностной мембраной растительных клеток 195
3.3.3.1. Вклад редокс-системы плазмалеммы в продукцию клетками корней пшеницы 196
3.3.3.2. Участие пероксидаз клеточной поверхности в продукции клетками корней пшеницы. Эксперименты in situ 201
3.3.4. Влияние салициловой и ряда других органических кислот на редокс-активность корней пшеницы 213
3.3.5. Выделение и очистка экстраклеточных пероксидаз клеток корней пшеницы 221
3.3.6. Происхождение и механизмы появления экстраклеточных пероксидаз при раневом стрессе 232
3.3.7. Ионная проницаемость плазмалеммы и АФК 251
3.3.8 Участие супероксидного анион-радикала в детоксикации ксенобиотиков растительными клетками 261
3.3.9 Вклад продукции АФК в тепловыделение растительными клетками 272
4. Заключение 277
Выводы 284
- Окислительный взрыв в растительных клетках
- Патоген-индуцированный стресс в клетках растений
- Методы исследования
- Эффекты обезвоживания на продукцию АФК в клетках лишайников и бриофитов
Введение к работе
Растения и животные постоянно испытывают на себе влияние экстремальных воздействий окружающей среды и различных антропогенных факторов. Способность к защите от действия неблагоприятных факторов среды (стрессоров) - столь же обязательное свойство любого организма, как питание, движение, размножение и другие. По словам Д.Н. Насонова, «центральным вопросом эволюции является адаптация, приспособление живого к среде» (цит. По Браун, Мозженок, 1987). В устойчивости растений к действию каждого из факторов внешней среды помимо специфических, зависящих от особенностей воздействия и вида растения, важную роль играют неспецифические реакции клетки, возникающие при действии любых неблагоприятных факторов. Стресс, как известно, - «это совокупность всех неспецифических изменений, возникающих под влиянием любых сильных воздействий и сопровождающихся перестройкой защитных систем организма» (Селье, 1972; Полевой, 1989). Hans Selye выделял три стадии генерализованного адаптационного синдрома: «реакцию тревоги», стадию резистентности и стадию истощения. «Реакция тревоги обозначает первоначальную, неспецифическую реакцию, представляющую собой соматическое выражение общего «призыва к оружию» защитных сил организма» (Селье, 1972). Необходимо отметить, что еще в 1901 г. Н.Е. Введенским была выдвинута гипотеза о всеобщей ответной реакции живых систем на клеточном уровне в ответ на раздражение (Введенский, 1901, цит. по Муртази, 1963). Видным физиологом животных и растений, многие годы работавшим в Казанском институте биологии, Фаридом Фатыховичем Муртази была доказана общность харатера неспецифических ответных реакций в клетках животных и растений (Муртази, 1963). Суть неспецифических реакций в значительной степени сводится к тем изменениям, которые обнаруживаются в мембранных образованиях клетки. Более того, найдена связь между устойчивостью растений к различным воздействиям и состоянием их мембранных компонентов (Чиркова, 2002).
Значительную роль в ответных реакциях на воздействия играют окислительные процессы, протекающие в живых организмах, в частности, свободнорадикальные реакции, связанные с участием кислородных радикалов.
Кислород играет ключевую роль в энергетике большинства живых существ. Он служит окислителем питательных веществ при дыхании животных, растений, грибов и бактерий. Без кислорода обходятся лишь сравнительно немногочисленные виды, обитающие в бескислородных (анаэробных) условиях и покрывающие свои энергетические потребности за счет брожения. Однако высокая окислительная способность кислорода, необходимая для его функционирования в дыхательной системе, из добра превращается в зло, если принять во внимание возможность «паразитных» химических реакций окисления кислородом различных химических веществ в живой клетке (Скулачев, 1996). Эти самопроизвольные, неферментативные реакции всегда начинаются с одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода, давая его анион-радикал, или супероксид (02 ). Предположение о том, что в живых клетках существуют механизмы, активирующие кислород, возникло еще в 19 в. Швейцарский химик Х.Ф. Шейнбайн, открывший озон, в 1845 г. выступил с теорией окислительных процессов, согласно которой в живых клетках имеются соединения, способные легко окисляться в присутствии О2 и таким образом активировать кислород. Именно эти процессы обуславливают быстрое потемнение поверхности растительных тканей, таких как ткани яблок, картофеля, плодовых тел грибов (цит. по Полевой, 1989).
Таким образом, кислород необходим для живой клетки как окислитель питательных веществ, однако опасен как окислитель ДНК и других жизненно важных компонентов. Клетка располагает многоуровневой системой защиты от повреждающего действия кислорода (Мерзляк, 1989, Веселов и др., 2002). Эта система состоит из механизмов: (1) предотвращающих «паразитные» химические реакции одноэлектронного восстановления кислорода и (2) убирающих продукты такого восстановления. Клетки, не справившиеся с задачей защиты от кислородной
опасности и, тем самым, поставившие под удар свой генетический аппарат, кончают самоубийством, включая апоптоз, вовлекающий активные формы кислорода (АФК).
С практической точки зрения, изучение роли активированного кислорода в клетках и тканях животных и человека оказалось исключительно плодотворным. В фокус этого направления попали такие фундаментальные медико-биологические проблемы как повреждение и устойчивость клетки, фагоцитоз, бактерицидные эффекты и др. Выяснилось, что активированный кислород выступает в роли важного патогенетического фактора при многих тяжелых заболеваниях: ишемической болезни сердца, лучевом поражении, катаракте, воспалительных процессах, авитаминозе, раке и т.д. Все это, естественно, привело к резкому нарастанию интереса к различным аспектам кислородной проблемы.
Таким образом, в потоке научной литературы, посвященной активированному кислороду, существует множество работ, выполненных на объектах животного происхождения. Еще до недавнего времени изучению этих процессов в растительных объектах уделялось недостаточно внимания, хотя роль активированного кислорода в мембранах растений огромна при самых разнообразных воздействиях (Мерзляк, 1989). Именно эти организмы способны к выделению кислорода, наиболее богаты пигментами-сенсибилизаторами, отличаются высокой реакционной способностью молекулярных компонентов и обладают развитой защитной системой. В настоящее время становится все более очевидным, что при действии на растения множества стрессовых факторов одна из самых ранних стрессовых реакций - это образование ряда активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала и т.д.), которые могут выполнять роль сигнальных молекул, а также другие функции в ходе адаптации клеток.
