Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1.1. Начальные этапы бобово-ризобиального симбиоза 11
1.1.1. Преинфекция 12
1.1.2. Инфекция 14
1.2. Регуляция симбиотического взаимодействия 17
1.3. Устойчивость микросимбионта к действию защитных систем растения-хозяина 21
1.4. Влияние низкой положительной температуры на бобово-ризобиальный симбиоз 25
1.5. Активные формы кислорода и их биологическая роль 29
1.5.1. Характеристика АФК 32
1.5.2. Супероксидный анион-радикал 33
1.5.3. Пероксид водорода 37
1.6. Антиоксидантая система растений 43
1.6.1. Общая характеристика антиоксидантной системы растений 43
1.6.2. Высокомолекулярные антиоксиданты 44
1.6.2.1. Супероксиддисмутаза 45
1.6.2.2. Каталаза 50
1.6.3. Низкомолекулярные антиоксиданты 53
Выводы из обзора литературы 54
Цель и задачи исследования 56
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 57
2.1. Материал и методы 57
2.1.1. Объект исследования 57
2.1.2. Реактивы и питательные среды 58
2.1.3. Использованная аппаратура 59
2.1.4. Температурный режим 59
2.1.5. Проращивание растительного материала 59
2.1.6. Методика проведения микробиологических исследований 60
2.1.7. Методики проведения физиолого-биохимических исследований
1) Оценка уровня супероксидного анион-радикала 60
2) Определение содержания пероксида водорода 61
3) Оценка влияния экзогенной салициловой кислоты и пероксида водорода на содержание пероксида водорода в проростках гороха, их рост и проникновение ризобий 62
4) Определение активности супероксиддисмутазы 62
5) Определение активности каталазы 63
6) Определение общего белка 64
2.1.8. Статистическая обработка результатов 64
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Активные формы кислорода и антиоксидантные ферменты в проростках гороха в зависимости от симбиотической эффективности и совместимости клубеньковых бактерий 65
3.1.1. Уровень супероксидного анион-радикала и активность супероксиддисмутазы в корнях гороха 65
3.1.2. Содержание пероксида водорода и активность каталазы в корнях гороха 72
3.1.3. Уровень супероксидного анион-радикала и активность супероксиддисмутазы в эпикотилях гороха 80
3.1.4. Содержание пероксида водорода и активность каталазы в эпикотилях гороха 83
3.2. Активные формы кислорода и антиоксидантные ферменты в проростках гороха с разной способностью к клубенькообразованию 86
3.2.1. Уровень супероксидного анион-радикала и активность супероксиддисмутазы в корнях гороха 86
3.2.2. Содержание пероксида водорода и активность каталазы в корнях гороха 91
3.2.3. Уровень супероксидного анион-радикала и активность супероксиддисмутазы в эпикотилях гороха 97
3.2.4. Содержание пероксида водорода и активность каталазы в эпикотилях гороха 99
3.3. Влияние экзогенной салициловой кислоты на содержание Н2О2 в корнях гороха и проникновение в них ризобий 103
3.4. Влияние экзогенного пероксида водорода на рост проростков гороха 107
3.5. Влияние низкой положительной температуры на уровень АФК и активность антиоксидантных ферментов в проростках гороха при инокуляции их клубеньковыми бактериями 109
3.5.1. Уровень супероксидного анион-радикала и активность супероксиддисмутазы в корнях гороха 110
3.5.2. Содержание Н2О2 и активность каталазы в корнях гороха 121
3.5.3. Уровень Ог" и активность СОД в эпикотилях гороха 129
3.5.4. Содержание Н2Ог и активность каталазы в эпикотилях гороха 135
Заключение 141
Выводы 146
Список литературы 148
- Регуляция симбиотического взаимодействия
- Антиоксидантая система растений
- Активные формы кислорода и антиоксидантные ферменты в проростках гороха с разной способностью к клубенькообразованию
- Влияние экзогенного пероксида водорода на рост проростков гороха
Введение к работе
Среди симбиотических ассоциаций между почвенными
микроорганизмами и растениями особое место занимает эндосимбиоз, сформированный корнями бобовых растений и азотфиксирующими клубеньковыми бактериями - ризобиями (rhizobia). В бобово-ризобиальном симбиотическом сообществе эти бактерии фиксируют молекулярный азот (N2) атмосферы и передают его растению в доступной для него минеральной форме. Сами же бактерии получают защиту от неблагоприятных условий окружающей среды (клубенёк - растительное образование, содержащее бактерии) и источник питания (поступающие в клубенёк ассимиляты растения). Поэтому вступление бобовых растений в симбиоз с ризобиями существенно расширяет экологические возможности как микросимбионта, так и растения-хозяина. Микросимбионт уходит от конкуренции с сапрофитной микрофлорой и получает доступ к легко усвояемым источникам питания. Для растения-хозяина же открывается возможность жить в условиях дефицита азота или даже полного отсутствия связанного азота в почвенной среде.