Постановка проблемы, ее актуальность
Чрезвычайно широкий спектр биохимических эффектов АФК, в частности супер оксидного радикала, объединяет все возрастающий интерес к влиянию их на функциональную активность клеток. Долгое время доминирующими в этой области были представления, что АФК действуют лишь как разрушители и не обладают никакими регуляторными свойствами (Пескин, 1997). Перекисное окисление липидов, окислительные модификации белков, нуклеиновых кислот -типичные следствия токсичного действия кислородных радикалов. Возникает вопрос: «Неужели на всем протяжении эволюции в живых системах не было создано достаточно плодотворного механизма, полностью предотвращающего образование АФК, которые обладают необычайно высокой «агрессивностью» и способны повреждать практически все компоненты клетки, включая белки, ферменты, ДНК и мембранные структуры»? Возможно, разгадка кроется в другом. В настоящее время получены сведения о том, что АФК выполняют регуляторные функции в организме и в некоторых случаях выступают в качестве сигнальных молекул (Мерзляк, 1999). Вероятно, физиологические концентрации АФК не только не токсичны, но и необходимы для поддержания функций клеток. В последние годы были выявлены регуляторные функции АФК, а именно участие в гормональном сигналлинге, росте, клеточном и тканевом развитии. Они могут контролировать такие важнейшие биологические процессы, как клеточное деление - митоз и программируемую клеточную смерть - апоптоз, играющие существенную роль в реализации программы индивидуального развития многоклеточных организмов (Шорнинг и др., 2000).
Важная роль отводится АФК в стрессовых ответах растительных клеток. В целом, в нормально функционирующем организме существует баланс между активацией и дезактивацией кислорода, поэтому содержание его активных форм поддерживается на безопасном уровне (Аверьянов, 1991). Баланс, однако, может сдвигаться в окислительную сторону при самых разнообразных патологических и стрессовых состояниях как животных, так и растительных клеток. Было показано, что при фагоцитозе чужеродных веществ резко увеличивается поглощение кислорода. Это явление, открытое еще в 30-е годы XX в., получило название «дыхательного (окислительного) взрыва» (Segal, Abo, 1993). Примечательно, что одним из первооткрывателей этого явления был ученый-медик Казанского университета Андрей Дмитриевич Адо (Ado, 1933, цит. по Владимирову, Шерстневу, 1989). Позднее оказалось, что образование супероксида (и других АФК) присуще не только фагоцитирующим клеткам, но происходит и в других типах клеток.
Особое внимание в настоящее время уделяется быстрой продукции АФК с последующим каскадом ответов (реакции окислительного взрыва) растительных клеток при воздействии биотических и абиотических стрессоров. Считается, что продукция 02 и пероксида водорода (Н202) является одной из ранних реакций, происходящих при патогенной атаке в растительных клетках (Bolwell et al., 1995; Alvarez et al., 1998). Показано, что окислительный взрыв может происходить в растительных клетках также при действии самых разнообразных абиотических стрессоров. Так, например, в развивающихся проростках кукурузы он индуцируется при действии низкой температуры (Prasad, 1996), в растениях гороха под влиянием засухи (Moran et al., 1994), в суспензионной культуре табака при гипоосмотическом и механическом воздействии (Cazale et al., 1998). Причем, как свидетельствуют экспериментальные данные, основными источниками 02 и Н202 в ходе окислительного взрыва являются ферментативные системы, локализованные на внешней поверхности растительных клеток (Wojtaszek, 1997; Minibayeva et al., 2001). В связи с этим, редокс-ферменты, локализованные на клеточной поверхности, в частности редокс-системы плазматической мембраны и пероксидазы клеточной поверхности, представляют особый интерес. Известно, что увеличение пероксидазной активности является неспецифическим ответом на биотические и абиотические стрессоры (Bolwell, Wojtaszek, 1997; Bernards et al., 1999; Sreenivasulu et al., 1999; Fang, Kao, 2000; Velikova et al., 2000).
Предполагается, что пероксидаза может выступать в качестве регулятора формирования адаптационных процессов при различных физиологических нагрузках на клетки.
Таким образом, несмотря на широко известные токсические эффекты активированного кислорода, в настоящее время сформировалось представление об АФК как ключевых регуляторах метаболических и защитных реакций живых клеток. Выявление возможных источников продукции АФК, а также путей их детоксикации является важным подходом к изучению их роли при самых разнообразных стрессовых воздействиях. Исследование особенностей генерации АФК, а также выяснение роли АФК в каскаде сигнальных событий может внести существенный вклад в расшифровку механизмов адаптационных процессов растительных клеток.
Цель и задачи:
Основной целью исследований было изучение особенностей образования АФК растительными клетками, выявление источников их продукции на клеточной поверхности и участия АФК в в ранних ответных реакциях, в частности в сдвигах ионной проницаемости плазмалеммы, в ответ на биотические и абиотические стрессовые воздействия.
Были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать образование Н202 суспензионными клетками французской фасоли Phaseolus vulgaris L. при обработке элиситором, выделенным из патогенного гриба Colletotrichum lindemuthianum, изучить взаимосвязь продукции Н2О2 с другими сигнальными процессами.
2. Исследовать образование Ог одноклеточной водорослью хлорелла Chlorella vulgaris при инфицировании микоплазмой Acholeplasma laidlawii.
3. Изучить влияние обезвоживания и последующей регидратации на образование Ог и Н2О2 клетками лишайников и печеночника, а также выявить зависимость продукции АФК от метаболической активности клеток.
4. Исследовать образование Ог"- и активность экстраклеточной пероксидазы в клетках корней пшеницы при раневом стрессе.
5. Выявить возможное участие редокс-системы плазмалеммы и пероксидаз клеточной поверхности в продукции супероксида клетками отсеченных корней пшеницы.
6. Выделить, очистить и охарактеризовать экстраклеточные изоформы пероксидаз клеток корней пшеницы. Выявить возможные механизмы появления новых индуцированных поранением экстраклеточных пероксидаз.
7. Исследовать экстраклеточные Ог " - синтазную и пероксидазную активности при модификации ионной проницаемости плазмалеммы клеток корней пшеницы детергентами, трипсином, ионами металлов, ионами кальция, холестерина, ионофорами, салицилатом, рядом ди-, трикарбоновых кислот.
8. Изучить образование 02 _ и экстраклеточной пероксидазной активности при действии на корни пшеницы ксенобиотика амидопирина.
9. Выявить возможную взаимосвязь между образованием супероксидного радикала и тепловыделением в клетках корней пшеницы и одноклеточной водоросли хлорелла Chlorella vulgaris.
Положения, выносимые на защиту:
1. Для производства патоген-индуцированного окислительного взрыва в суспензионной культуре клеток фасоли, необходимо наличие трехкомпонентной системы, включающей в себя пероксидазу клеточной стенки, подщелачивание апопласта, восстановитель.