Рациональное использование человеком симбиотической азотфиксации, этого уникального биологического феномена, позволяет повышать плодородие почв и получать высокие стабильные урожаи сельскохозяйственных культур на экологически чистом биологическом азоте, не загрязняя почву, как в случае использования минерального азота в растениеводстве в больших дозах и постоянно. Биологический азот полнее усваивается растениями, способствует повышению качества растительной продукции.
Бобовые являются одним из самых больших семейств цветковых растений, у более 90% изученных видов которого обнаружена способность к азотфиксации (Проворов, 1992; Sprent, 2001). Способность бобовых
растений фиксировать атмосферный азот с помощью ризобий, переводить его в доступную для растений минеральную форму (аммоний), делает бобово-ризобиальный симбиоз объектом пристального внимания биологов разных специальностей. Знание физиолого-биохимических механизмов взаимодействия симбиотических партнёров, помогает повысить эффективность симбиоза, проявляющуюся в увеличении интенсивности азотфиксации и существенном росте продуктивности растений.
История изучения бобово-ризобиального симбиоза насчитывает более 100 лет со времени открытия клубеньковых бактерий Бейеринком в 1888 г. и идентификации ризобий как источника фиксированного азота в корневых клубеньках бобовых (Beijerinck, 1888). В настоящее время по степени изученности этот симбиоз значительно превосходит любую другую симбиотическую или фитопатогенную систему. Однако в большинстве работ, посвященных проблемам бобово-ризобиального симбиоза, рассматриваются стадии собственно азотфиксации, когда азотфиксирующий аппарат (зрелый клубенёк) уже сформирован. Исследованию же начальных его этапов уделяется гораздо меньше внимания, в то время как именно от начальных стадий симбиоза зависит успешное прохождение его дальнейших этапов и в конечном итоге формирование эффективного азотфиксирующего аппарата.
Начальные этапы симбиоза стали активно изучаться сравнительно недавно (Vincent, 1980; Brewin, 1991; Franssen et al. 1992). Одной из важнейших причин для изучения симбиоза стала возможность его использования в качестве очень удобной модели для разработки ряда фундаментальных и прикладных проблем физиологии, биохимии и генетики высших растений. Немаловажным стимулом для изучения бобово-ризобиального симбиоза является его большая практическая значимость: целый ряд бобовых (например соя, люцерна, горох, арахис, фасоль и т.д.) относятся к числу важнейших пищевых и кормовых сельскохозяйственных
культур. Горох относится к числу бобовых растений наиболее эффективно фиксирующих атмосферный азот. Это растение выращивается в разных регионах земного шара. Главными странами-производителями гороха являются Россия, Китай, Канада, Европа, Австралия и США (McKay et al., 1999).
Формирование бобово-ризобиального симбиоза определяется двумя основными группами факторов: природой симбиотических партнёров и условиями внешней среды, важнейшим из которых является температура. Внешние условия могут контролировать от 33.7 до 80.5% варьирования симбиотических признаков. То есть, их действие иногда может быть более значительным, чем суммарное действие генотипов обоих партнёров (Фесенко и др., 1995). При благоприятных внешних условиях горох, например, может удовлетворять до 80% своих потребностей в азоте за счёт симбиотической азотфиксации (McKay, 1999).
Основными проблемами на начальных этапах бобово-ризобиального взаимодействия являются:
узнавание растением-хозяином ризобий как симбиотических партнёров, отличие их от других многочисленных групп почвенных бактерий, среди которых часто встречаются и патогенные микроорганизмы;
механизмы проникновения и супрессирование защитных систем растения-хозяина, которые могут быть установлены заранее или индуцированы для защиты от патогенных микроорганизмов;
регуляция количества проникающих ризобий для предотвращения их избытка в клетках растений и образования вследствие этого избыточного количества малоэффективных клубеньков, особенно при неблагоприяных внешних условиях, что отрицательно бы сказалось в дальнейшем на урожае;
включение растением защитных механизмов в органах не связанных с нодуляцией для предотвращения проникновения в них ризобий;
- несоответствие конкурентоспособности ризобий и их азотфиксирующей активности (Ames-Gottfred, Christie, 1989; Орлова и др., 1991; Bottomley, 1992).
При применении в полевых условиях производственных штаммов ризобий, обладающих большей азотфиксирующей эффективностью, но меньшей конкурентоспособностью по сравнению с дикими штаммами, широко распространёнными в почвах, преимущество в инфицировании растений получают последние. Создание производственных штаммов ризобий, одновременно обладающих высокой эффективностью азотфиксации и конкурентоспособностью, или сортов бобовых растений, обладающих способностью отбирать из любой смешанной популяции клубеньковых бактерий только те штаммы, с которыми оно образует наиболее эффективный симбиоз, требует дальнейшего познания физиолого-биохимических механизмов на начальных этапах взаимодействия симбионтов.
Одним из ранних ответов, индуцируемых при взаимодействии растений и микроорганизмов, является генерация активных форм кислорода (АФК), (Baker, Orlandi, 1995; Lamb, Dixon, 1997; Wojtaszek, 1997; Alvarez et al., 1998; Bolwell, 1999). Роль АФК как центрального компонента сигнальной и защитной систем достаточно хорошо изучена при взаимодействии растений с патогенами.
При бобово-ризобиальном симбиозе АФК и антиоксидантная система более всего исследовались на стадии собственно азотфиксации в зрелом клубеньке. В последние годы появились работы, показывающие, что АФК и антиоксидантная система могут играть важную роль и на начальных этапах бобово-ризобиального симбиоза. Предполагается их участие в процессе сигналинга, регуляции бобово-ризобиального взаимодействия, а также в индуцированной системной устойчивости не только к ризобиям, но и к патогенным микроорганизмам (Dalton et al., 1991; Ramu et al., 1999, 2002;
D'Haeze et al., 2001). Однако работы такого направления немногочисленны. Изучение АФК и системы антиоксидантной защиты на начальных этапах бобово-ризобиального симбиоза позволит углубить знания о физиолого-биохимических механизмах этого взаимодействия и повысить его эффективность.
Изучение начальных этапов симбиотического взаимодействия в условиях низких положительных температур (нарушение которых может привести к отрицательным последствиям на более поздних стадиях) представляет не только теоретическое, но и практическое значение, так как целый ряд бобовых являются важными сельскохозяйственными культурами, источниками экологически чистого белка. В то же время, известно, что повреждения, вызванные воздействием низкой температуры, как и другими абиотическими стрессорами, во многом обусловлены АФК, а устойчивость к холоду - способностью растений предупреждать их образование или обезвреживать их (Pinhero et al., 1997; Prasad, 1997).
Таким образом, АФК и антиоксидантная система на начальных этапах бобово-ризобиального симбиоза, особенно при неблагоприятных температурных условиях, в настоящее время остаются недостаточно изученными и требуют углублённого исследованя.
Регуляция симбиотического взаимодействия
Бобовые растения способны к достаточно жёсткой регуляции инфекционного процесса и клубенькообразования, определяя локализацию проникновения бактерий, их количество и число клубеньков (Gresshoff, Caetano-Anolles, 1992; Hirsch, 1992; Pawlowski, Bisseling, 1996; Проворов 1996; Hadri et al., 1998). Выявлен целый ряд генов, регулирующих симбиотическое взаимодействие как на клеточном, так и на организменном уровне. Регуляция опосредована надземной частью растений, то есть носит системный характер. Способность бобовых к регуляции нодуляции определяет оптимальное количество симбиотических клубеньков, не допускает образования их избытка, особенно при неблагоприятных условиях окружающей среды. Инфекционный процесс возникает в очень небольшом количестве корневых волосков. Процент инфицированных корневых волосков по отношению к деформированным варьирует от 0,6 до 32% и обычно превышает 8% (Разумовская, 1967). По данным Бауэра (Бауэр, 1985) в процессе инокуляции обычно участвует примерно 100 тысяч клубеньковых бактерий и 10 тысяч корневых волосков, однако инфекционный процесс инициируется не более, чем в 100 случаях и лишь около 10 случаев инфекции завершается формированием клубенька. Очень часто развитие инфекционной нити прерывается, рост её останавливается, она разрушается,и в клетках обнаруживаются только её остатки (Nutman, 1959). Количество остановившихся в своём развитии инфекционных нитей может составлять от 10 до 80%. Остановка развития инфекционной нити может произойти на любом этапе её продвижения. Соотношение количества образовавшихся клубеньков с количеством инфицированных волосков обычно составляет 1-10% и редко достигает 32%. Таким образом, удачная инфекция, заканчивающаяся образованием клубенька, происходит не так часто, как можно было бы ожидать. Большое количество инфекционных нитей погибает после образования клубенька.
Позже эти наблюдения были подтверждены французскими исследователями (Vasse et al, 1993), которые показали, что при совместимом взаимодействии инфекционные нити в клетках коры корней люцерны останавливали свой рост, и клетки симбиотических партнёров подвергались некрозу. В некротических клетках накапливались фенольные соединения, фитоалексины и PR-белки, характерные для некротических клеток при сверхчувствительной реакции в фитопатогенной системе. Предполагается, что один из таких белков - кислая хитиназа некротических клеток, гидролизует Nod-фактор в инфекционной нити. Синтез Nod-фактора определяется бактериальными «oJ-генами, включая полный набор структурных АВС-тъшов, транскрибируемых в симбиотических условиях только в бактериях, которые заключены в инфекционные нити как в течение инфекционного процесса, так и в зрелых клубеньках гороха и люцерны. При этом количество инфекционных нитей, прекративших свой рост в некротических клетках, прогрессивно увеличивалось как функция времени с момента начала инокуляции. Предполагается, что индуцирование сверхчувствительной реакции ризобиями при совместимом взаимодействии -это часть механизма, при помощи которого растение контролирует число успешных инфекций и клубеньков по типу обратной связи. Важную роль при этом могут играть АФК, которые являются главным фактором развитиясверхчувствительной реакции при взаимодействии растений с патогенами (Doke, 1983; Аверьянов и др., 1991; Iwano et al., 2002). При симбиотическом взаимодействии этот вопрос остаётся малоизученным.