2. В клетках лишайников и бриофитов окислительный взрыв при обезвоживании и последующей регидратации происходит у видов, характеризующихся высокой метаболической активностью.
3. В продукции 02 в ходе раневого стресса в клетках корней пшеницы участвуют редокс - система плазмалеммы и пероксидазы клеточной поверхности. Появление новых АФК - продуцирующих пероксидаз в апопласте связано с высвобождением этих молекул из плазмалеммы и клеточной стенки, а не секрецией из цитозоля.
4. Проницаемость плазмалеммы для протонов и изменение их содержания в апопласте регулируют вовлечение различных ферментных систем в продукцию АФК. Увеличение содержания в апопласте растительных клеток свидетельствует об активации редокс-систем плазмалеммы, а уменьшение содержания Н , приводящее к подщелачиванию апопласта, активирует экстраклеточные пероксидазы для продукции АФК.
5. Одной из физиологических функций АФК, производимых редокс -системами плазмалеммы и пероксидазами, локализованными на поверхности клеток корня, является детоксикация ксенобиотиков.
Научная новизна работы
Выявлено существование трехкомпонентной системы, необходимой для производства патоген-индуцированного окислительного взрыва в суспензионных клетках фасоли. Трехкомпонентная система включает в себя пероксидазу клеточной стенки, подщелачивание апопласта, восстановитель. Показано, что пероксидаза клеточной стенки способна производить Н2С 2 в течение 12-16 минут после инфицирования патогеном при наличии восстановителя и подщелачивании апопласта.
Впервые продемонстрировано производство взрыва 02 в клетка одноклеточной водоросли хлорелла при инфицировании микоплазмами. Впервые продемонстрировано производство окислительного взрыва в клетках лишайников и бриофитов при обезвоживании и последующей регидратации. Показано, что существует корреляция4 высокой скорости продукции супероксида с индексами высокой метаболической активности клеток лишайников. Предполагается, что АФК могут обеспечивать защиту клеток криптогамов от патогенов, а также участвовать в снабжении клеток субстратами в результате разложения лигнина.
Впервые выявлена динамика продукции 0{ в ходе развития раневого стресса корневых клеток и показана корреляция скорости его образования с изменениями проницаемости плазмалеммы для ионов калия и мембранного потенциала.
Впервые показано, что пероксидаза клеточной поверхности растительных клеток участвует в продукции 02" при раневом стрессе. Данный процесс может активироваться при подщелачивании апопласта, действии детергентов, ряда органических кислот, металлов. Стимулирующее действие органических кислот на образование 0{ и пероксидазную активность может быть связано с # ингибированием каталазы, а также с изменением поверхностного заряда плазмалеммы или проявления кислотами детергенто-подобных свойств.
Продемонстрировано появление двух новых гликозилированных экстраклеточных пероксидаз с м.в. 40 и 136 кДа и активация в 30 раз существующей негликозилированной пероксидазы с м.в. 38 кДа. С помощью хроматографического и электрофоретического анализа изолированных и очищенных белков пероксидаз получено прямое доказательство продукции 02 экстраклеточными пероксидазами корней пшеницы.
Впервые предположено, что продукция 02"_ на поверхности растительных клеток самоокисляющимся флавином плазмалеммы и пероксидазами клеточной стенки может являться начальным этапом процесса детоксикации растительными клетками ксенобиотиков.
Впервые выявлена сопряженность генерации 02" и общего тепловыделения растительных клеток. Вклад в тепловыделение вносит рекомбинация кислородных радикалов и окислительные процессы с участием Ог .
Выдвинуто положение о том, что при стрессовых воздействиях уменьшение содержания протонов в апопласте растительных клеток, приводящее к его подщелачиванию, стимулирует активность экстраклеточных пероксидаз по продукции АФК.
Научно-практическая ценность работы
Полученные результаты могут служить теоретической и методологической основой для исследования функциональной значимости АФК в адаптации и ее срыва при неблагоприятных воздействиях. В работе намечены дальнейшие пути решения задач по выявлению механизмов регуляции систем, как генерирующих АФК, так и участвующих в детоксикации АФК. Материалы работы могут быть использованы в лекционных курсах и проведении лабораторных работ в университетах, академических институтах и других научных заведениях.
Апробация работы
Материалы диссертации были доложены на итоговых конференциях и семинарах КИББ КНЦ РАН (1997, 1999, 2000, 2003 гг.), а также на Всесоюз. совещ. «Ионный транспорт и регуляция функций клетки» (Ленинград, 1990), Всесоюз. совещ. «Клеточные механизмы адаптации» (Чернигов, 1991), II съезде ВОФР (Минск, 1990), III съезде ВОФР (С.-Петербург, 1993), II съезде украинских физиологов растений (Киев, 1993), Int. Symp. on Plant Biology (Lund, Sweden, 1994), 9 ISBC conf. «Calorimetry and thermodynamics of biological processes» (Berlin, Germany, 1994), 9th FESPP Congress (Brno, Czech Republic, 1994), Int. workshop «Plant Respiration: Physiological Aspects» (Сыктывкар, Россия, 1995), Winter Meeting of SFRR (Aberdeen, UK, 1995), 2 Респ. конф. «Актуальные экологические проблемы Респ. Татарстан» (Казань, 1995), 2nd Int. conf. «Oxygen, free radicals and enviromental stress in plants» (Vienna, Austria, 1996), 5th Symp. Int. Soc. on Root Research (South Carolina, USA, 1996), Int. conf. «The Life and Death of the Cells» (Edinburgh, UK, 1996), II съезде биохим. об-ва РАН (Москва, 1997), VI мол. конф. ботаников (Санкт-Петербург, 1997), Summer meeting of SFRR (Pisa, Italy, 1997), Int. symp. «Plasma membrane redox systems and their role in biological stress and disease» (Antwerpen, Belgium, 1998), Eur. conf. «Oxygen, free radicals and oxidative stress in plants» (Granada, Spain, 1998), Int. conf. «The Supporting roots: structure and function» (Bordeaux, France, 1998), Int. conf. «Biothermodynamics: molecular, organismal, and Ecological» (Uta, USA, 1999), Всеросс. мол. науч. конф. «Растение и почва» (Санкт-Петербург, 1999), 5 Int. symp. «Plasma Membrane Redox and its Role in Biological Stress and Disease» (Гамбург, Германия, 2000), Всеросс. конф. мол. уч. «Молодые ученые - агропромышленному комплексу» (Казань, 2000), Школе-конф.
«Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), Междунар. конф. «Митохондрии, клетки и активные формы кислорода» (Пущино, 2000), Всеросс. конф. «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), XI Int. conf. «Magnetic resonance in chemistry and biology» (Звенигород, Россия, 2001), Int. symp. «Signaling systems of plant cells» (Москва, 2001); XII conf. ISBC «Calorimetry a Tool in Health and Environmental Studies» (Santiago de Compostela, Spain, 2001), Междунар. конф. «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке» (Сыктывкар, 2001), Науч. конф. мол. уч. «Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков» (Уфа, 2001), 5 Int. conf. «Oxygen, free radicals and oxidative stress in plants» (Nice, France, 2001), Int. conf. «Plasma membrane redox systems and their role in biological stress and disease» (Ravenna, Italy, 2002), 7th Int. Mycological Congress (Oslo, Norway, 2002), Int. workshop on desiccation tolerance in plants (Saldahna, South Africa, 2003), Int. conf. «Plant stress, reactive oxygen species and antioxidants» (Freising, Germany, 2003), XIII Int. conf. ISBC «Calorimetry a Tool in Health and Environmental Studies» (Wiirzburg, Germany, 2003), Междунар. конф. «Проблемы физиологии растений Севера» (Петрозаводск, Россия, 2004), Int. Lichenological Congress (Tartu, Estonia, 2004), Всеросс. конф. «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004).
Публикации по теме диссертационной работы
Содержание диссертационной работы изложено в 86 работах, включая 49 тезисов и 36 статей, в том числе 9 в отечественных и 17 в зарубежных рецензируемых журналах.
Окислительный взрыв в растительных клетках
Многие клеточные компоненты имеют потенциальные источники АФК. Образование АФК наблюдается в таких компартментах в клетке, как ядро (Пескин, 1996), хлоропласты (Elstner, 1991; Asada, 1999; Foyer, Noctor, 2003), митохондрии (Rich, Bonner, 1978; Loschen et al., 1973; 1974; Turrens et al., 1982), эндоплазматический ретикулкум (Fridovich, 1970; Winston, Cederbaum, 1983; Lindqvist et al., 1991; Simontacchi, Puntaralo, 1992), пероксисомы (del Rio et al., 2002), в плазматической мембране (Hohn, Lehere, 1975; Cakmak, Marschner, 1988; Doke, Ohashi, 1988; Morre et al., 1988; Doke et al., 1991; Vianello, Macri, 1991) и клеточной стенке (Gross et al., 1977; Gross, 1980; Elstner, 1991; Vianello, Macri, 1991; Bolwell, 1996). Генерация 02 in vitro наблюдалась в различных экспериментальных окислительно-восстановительных системах. Эти системы включают фермент ксантиноксидазу, действующую на ксантин или гипоксантин (Beauchamp, Fridovich, 1971; Nishikimi, 1975), глутатионредуктазу (Liovich, Fridovich, 1992) и другие. Субклеточные компоненты, такие как ядро, хлоропласты, митохондрии, моноциты и нейтрофилы человека (Johnston et al., 1976; Jones, 1994), макрофаги (Кулинский, 1999) и микросомы производят 02 _ in vitro. Генерация 02 фагоцитирующими клетками имеет бактерицидное действие, необходимое для нормального фагоцитоза (Bolwell, Wojtaszek, 1997). Автоокисление многих биологических веществ приводит к продукции АФК. Среди этих соединений -оксигемоглобин, который становится метгемоглобином (Misra, Fridovich, 1971), оксимиоглобин, который становится метмиоглобином (Gotoh, Shikama, 1976), ферредоксины клеток клостридий и шпината (Misra, Fridovich, 1971), аскорбат, катехоламины, фенолы и восстановленные флавины (Мерзляк, 1999; Ballou et al., 1969). Другие процессы, в которых генерируется супероксид, включают фотолиз воды (McCord, Fridovich, 1973) и возбуждение карбохинона, митомицина С и стрептонигрина видимым светом в присутствии кислорода (Carmichael et al., 1985). Супероксид также продуцируется редокс-компонентами in vivo. Например, дипиридиновые гербициды, типа параквата, восстанавливаются НАДФН-зависимой эндоплазматической диафоразой в Е. coli с одновременным восстановлением кислорода до супероксида (Hassan, Fridovich, 1978). Н2Ог образуется в пероксисомах в ходе фотодыхательного пути, а также катаболизма липидов как би-продукт Р-окисления жирных кислот (Corpas et al., 2001). Кроме того, предполагается, что в пероксисомах также происходит катаболизм пуринов (del Rio et al., 1998).
Первая реакция этой катаболической цепи - окисление ксантина в мочевую кислоту с помощью ксантиноксидазы - генерирует супероксид, тогда как мочевая кислота окисляется до аллантоина, приводя к образованию Н2С 2 и СОг- Хлоропласта, осуществляющие процесы фотосинтеза и фотоокисления воды с образованием молекулярного О2, по-видимому, являются теми структурами растительной клетки, в которых образование активированного кислорода происходит с наибольшей интенсивностью (Мерзляк, 1989). Значительная часть супероксидных анионов возникает при функционировании электрон-транспортной цепи. Основным источником 02,_ в фотосистеме I является негеминовый железосодержащий белок ферредоксин. Наряду с электрон-транспортной цепью, Ог образуется при функционировании рибулезо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы/оксигеназы (Мерзляк, 1999). Стрессовые условия окружающей среды, лимитирующие фиксацию С02, такие как засуха и засоление, озон и высокая или низкая температуры, уменьшают регенерацию НАДФ+ в цикле Кальвина, что приводит к перевосстановлению фотосинтетической электронтранспортной цепи и образованию супероксидных радикалов и синглетного кислорода в хлоропластах (Asada, Takahashi, 1987). Для того, чтобы предотвратить перевосстановление электронтранспортной цепи в условиях, лимитирующих фиксацию С02, растения используют фотодыхательный путь для регенерации НАД Ф+ (Corpas et al., 2001). В митохондриях растений (подобно митохондриям животным) генерация 02 происходит при участии убихинона (Q) и флавопротеида (НАД Н- дегидрогеназа) (Мерзляк, 1989). Флавопротеид - кофермент дегидрогеназы комплекса I (НАД Н: CoQ-оксидоредуктазы) митохондрий (Полевой, 1989). В состоянии активного дыхания восстановленной формой CoQ служит CoQH2, а убисемихинон (CoQ ) играет роль мобильного промежуточного соединения (интермедиата) (Скулачев, 1996). CoQ"- чрезвычайно активен как одноэлектронный восстановитель 02. Выход (V- обычно не превышает нескольких процентов от количества поглощаемого митохондриями кислорода (Мерзляк, 1989). В условиях, когда рост и другие энергопотребляющие процессы в растениях заторможены вследствие стресса, электронтранспортная цепь митохондрий может стать перевосстановленной, что приводит к образованию 02 (Purvis, 1997). В результате торможения дыхания при исчерпании АДФ происходит возрастание количества Q" и CoQ -, и резко повышается вероятность «паразитного» одноэлектронного восстановления 02 (Скулачев, 1996). Образование 02 в митохондриях растений может быть также связано с так называемым цианид-резистентным дыханием (Мерзляк, 1999). Возможно, что цианид-устойчивое потребление кислорода митохондриями, которое не сопряжено с фосфорилированием, тесным образом связано с циклическими взаимопревращениями алкильных и перекисных радикалов липидов (Мерзляк, 1989). Цианид-резистентная CoQH2-oKcmja3a -фермент во внутренней мембране митохондрий, катализирующий четырехэлектронное восстановление 02 (Скулачев, 1996). У растений, обладающих высокой интесивностью цианид-устойчивого дыхания, эффективность образования 02 может достигать значительных величин (Мерзляк, 1989). Интересно, что несопряженная CoQH2-OKCHfla3a включается при гораздо больших отношениях CoQH2/CoQ,_, чем сопряженная оксидаза, имеющаяся в тех же митохондриях (Скулачев, 1996). Другим, довольно малоизученным, путем образования АФК в растениях являются реакции детоксикации, катализируемые цитохромами, в частности цитохромом Р45о в цитоплазме и эндоплазматическом ретикулуме. В ходе этих реакций утечка электронов на кислород и декомпозиция промежуточного оксигената цитохрома Р450 может приводить к образованию 02,_ (Urban et al., 1997).