Механизмы с помощью которых растение регулирует симбиотические взаимоотношения стали изучаться сравнительно недавно. Предполагается, что АФК и антиоксидантная система вовлечены в контроль инфекции и нодуляции. Так, АФК образуются в процессе нодуляции Sesbania rostrata (D Haeze et al., 2001). Как уже было сказано выше, Nod-фактор S.meliloti индуцирует образование АФК в корневых волосках люцерны при совместимом взаимодействии (Ramu et al., 1999, 2002). Образованная при этом Н202, экспрессирует ripl-ген, кодирующий пероксидазу (ПО). Известны данные об усилении активности ПО в корневых волосках белого клевера и гороха, инокулированных Rhizobium leguminosarum (Salzwedel, Dazzo, 1993; Wisniewski et al., 2000), донника при инокуляции диким штаммом S. meliloti (Cook et al., 1995), что интерпретируется как защитная реакция растений против ризобий в прединфекционный период и на стадии инфекционного процесса. У клевера лугового (Trifolium pratense L.) наблюдали синхронное изменение активности ПО и чувствительности корня к инфицированию (Цейтлина, 1982). Интересна интерпретация данных, полученных при изучении активности ПО в зонах корня гороха, различающихся по восприимчивости к инфекции R. leguminosarum (Акимова и др., 2002). Показано, что активность ПО при инокуляции несколько снижается, или остаётся неизменной в зоне корня более чувствительной к инфекции. В нечувствительных к инфекции участках корня активность фермента значительно возрастает. Разнонаправленность активности ПО авторы связывают с контролированием инфекции на сайте проникновения ризобий и защитой от неё в других зонах корня. Последнее подчёркивает участие ПО в механизмах авторегуляции нодуляции.
Электронномикроскопические исследования корней растений люцерны, инфицированных S. meliloti показали, что локальное образование АФК происходит в матриксе инфекционных нитей окружающем бактерии, но не в самих бактериях (Santos, 2001; Herouart et al., 2002). Мутанты S. meliloti, не синтезирующие супероксиддисмутазу (СОД), резко изменяли свои симбиотические свойства. Отсутствие генов, кодирующих СОД у S. meliloti индуцирует слабую нодуляцию у люцерны и развитие дефектных бактероидов (Santos et al., 2000). При инокуляции люцерны мутантами S. meliloti, не синтезирующими каталазу, снижалось число нодулированных растений и азотфиксирующая способность мутантных бактероидов была очень низкой (Sigaud et al., 1999).Эти данные показывают, что проникшие в корень ризобии находятся под контролем растения-хозяина, в котором принимают участие АФК, при этом антиоксидантные ферменты микросимбионта играют важную роль для установления эффективного симбиоза с бобовым растением. Однако подобных работ очень мало и проведены они на единичных видах бобовых растений.
В регуляции нодуляции участвуют также уже сформированные клубеньки и апикальная меристема корня. Само развитие клубенька как своеобразной опухоли - защитная реакция растения, которая противодействует системному распространению ризобий во всех тканях (Шильникова, 1989). Первые образовавшиеся клубеньки ингибируют последующую инфекцию (Vasse et al., 1993). После возникновения некоторого количества азотфиксирующих клубеньков у люцерны, образование новых клубеньков в молодых участках корня ингибируется (Caetano-Anolles, Gresshoff, 1991). Срезание зрелых клубеньков у сои приводит к появлению новых на тех же участках корней, с которых они были удалены (Caetano-Anolles et al., 1991). Развитие новых клубеньков связано с бактериями, первоначально инфицировавшими ткани корня. Следовательно, зрелые клубеньки каким-то образом препятствуютформированию новых клубеньков на молодых участках корня. Удаление кончика корня через 1 -2 часа после инокуляции не оказывало существенного влияния на развитие клубеньков. Однако удаление кончика корня перед или в момент инокуляции сопровождается уменьшением числа клубеньков. То есть, в механизмах контролирующих образование клубеньков у сои принимают участие как уже зрелые клубеньки, так и апикальная меристема корня.
Следует отметить, что при нормальных условиях реакция растения направлена на то, чтобы ограничить инфекцию и не ведёт к отказу от вторгающегося симбионта вообще (Vasse et al., 1993).При увеличении инфекционной нагрузки на растение ризобии могут подавлять развитие защитно-регуляторной реакции растения-хозяина. Нарушение регуляции может привести к избыточному образованию малоэффективных клубеньков, снижению интенсивности азотфиксации и, в конечном счёте, снижению урожая бобовых. Кроме того, интенсивное образование клубеньков может повышать поражаемость растений некоторыми патогенами (Gray, Hine, 1976; Orellana et al., 1976; Проворов, 1996a). Таким образом, при нарушении регуляции бобово-ризобиальный симбиоз приобретает сходство с фитопатогенной системой, в становлении и развитии которой важную роль играют АФК.