Как уже отмечалось, АФК также генерируются в растительных клетках в плазмалемме, клеточной стенке или экстраклеточно в апопласте. В последнее время НАДФН-зависимая оксидаза (НАДФН оксидаза) плазматической мембраны считается одним из источников АФК в ходе окислительного взрыва, типичного для взаимоотношения растение-патоген (Lamb, Dixon, 1997). Как было показано, химические ингибиторы НАДФН оксидазы, такие как дифенилен йодониум (DPI), блокируют или значительно ингибируют продукцию АФК при биотических и абиотических стрессах (Allan, Fluhr, 1997; Cazale et al., 1999; Orozco-Cardenas, Ryan, 1999; Pellinen et al., 1999; Rao, Davis, 1999). Помимо НАДФН оксидазы, рН-зависимые пероксидазы, оксалат оксидазы и аминооксидазы рассматриваются в качестве источников Н2О2 в апопласте (Bolwell, Wojtaszek, 1997). рН-зависимые пероксидазы активируются при нейтральных и щелочных рН, продуцируя Н2О2 при наличии восстановителя. Подщелачивание апопласта при действии элиситоров предшествует окислительному взрыву. Продукция Н202 рН-зависимыми пероксидазами была предложена в качестве альтернативного механизма продукции АФК в ходе биотического стресса (Bolwell, Wojtaszek, 1997). Оксалат оксидаза катализирует окисление широкого ряда биогенных аминов до их соответствующих альдегидов с освобождением NH3 и Н202. Н202, образованный при окислении аминов, может быть непосредственно утилизирован пероксидазами клеточной стенки при лигнификации и укреплении клеточной стенки как при нормальном росте, так и в ответ на внешние стимулы, такие как поранение и патогенная атака (Allan, Fluhr, 1997; Bolwell, Wojtaszek, 1997). Вопросы образования АФК в мембранных структурах и на поверхности растительных клеток имеют важное значение, поскольку именно с этим часто связаны различные стороны нарушения функциональной активности и развитие повреждений мембран при действии многих факторов внешней среды, а также изменения физиологического состояния растительных клеток в онтогенезе (Мерзляк, 1989). Предполагается, что супероксидные радикалы принимают непосредственное участие на начальных этапах формирования ответных реакций клеток на внешнее воздействие (Минибаева и др., 1997). Несмотря на интенсивное исследование, природа источников АФК при ранних стрессовых реакциях, особенно в ходе окислительного взрыва, в растительных клетках остается предметом дискуссионным.
Патоген-индуцированный стресс в клетках растений
Растения постоянно подвергаются нападению широкого круга паразитов, включая вирусы, бактерии, грибы, нематоды, насекомые и даже другие растения. Растения лишены циркулирующей иммунной системы, имеющейся в клетках животных, для защиты от патогенов, они выработали другие механизмы антипатогенной защиты как конститутивные, так и индуцибельные. В целом, растения устойчивы к большинству патогенов окружающей среды, поскольку они не являются растениями-хозяевами для отдельных патогенов. Даже в том случае, если они являются растениями-хозяевами, имеющийся у них набор генов устойчивости позволяет им узнавать определенные расы патогенов (Scheel, 1998). Различают два типа ответа растительных клеток при патогенной атаке: неспецифичный и раса / вид специфичный ответ. В обоих случаях биохимические процессы, вовлеченные в защиту от патогенов, весьма сходны (Somssich, Hahlbrock, 1998). Устойчивость растений выражается, в конечном итоге, в неспособности патогена к росту, размножению и распространению и часто наблюдается в виде сверхчувствительной реакции (Scheel, 1988). Гиперчувствительный ответ характеризуется локальной смертью клеток и тканей в месте инфицирования (Van Loon, 1997). Как следствие, патоген остается ограниченным некротическими тканями, а кольцо клеток пограничных с ними тканей приобретает нечувствительность к последующему нападению патогенов, -явление, получившее название «локальная приобретенная устойчивость» (Hammon-Koasack, Jones, 1996; Baker et al., 1997). Эти локальные ответные реакции часто запускают неспецифические реакции устойчивости по всему растению -явление, известное как «системная приобретенная устойчивость» (СПУ), обеспечивающая длительную защиту от инфицирования широкого ряда патогенов (Fritig et al., 1998). Метаболические изменения при локальной системной устойчивости растительных клеток включают в себя укрепление клеточной стенки путем отложения и связывания полисахаридов, белков, нерастворимых фенольных соединений; стимуляцию вторичных метаболических путей, некоторые из которых приводят к синтезу небольших по молекуляной массе соединений, обладающих антибиотической активностью (фитоалексины), а также защитных соединений, обладающих регуляторной активностью, таких, как салициловая кислота, этилен, липидные производные; аккумуляцию широкого ряда защитных белков и пептидов (Hahn, 1996; Fritig et al., 1998).