Антиоксидантая система растений
Растительная клетка располагает мощной и многообразной системой защиты от АФК, особенно в тех органеллах, где они образуются. Такая система включает в себя целый ряд специальных механизмов, предотвращающих образование АФК или обезвреживающих их (Скулачёв, 1998). К механизмам предотвращающим образование АФК относится ингибирование ферментативных реакций, в процессе которых образуются АФК, хелатирование ионов металлов с переменной валентностью специализированными и неспециализированными белками, например ферритином, трансферрином, альбуминами и др. (Sies, 1993), а также уменьшение одноэлектронного восстановления кислорода в ЭТЦ митохондрий за счёт снижения его образования в результате разобщения фосфорилирования и дыхания (Скулачёв, 1996, 1998).
Поддержание концентрации уже образовавшихся в клетке АФК на достаточно низком уровне и локализацию их действия осуществляет специализированная антиоксидантная система в составе низко- и высокомолекулярных антиоксидантов (Меньшикова, Зенков, 1993; Bolwell, Wojtaszek, 1997). От состояния антиоксидантной системы во многом зависит устойчивость растений к стрессовым воздействиям. К высокомолекулярным антиоксидантам относятся ферменты, обезвреживающие АФК, или участвующие в регенерации низкомолекулярных антиоксидантов, и белки, способные связывать металлы с переменной валентностью (Кения и др., 1993). Ферментативные антиоксиданты высших растений, непосредственно обезвреживающие АФК, включают супероксиддисмутазу, каталазу и, в некоторых случаях, пероксидазу. Ферменты, регенерирующие низкомолекулярные антиоксиданты, весьма многочисленны. Особую роль среди них отводят ферментам аскорбат-глутатионового цикла, включающим аскорбатпероксидазу, монодегидроаскорбатредуктазу (МДАР), дегидроаскорбатредуктазу (ДАР) и глутатионредуктазу (ГР) (Зенков, Меныцикова, 1993; Кения и др., 1993; Скулачёв, 1996; Iba, 2002). Антиоксидантные ферменты характеризуются высокой специфичностью действия. СОД катализирует дисмутацию 02", каталаза и АП детоксицируют Н202, а 3 энзима: МДАР, ДАР и ГР включаются в регенерацию аскорбиновой кислоты (АК), которая окисляется в реакции, катализируемой АП в дегидроаскорбиновую кислоту (ДАК). Антиоксидантные ферменты аскорбат-глутатионового цикла функционируют в основном в цитозоле и особенно активно в хлоропластах клеток фотосинтезирующих тканей, а также в клубеньках бобовых и актиноризных растений и у цианобактерий (Dalton et al., 1991). В нефотосинтезирующих органах уровень активности этих ферментов ниже и более важное значение в этих органах приобретают СОД и каталаза (Scherri et al., 1994). Охарактеризуем более подробно эти ферменты. 1.6.2.1.
Супероксиддисмутаза Супероксиддисмутаза (КФ 1.15.1.1 ), молекулярная масса 34 000, была открыта Мак Кодом и Фридовичем при ингибировании аэробного восстановления цитохрома с и тетразолия нитросинего в ксантиноксидазной реакции (McCord, Fridovich, 1969). СОД является уникальным энзимом в том смысле, что фермент обезвреживает первичный продукт восстановления кислорода - 02" и активность его определяется уровнем 02 и Н202, двух субстратов реакции Габера-Вейса и Фентона. Поэтому СОД играет ключевую роль в защите клетки от оксидативного стресса. За редким исключением СОД присутствует во всех аэробных клетках (Аверьянов, 1991; Скулачёв, 1998) и обнаружена даже у облигатно анаэробных бактерий (Kanematsu, Asada, 1989). СОД присутствует во всех субклеточных компартментах, где существует вероятность оксидативного стресса. Фермент осуществляет дисмутацию двух молекул 02" по схеме: В результате, из непроникающего через мембрану супероксидного анион-радикала образуется легко проникающий через неё пероксид водорода (Скулачёв, 1996). Структура и свойства СОД всесторонне изучены. Нативный фермент выдерживает нагревание при 100 С в течение 1 мин устойчив к колебаниям значений рН в широком диапазоне от 2 до 12 (Поберёзкина, Осинская, 1989). Специфичесим ингибитором СОД является диэтилдитиокарбомат натрия (ДДК) (1мМ) (Минибаева и др., 1997). Активность СОД подавляет AgN03, блокируя тиоловые группы (SH-группы) фермента. Известно, что SH-группы (присутствующие не только у СОД, но и у белков плазмалеммы и др.) обладают способностью "обезвреживать" АФК. Связывание их ионами серебра должно приводить к значительной стимуляции образования 02 " . Активацию СОД вызывают экзогенная СК и янтарная кислота, что приводит к повышению концентрации Н202 (Rao et al., 1997; Minibayeva et al.,2001). Несмотря на высокую специфичность фермента, в определенных условиях Си,2п-СОД может взаимодействовать с Н202 и выступать в качестве прооксиданта, инициируя образование радикалов 02" и ОН (Halliwell, 1978). СОД имеет несколько изоферментных форм, различающихся строением активного центра и селективным ингибированием или инактивацией.
Наиболее распространённой формой СОД является биметаллический фермент, содержащий в простетической группе медь и цинк (Си,2п-СОД). Растительные клетки содержат в основном эту медь-цинковую дисмутазу, которая локализована в органеллах, где происходит образование Of и Н2О2 . строме хлоропластов, межмембранном пространстве митохондрий и цитозоле (Almanse et al., 1989; Medhy, 1994). Дисмутация 02 медь-цинковой формой СОД осуществляется по схеме: У прокариотических организмов Си,гп-СОД отсутствует за очень редким исключением. Эти организмы содержат Mn-СОД и/или Fe-СОД, которые имеют структурное подобие за исключением металлического кофактора. Мп СОД локализована также в митохондриях, хлоропластах и пероксисомах высших растений. Fe-СОД обнаружена только у небольшого ряда высших растений и локализуется в основном в хлоропластах, редко обнаруживается в митохондриях и пероксисомах (Rabinowitch, Fridovich, 1983; Биленко, 1989;
Активные формы кислорода и антиоксидантные ферменты в проростках гороха с разной способностью к клубенькообразованию
Уровень супероксидного анион-радикала Результаты исследования показали, что мутанты гороха имели в корнях более низкий средний (за 3 сут) уровень СЬ ", по сравнению с сортом Марат: 23,5 ± 2,1; 13,9 ± 1,3 и 16,8 ± 1,6 соответственно у сорта Марат, мутанта К14а и Nod3. После инокуляции ризобиями уровень Ог" в корнях гороха сорта Марат незначительно изменялся через 1 сут (увеличение недостоверно) и снижался через 2 сут. В корнях мутанта Nod3 наблюдалось снижение этого АФК через 1 и 2 сут после инокуляции. У мутанта К 14а он незначительно изменялся через 1 сут (снижение недостоверно) и увеличивался в 1,3 раза через 2 сут (табл. 7, рис. 6а). Таким образом, уровень Oi неодинаково изменялся в ответ на инокуляцию ризобиями в зависимости от способности генотипов гороха к клубенькообразованию. Активность супероксиддисмутазы Результаты экспериментов показали, что активность СОД в корнях мутантов гороха была более низкой, чем у сорта Марат (табл. 8). Очевидно, что более низкий уровень 02" в корнях мутантов гороха по сравнению с сортом Марат был связан с его меньшей генерацией, а не с более высокой активностью СОД. Через 1 сут после инокуляции ризобиями наблюдалось значительное снижение активности СОД в корнях мутанта К 14а и сорта Марат (достоверно при Р 0,99, v = 4). Через 2 сут после инокуляции активность СОД в корнях этих генотипов гороха повышалась по сравнению с первыми сутками, однако продолжала оставаться ниже, чем в контроле (достоверно при Р 0,95, v = 4). В корнях мутанта Nod3 активность СОД после инокуляции изменялась незначительно (табл. 8, рис. 66). Сравнение уровня Ої в корнях гороха после инокуляции их ризобиями с активностью СОД показывает, что не всегда изменение уровня этого АФК связано с соответствующим изменением активности СОД. Так, через 1 сут после инокуляции корней сорта Марат активность СОД в них снизилась в 2,1 раза, при этом увеличение уровня 02 было незначительным (табл. 7, 8). После инокуляции корней мутанта К 14а активность фермента снизилась в 4 Таблица 7. Цитохром с редуктазная активность (цит. с РА) проростков гороха с разной способностью к клубенькообразованию и влияние инокуляции клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viceae (штамм СІАМ раза, тогда как снижение уровня (" было также незначительным.
В то же время, снижение уровня Ог" в корнях гороха сорта Марат через 2 сут наблюдалось с одновременным соответствующим снижением активности СОД. Эти результаты свидетельствуют о том, что Содержание пероксида водорода Результаты исследования показали, что содержание Н202 в корнях зависело от генотипа растения. Наименьшим средним (за 3 сут) содержанием Н202 отличался мутант К 14а (2,0 ± 0,20) по сравнению с сортом Марат и мутантом Nod3 (3,2 ± 0,28 и 3,7 ± 0,49 соответственно) (табл. 9). Инокуляция проростков гороха клубеньковыми бактериями (штамм СІАМ 1026) существенным образом повлияла на изменение уровня Н202 в корнях. У сорта Марат содержание Н202 уменьшилось почти в 2 раза. У мутанта Nod3 через 1 сут после инокуляции уровень Н202 в корнях также снизился (почти в 3 раза), а через 2 сут увеличился практически до контроля. Отличался по реакции на инокуляцию мутант К 14а: через 1 сут содержание пероксида водорода в корнях увеличилось в 1,6 раза, а через 2 сут уменьшилось ниже уровня Н202 в контроле (достоверно при Р 0,95, v = 4) (табл. 9, рис. 7а). Сравнение содержания Н202 с активностью СОД, осуществляющей дисмутацию 02" до Н202 и представляющую одну из приходных частей баланса Н202 в клетках, показало, что в некоторых вариантах изменение этих показателей совпадает. Так, снижение содержания Н202 в корнях гороха сорта Марат после инокуляции их ризобиями происходит одновременно со снижением активности СОД. В то же время снижение содержания Н202 в корнях мутанта Nod3 и повышение у мутанта К 14а через 1 сут после инокуляции ризобиями не связано с изменением активности этого фермента (табл. 8, 9) и могло зависеть от расходной части баланса Н202, например, от активности ферментов, разрушающих её, таких как каталаза и пероксидаза. Активность каталазы Наибольшая средняя величина активности каталазы (за 3 сут) обнаружена в корнях мутанта К14а (6,8 ± 0,3), у сорта Марат и мутанта Nod3 эта активность равнялась 5,8 ± 0,4 и 6,1 ±0,1 соответственно (табл. 10). Инокуляция корней клубеньковыми бактериями (штамм СІАМ 1026) вызвала неодинаковое изменение активности каталазы в зависимости от генотипа гороха (табл. 10, рис. 76). У гороха сорта Марат активность фермента в корнях через 1 сут после инокуляции оставалась без изменения и повышалась в 1,6 раза через 2 сут (достоверно при Р 0,99, v = 4). У мутанта К 14а активность каталазы в корнях снижалась в 1,3 раза через 1 сут после инокуляции (достоверно при Р 0,99, v = 4) и возрастала на такую же величину через 2 сут (достоверно при Р 0,95, v = 4). У мутанта Nod3 активность фермента практически не изменялась.