Понимание механизмов ответа растительных клеток на патогенную атаку значительно продвинулось в последние годы. Были изолированы факторы бактериальной и грибной патогенности, идентифицированы механизмы узнавания растением патогена и инициации защитных механизмов. Узнавание патогена Индукция защитных реакций в растительных клетках осуществляется специфическим узнаванием напавшего патогена растением. Включение специфической устойчивости вовлекает активацию рецепторов, обладающих высокой степенью специфичности к виду патогена, которая закодирована в конститутивно экспрессированных защитных (R) генах. Эти рецепторы могут располагаться либо в плазматической мембране, либо в цитозоле (McDowell, Dangl, 2000). В одном виде растений обнаружено большое разнообразие индивидуальных защитных генов с разнообразными спецификами узнавания патогенов (Ellis et al., 2000), которые способны опосредовать защитные реакции, когда атакующий патоген экспрессирует авирулентный (Avr) ген. Avr гены различных классов патогенов весьма различаются по структуре и выполняют различные первичные функции в биологии этих организмов. Специфическое узнавание агрессора растением требует наличия комплиментарных Avr и R генов в обоих видах и опосредуется связыванием лиганда с рецептором (Glazebrook, 1999). Свыше 20 защитных генов со специфичностью узнавания определенных Avr генов были изолированы в семи видах растений, включая одно- и двудольные растения (Rossi et al., 1998; Martin, 1999). Эти гены эффективны в защите от бактериальных, вирусных и грибных патогенов, а также нематод и тли. Несмотря на большое разнообразие механизмов патогенности, было обнаружено, что защитные гены обладают определенными общими мотивами. Пять классов R генов расшифрованы в настоящее время: внутриклеточные протеинкиназы; рецептор-подобные протеинкиназы с экстраклеточным доменом с лейцин-насыщенной последовательностью (ЛНП); внутриклеточные ЛНП белки с нуклеотид- и лейцин-связывающими участками; внутриклеточные нуклеотид-связывающие ЛНП белки с последовательностью, подобной интерлейкиновому рецептору из Drosophila и млекопитающих, и гены ЛНП белков, кодирующие мембраносвязанные экстраклеточные белки. Интересно, что данные классы защитных генов представляют 1% генома арабидопсиса (Ellis et al., 2000). Защитные гены кодируют как специфические белки, узнающие белки патогена, так и те, что инициируют пути сигнальной трансдукции, приводящие в итоге в сложному комплексу защитных реакций (Zhou et al., 1998; Martin, 1999).
Несмотря на значительный прогресс, достигнутый по расшифровке структуры защитных генов, дальнейшего изучения требуют молекулярные механизмы, с помощью которых защитные белки узнают и передают информацию в растительную клетку. Помимо узнавания по типу ген / ген (R / Avr), устойчивость может достигаться через узнавание сигнальных молекул патогена или растительной клеточной стенки, называемых экзогенными и эндогенными элиситорами, соответственно. Эти элиситоры часто являются низкомолекулярными соединениями, которые либо синтезируются, либо освобождаются из полимерных предшественников во время инфицирования (Somssich, Hahlbrock, 1998). Химическая структура различных элиситоров чрезвычайно разнообразна и включает, в частности, гликопротеины, пептиды и олигосахариды. Некоторые протеиновые элиситоры продуцируются непосредственно бактериями или грибными патогенами, тогда как биологически-активные олигосахариды освобождаются из клеточной стенки патогена и растения гидролазами обоих организмов. На поверхности растительных клеток существует комплексная и еще не до конца изученная система рецептирования этих элиситоров, которая активирует каскад защитных сигнальных путей. Сигнальная трансдукция Опосредованное рецептором узнавание на месте инфицирования инициирует локальные и системные ответные реакции, результируя в установлении локальной устойчивости и более позднем развитии СПУ (Scheel, 1998). Самые ранние реакции клеток включают в себя изменения в проницаемости плазматической мембраны, приводящие к входу в клетку ионов кальция и протонов и выходу ионов хлора (McDowell, Dangl, 2000). Ионные потоки индуцируют экстраклеточную продукцию АФК, катализируемую локализованной в плазмалемме НАДФН-оксидазой и / или апопластной пероксидазой (Bolwell, 1995). Как отмечалось выше, возможен вклад и других АФК-продуцирующих систем. Первичные реакции запускают каскад сигнальных путей, составляющих сложную, высокоинтегрированную сигнальную сеть, которая опосредует весь защитный ответ (рис. 9).
Методы исследования
Количество супероксида определяли спектрофотометрическим методом с использованием эпинефрина (ICN) и ХТТ (Sigma), а также методом электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР) с использованием спиновой ловушки тирон (Sigma). Акцептор электронов эпинефрин (1 мМ, рН 6,8, время воздействия 15 мин) в присутствии супероксида превращается в адренохром (Barber, Kay, 1996), образование которого регистрировали спектрофотометрически (А. = 480 нм) (Carl Zeiss, Jena, ФРГ). После инкубации в соответствующих растворах измерения проводили в присутствии корней и в ЭКР. Концентрацию адренохрома (М) рассчитывали по формуле: " и-- - где Е - оптическая плотность; є - молярная экстинкция вещества = 4020 М"1 см"1; / - длина кюветы. Другим акцептором электронов, использованным для определения содержания супероксида спектрофотометрическим методом, был 0,2 мМ ХТТ (2,3-bis[2-Methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2Hetrazolium-5-carboxanilide), который в присутствии супероксида превращается в ХТТ формазан (Able et al., 1998). Образование формазана регистрировали спектрофотометрически (А, = 470нм) (DU 7500, Beckman, ФРГ). Измерения проводили в 50 мМ К-фосфатном буфере рН 7,0 с добавлением 0,2 мМ НАДН. Концентрацию ХТТ формазана расчитывали с учетом коэффициента экстинкции є = 2,16 10 М"1 см" (Sutherland, Learmonth, 1997). Специфичность была подтверждена ингибированием образования супероксида в присутствии 250 ед мл"1 супероксиддисмутазы (СОД), фермента, непосредственно связывающего супероксид (Misra, Fridovich, 19726). Уровень супероксида представлен в концентрации адренохрома, скорости образования восстановленного ХТТ и процентах к контролю. Измерение уровня супероксида методом ЭПР осуществлялось с использованием тирона (4,5-дигидрокси-1,3-фенил-дисульфонат натрия). Тирон, будучи дисульфоновым катехолом, окисляется супероксидным радикалом до соответствующего семихинона, обладающего характерным ЭПР спектром (Miller, Rapp, 1973). Было показано, что тирон является специфической спиновой ловушкой электронов при образовании супероксидных анион радикалов (Misra, Fridovich, 1972 а). После инкубации тканей в экспериментальных растворах добавлялся 50 мМ тирон, после 2-3 минутного воздействия раствор сливался, и его рН доводился до 8,5. Аликвота раствора помещалась в запаянный с одного конца капилляр из стекла пирекс диаметром 100 мкм, который затем вставлялся в микроволновую ячейку ЭПР спектрометра.