Сравнение содержания Н2О2 и активности каталазы в корнях исследованных генотипов гороха позволяет сделать вывод о том, что уровень Н2С 2 во многом определяется активностью данного фермента. Так, более низкое содержание Н2О2 в неинокулированных ризобиями корнях мутанта К 14а по сравнению с другими генотипами связано с более высокой активностью каталазы (табл. 9, 10). Значительное снижение содержания Н2О2 в корнях гороха сорта Марат и мутанта Nod3 через 1 сут после инокуляции не было связано с увеличением активности каталазы (табл. 9, 10). Возможно, что оно было обусловлено воздействием ризобий, снижающих образование этого АФК, что могло способствовать проникновению и продвижению ризобий в тканях корня указанных генотипов гороха. Снижение содержания Н2С 2 после инокуляции могло также происходить за счёт функционирования пероксидаз. Однако Н202 служит не только субстратом пероксидаз, но также может генерироваться в результате их функционирования (Минибаева, Гордон, 2003). Поэтому для выяснения вклада пероксидаз в изменение уровня Н202 при формировании бобово-ризобиального симбиоза требуется специальное исследование, которое выходит за рамки данной работы. Низкий уровень Н202 в корнях гороха сорта Марат через 2 сут после инокуляции был сопряжён со значительным повышением активности каталазы (табл. 9, 10). Увеличение содержания Н202 в корнях мутанта К 14а через 1 сут после инокуляции только частично было связано со снижением активности каталазы: уровень Н202 повышался на 64%, при этом активность фермента снижалась только на 21%. Очевидно, что одним из механизмов устойчивости данного генотипа гороха к ризобиям является его способность генерировать высокий уровень пероксида водорода в корне после инокуляции, которая не супрессируется ризобиями.
Снижение же содержания Н202 в корнях через 2 сут сопровождалось повышением активности каталазы на такую же величину. Обобщая результаты проведённых исследований, можно заключить, что генотипы гороха, различающиеся по способности к клубенькообразованию, имеют разный характер изменения уровня АФК и активности антиоксидантных ферментов в корнях в ответ на инокуляцию клубеньковыми бактериями. Уменьшение содержания Н202 в корнях гороха сорта Марат после инокуляции, а также снижение уровня 02" через 2 сут, по-видимому, связано с подавлением ризобиальным Nod-фактором защитной системы растения хозяина (Schultze, Kondorosi, 1998; Bueno et al., 2001), что способствует инфицированию корня ризобиями. Однако это не исключает того, что после проникновения определённого количества бактерий, бобовое растение контролирует инфекционный процесс путём локального образования АФК в инфекционной нити, как это было обнаружено электронномикроскопическими исследованиями при взаимодействии люцерны с S. meliloti (Santos et al., 2001; Herouart et al., 2002). Снижение уровня 02 и H202 в корнях мутанта Nod3 после инокуляции, по-видимому, связано с нарушением механизмов, контролирующих
Влияние экзогенного пероксида водорода на рост проростков гороха
Результаты опыта, в котором проростки гороха сорта Марат были обработаны пероксидом водорода (0,1 М), показали, что отрицательное воздействие, оказываемое Н2О2 на рост проростков, снижается при инокуляции их клубеньковыми бактериями (табл. 13). В этом опыте рост растений, оцениваемый по сырой массе, на фоне действия экзогенного Н2Ог, был подавлен сильнее, чем при инокуляции растений ризобиями и одновременном воздействии Н2О2 (различие достоверно при Р 0,99, v = 8).В варианте только с инокуляцией (без обработки растений Н202) масса проростков (10 штук) была наибольшей и достоверно (при Р 0,95, v = 4) превышала контроль.