Спектры образовавшегося в результате реакции семихинона тирона регистрировались на ЭПР спектрометре РЕ 1306 (Россия) со следующими используемыми параметрами: СВ-частота 9,46 Гц; величина развертки магнитного поля 25 Гс; частота модуляции 100 кГц; амплитуда 1,4 Гс. (Vylegzhanina et al., 2001). Семихинон тирона является довольно стабильным радикалом, обеспечивающим постоянный ЭПР сигнал в течение, по крайней мере, 15 мин. Семихинонный радикал тирона производит характерный четырех-пиковый ЭПР спектр благодаря взаимодействию неспаренного электрона с двумя неравными протонными кольцами. Молекулы тирона взаимодействуют с молекулами 02 в соотношении 1 : 1. На этой основе проводился количественный анализ регистрируемых ЭПР спектров с учетом того, что амплитуда сигнала пропорциональна титру 02 . Измерения на ЭПР спектрометре проводились совместно с с.н.с. КИББ РАН Н.Н. Вылегжаниной. Определение количества пероксида водорода Количество Н202 определяли спектрофотометрическим методом с использованием ксиленола оранжевого (Sigma) и методом хемилюминесценции. В экспериментах с использованием ксиленола оранжевого (Gay, Gebicki, 2000) рабочий реагент состоял из 0,1 мл реагента А, содержащего 25 мМ FeSC 4, 25 мМ (NH4)2S04 и 2,5MH2S04, и 10 мл реагента Б, содержащего 125 мкМ ксиленола оранжевого и 100 мМ сорбитола. В типичном эксперименте 100-150 мг растительного материала инкубировали в опытных растворах в течение определенного времени. Рабочий реагент (3 мл) был добавлен к 0,6 мл (Н202 продукция) или 0,1 мл (Н202 детоксикация) инкубационного раствора, смесь выдерживалась в течение 1 часа, затем содержание Н202 было определено спектрофотометрически (А, = 560 нм). Другим методом определения уровня Н202 был метод хемилюминесценции, зависимой от люминола (Sigma). Измерения проводились с использованием люминометра (модель 1250, LKB Wallac, Bromma, Швеция). 1 мл суспензионной культуры помещался в кювету люминометра с постоянным помещиванием. После быстрой инъекции 200 мкл 1 мМ люминола уровень люминесценции измерялся до достижения максимума в течение менее, чем 1 мин.
Для определения абсолютных значений Н202 обоими методами осуществлялась калибровка по стандартным растворам Н202. Специфичность проб была подтверждена ингибированием продукции Н202 добавлением 500 ед мл 1 катал азы. Определение активности экстраклеточных пероксидазы, малатдегидрогеназы и лакказы Известно, что гваяковая смола, имеет в окисленном состоянии цветную молекулу (Вальтер и др., 1957). Для обнаружения пероксидазы (донор: перекись водорода - оксид оредуктаза, 1.11.1.7) пользуются свежеприготовленным спиртовым раствором гваяковой смолы (гваяколом). Метод определения активности пероксидазы основан на измерении оптической плотности продукта реакции тетрагваякола (є = 26,6 мМ см"1), образовавшегося при окислении гваякола за исследуемый промежуток времени (МаеЫу, 1955). Активность экстраклеточной пероксидазы (ЭКП) измеряли в ЭКР (описание ЭКР см. выше). Скорость образования тетрагваякола регистрировали по увеличению адсорбции (А, = 470 нм) на спектрофотометре (Carl Zeiss, Jena, ФРГ). Измерительный раствор содержал 0,5 мл 60 мМ гваякола, 1,5 мл 200 мМ Na-фосфатного буфера рН 7,0, 0,5 мл исследуемого ЭКР и 0,5 мл 50 мМ Н202. Реакция инициировалась добавлением Н202 и измерялась в течение 2 мин - в момент линейного изменения скорости реакции. Активность экстраклеточной малатдегидрогеназы (МДГ) измеряли спектрофотометрически по восстановлению оксалоацетата в качестве субстрата. Уменьшение адсорбции (k = 340 нм) регистрировали на спектрофотометре (DU 7500, Beckman, ФРГ). Измерительный раствор содержал 50 мМ Tricine буфер рН 8,5, ЭКР, 0,4 мМ оксалоацетат и 0,2 мМ НАДН. Реакция инициировалась добавлением НАДН. Активность лакказы определяли по методике Min et al. (2001) с использованием субстратов ABTS (2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) и сирингальдазина (Sigma). Для экспериментов с использованием ABTS образцы инкубировались в 5 мл 1 мМ ABTS в 25 мМ Na-ацетатном буфере рН 5,0 в течение 15 мин в темноте. Оптическую плотность продукта измеряли спектрофотометрически (А, = 420 нм), концентрацию которого расчитывали с учетом коэффициента экстинкции s = 35 мМ 1 см 1. Для экспериментов с использованием сирингальдазина образцы инкубировались в 5 мл водного раствора 10 мкМ сирингальдазина рН 6,5 в течение 15 мин в темноте. Оптическую плотность продукта измеряли спектрофотометрически (А. = 525 нм), концентрацию которого расчитывали с учетом коэффициента экстинкции є = 65 мМ 1 см"1.
Эффекты обезвоживания на продукцию АФК в клетках лишайников и бриофитов
В настоящее время внимание исследователей привлекает проблема роли АФК, в частности супероксидного анион-радикала и пероксида водорода в регуляции клеточных процессов растительных клеток и стрессовых ответах не только при действии биотических, но также и абиотических стрессовых факторов. Рассматривается участие АФК в процессах механического стресса (Мерзляк и др., 1991), гипоксии и аноксии (Закржевский и др., 1995; Blokhina et al., 2001; Чиркова, 2002), регенерации тканей (Вартанян и др., 1992), при действии на растения тяжелых металлов (Schutzendubel, Polle, 2002), озона (Rao et al., 2000, Pellinen et al., 2002). Предполагается, что 0{ является вторичным посредником клеточной активации и пролиферации (Вартанян и др., 1992; Гамалей и др., 1999). Кроме того, известно, что развитие в растениях стресса, индуцированного обезвоживанием, сопровождается окислительным стрессом и может привести к гибели клеток (Kranner et al., 2002). Большинство растений умирает, когда относительное содержание воды (ОСВ) в их тканях падает ниже 20-50%. Из приблизительно 250 000 видов покрытосеменных около 350 так называемых устойчивых к обезвоживанию растений могут высыхать до 4-13% ОСВ без повреждения (Black, Pritchard, 2002). Эти растения обладают уникальным свойством - способностью выживать в засушливых условиях в течение месяцев или даже лет (Scott, 2000; Tuba et al., 1994). Эти виды высыхают до состояния мертво выглядящих растительных остатков, но моментально оживают, как только вода становится доступной. Устойчивые к обезвоживанию виды обнаружены среди криптогамов, и особенно, лишайников и мхов. Именно эти объекты, являющиеся удобной модельной системой для изучения водного стресса в растениях, были использованы в наших экспериментах. Несмотря на существующие немногочисленные данные в литературе об эффектах обезвоживания на клетки лишайников и бриофитов, особенности продукции АФК в стрессированных лишайниках, к сожалению, до сих пор не были изучены совсем. В связи с этим, в задачи нашего исследования входило изучение влияния обезвоживания и последующей регидратации на продукцию супероксида и пероксида водорода лишайниками подотряда Peltigerineae и печеночником Dumortiera hirsuta, исследование возможной корреляции продукции АФК с индексами их метаболической активности, а также выявление возможных источников АФК, продуцируемых на клеточной поверхности этих криптогамов. 3.2.1. Окислительный взрыв в клетках лишайников подотряда Peltigerineae, индуцированный обезвоживанием Лишайники часто являются долгоживущими организмами, они растут в суровых условиях окружающей среды, где подвергаются множеству абиотических стрессовых факторов (Gilbert, 2000). У них отсутствует кутикула, а потому они чрезвычайно чувствительны к патогенной атаке бактерий и грибов.