Подобная закономерность наблюдалась и в опыте с "суперклубеньковым" мутантом, где инокуляция усиливала накопление сырого вещества корнями в 1,2 раза (сырая масса 10 проростков равнялась 1,24 ± 0,025 и 1,03 ± 0,062 г при "инокуляции" и "без инокуляции" соответственно; различие достоверно при Р 0,95, v = 4). Инокуляция ризобиями проростков "бесклубенькового" мутанта не оказала влияния на этот показатель (1,02 ± 0,019 и 1,15 ± 0,055 г; различие недостоверно).
Таким образом, инокуляция проростков гороха ризобиями "смягчала" отрицательное воздействие экзогенных СК и Н2О2, способствуя снижению содержания пероксида водорода в корнях и оказывая положительное влияние на рост растений гороха. Причина этого, по-видимому, заключается в том, что ризобиальный Nod-фактор, комплементарный растительному рецептору, подавляет индукцию защитных механизмов растения-хозяина, что выражается в рассматриваемом случае в уменьшении содержания СК и Н2О2, способных оказать антибактериальный эффект на ризобии. Причина усиления роста проростков гороха при инокуляции ризобиями может быть связана с положительным влиянием клубеньковых бактерий на фитогормональный обмен растения-хозяина (Соколова, 2001).Исследования уровня АФК и активности антиоксидантных ферментов, проведенные с использованием 3-х генотипов гороха с разной способностью к нодуляции, а также изучение экзогенного влияния салициловой кислоты и пероксида водорода на содержание АФК и рост проростков гороха свидетельствуют о том, что АФК и салициловая кислота контролируют инфицирование как за счёт прямого антибактериального воздействия, так и посредством регуляции функциональной активности защитных систем растения-хозяина при бобово-ризобиальном взаимодействии. Характер этого взаимодействия определяется, очевидно, как внутренними (например, совместимостью ризобии и бобового растения по генетическим свойствам),так и внешними факторами.
Формирование и функционирование бобово-ризобиального симбиоза зависит не только от природы симбиотических партнёров, но и от условий окружающей среды, влияние которых может быть более значительным, чем суммарное действие генотипов обоих партнёров (Фесенко и др., 1995). Среди множества факторов внешней среды особую роль играет низкая температура, к которой особенно чувствительны стадии инфекции и ранней нодуляции (Lynch, Smith, 1993; Zhang, Smith, 1994).
В условиях низкой температуры бобовое растение ограничивает инфицирование корня ризобиями и, как следствие, количество клубеньков, азотфиксирующая активность которых в этих условиях снижена (Zhang, Smith, 1994; Guy et al., 1997; Воробьёв, 1998). Однако молекулярные механизмы регуляции инфекционного процесса при симбиотическом взаимодействии в условиях низкой температуры остаются практически неизученными.Мы предположили, что АФК и антиоксидантные ферменты могут быть вовлечены в регуляторные механизмы формирования бобово-ризобиального симбиоза при неблагоприятных температурных условиях. Такое предположение было сделано исходя из того, что, во-первых, одной из ранних и неспецифических реакций растения на различные по природе стрессовые воздействия, в том числе и гипотермию, является увеличение уровня АФК (Thomashow, 1999; Зыкова и др., 2002; Лукаткин, 2002). А во-вторых, согласно результатам собственных исследований (табл. 2, 5), а также данным, имеющимся в литературе (Ramu et al., 1999, 2002; D Haeze et al., 2001; Santos et al., 2001; Herouart et al., 2002; Lambais et al, 2002) уровень
АФК изменяется в ответ на инокуляцию ризобиями даже при оптимальной температуре. Поэтому была поставлена задача исследовать уровень АФК и активность антиоксидантных ферментов в проростках гороха после инокуляции их клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viceae штамм СІАМ 1026 при температуре роста 8 С.3.5.1. Уровень супероксидного анион-радикала и активность супероксиддисмутазы в корнях горохаУровень супероксидного анион-радикала Результаты показали, что в неинокулированных проростках, подвергшихся воздействию температуры 8 С, уровень 02" в корнях увеличился в 2,1 и 1,8 раз соответственно через 1 и 2 сут по сравнению с оптимальной температурой (табл. 14). Эти данные согласуются с общепринятым положением о том, что увеличение уровня АФК является одной из ранних и неспецифических реакций живых организмов на различные по природе стрессовые факторы. Следует отметить, что температура 8 С вызывала большее повышение уровня 02 в корнях, чем инокуляция совместимым штаммом ризобий при оптимальной температуре. Через 1 сут после инокуляции проростков ризобиями (штамм СІАМ 1026) на фоне температуры 8 С уровень 02" в корнях снижался по сравнению с неинокулированными проростками при этих же температурных условиях. При этом, однако, был в 1,7 раза выше, чем в контроле и в 1,4 раза выше, чем в варианте с инокуляцией при оптимальной температуре (достоверно при Р 0,95, v = 4). Через 2 сут уровень 02" в корне изменялся незначительно по сравнению с 1 сут, однако был намного выше, чем во всех других вариантах (табл. 14, рис. 10а).Таким образом, несколько "смягчая" отрицательное воздействие температуры 8 С, инокуляция корней ризобиями не снижает уровень 02" до контрольного, что может свидетельствовать об участии этого АФК в