Риск вероятной атаки особенно велик при регидратации после обезвоживания, когда чувствительные к обезвоживанию виды теряют значительное количество внутриклеточных ионов (Buck, Brown, 1979) и низкомолекулярных Сахаров (Dudley, Lechowicz, 1987), которые могут служить субстратом для патогенов. Многие лишайники содержат в высоких концентрациях вторичные метаболиты, такие как усниевая кислота, производные пульвиниковой кислоты, алифатические кислоты, депсиды и депсидоны (Huneck, Yoshimura, 1996). По всей вероятности, естественная селекция выбрала виды, производящие эти соединения, поскольку они выполняют важные метаболические функции. Некоторые из них могут отпугивать патогенов, многие имеют антибиотические свойства и, как считается, защищают лишайники от патогенов (Lawrey, 1989, 1995). На удивление, некоторые лишайники, например, члены широкораспространенного подотряда Peltigerineae, содержат лишь небольшое количество «лишайниковых» соединений (Huneck, Yoshimura, 1996) и, тем не менее, могут противостоять патогенной атаке. Какие же возможны альтернативные наличию вторичных метаболитов механизмы, защищающие клетки лишайников от патогенов? Как отмечалось в обзоре литературы, в высших растениях считается, что быстрая экстраклеточная продукция АФК, окислительный взрыв, играет важную роль в защите растений от патогенной атаки (Murphy et al., 1998). Результаты наших экспериментов показали, что все лишайники подотряда Peltigerineae продуцируют экстраклеточно Ог " с высокой скоростью, даже будучи в нестрессированном состоянии (рис. 23 и 24). ЭРП спектры с применением спиновой ловушки тирон выявили чувствительность супероксид-синтазной Продукция 02 происходит в лишайниках, содержащих несколько различных фотобионтов. В то время, как многие лишайники подотряда Peltigerineae являются симбионтами с цианобактериями, некоторые виды лишайников, не имеющие цианобактерии в качестве симбионта, как например, Pseudocyphellaria aurata, также производят 0{ . Эти данные предполагают, что ответственным за продукцию Oi является микобионт. Среди свободно живущих грибов, как известно, базидомицеты могут производить АФК экстраклеточно, особенно те виды, которые вовлечены в биодеградацию лигнина (Cohen et al., 2002). Все тестированные нами лишайники имеют в качестве микобионтов аскомицеты. Хотя существует недостаточно сведений о способности свободно живущих аскомицетов производить АФК экстраклеточно, известно, что некоторые из них могут деградировать лигнин (Hale, Eaton, 1993), вероятно, секретируя лакказы (Claus et al., 2002). Кроме того, было показано, что патогенные грибы Deuteromycetes, например Botrytis, производят пероксид водорода и гидроксильный радикал (Van der Vlugt Bergmans et al., 1997; von Tiedemann, 1997). Таким образом, собственные и литературные данные свидетельствуют о том, что, по крайней мере, некоторые представители как свободно живущих, так и являющихся микобионтами в лишайниках аскомицеты могут производить АФК экстраклеточно. Наши предварительные исследования показали, что 0{ - продуцирующие ферменты клеток лишайников не обладают классическими характеристиками АФК-продуцирующих ферментов высших растениях. Чувствительность продукции АФК к KCN и NaN3 является характеристикой пероксидаз (табл. 6) (Bestwick et al., 1997).
Однако стимуляции 02 _ продукции при добавлении экзогенных восстановителей цистеина и НАД Н, что также характерно для пероксидаз (Bolwell et al., 1995), в наших экспериментах не наблюдалось (табл. 6). Мы предположили, что ферментами, вовлеченными в экстраклеточную продукцию 0{ лишайниками подотряда Пелтигеровых, являются особые изоформы полифенолоксидаз -лакказы. Лакказы (ЕС 1.10.3.2), принадлежащие семейству «blue-copper» оксидазных ферментов, содержащих четыре иона меди, обнаружены в некоторых высших растениях, грибах и прокариотах. Лакказы восстанавливают молекулярный кислород до двух молекул воды с одновременным одноэлектронным окислением многих ароматических субстратов (Mayer, Staples, 2002). Наиболее известными являются изоформы лакказ в коричневых и белых гнилостных грибах, где они участвуют в деградации лигнина, продуцируя АФК. Лакказы также вовлечены в такие метаболические процессы грибов, как половой морфогенез и меланизация. В промышленности различные изоформы лакказ используются в очищении вина и биоразложении таких органических соединений, как трихлорофенол, алкены, гербициды. Они также могут обесцвечивать красители. К нашему удивлению, в литературе совершенно отсутствуют сведения о лакказах, функционирующих в такой большой и важной группе грибов, как аскомицеты лишайников. Наши эксперименты показали, что лишайники подотряда Peltigerineae характеризуются высокой активностью лакказ (рис. 25 и 26). Кроме того, нами было показано наличие корреляции между экстраклеточной продукцией 02 и активностью лакказ с использованием двух различных субстратов — ABTS (рис. 25) и сирингальдазина (рис. 26). Механизм генерации супероксидного радикала лакказами лишайников до сих пор неясен, однако известно о наличии в свободно-живущих грибах эстраклеточного хинонного цикла, участвующего в продукции 02 - этими организмами (Guillen et al., 2000). В дальнейшем представляется перспективным изучение вероятности функционирования подобного механизма в лишайниках.
