Введение к работе
Актуальность проблемы, .Одной из важнейших проблем современной биологии является изучение регуляции клеточной активности, находящейся под контролем значительного числа гормонов и физиологически активных соединений, действующих с поверхности клетки. Наиболее универсальны и достаточно строго очерчены две клеточные сигнальные системы, осуществляющие эффективную передачу и усиление внешних сигналов и реализующие их действие на молекулярном уровне. Первая из них - аденилатциклазная, она связана с изменением уровня цАМФ (Sutherland et al.,1962; Ткачук, 1983; Северин, Кочеткова, 1985;). Вторая система,Са -полифосфоинозитольная, в которой участвуют инозитолтрисфосфат (ИФд),Са и диацилглицерол СДАГЭ CRasmussen, 1985, Радченко, 1991). Основные данные о способах и путях сопряжения внешних стимулов с внутриклеточными структурами, реализующими конечный физиологический ответ, получены при изучении клеток животного происхождения CKrebs, 1972; Cohen, 1992).
К началу наших исследований продолжительное время велась дискуссия о возможности функционирования аденилатциклазной системы в клетках растений CAmrhein, 1974; Королев, Выскребенцева, 1978; Franco,1983; Яворская, Калинин, 1984; Newton, Brown, 1986; Доман, Феденко, 1986).Наряду с имеющимися в литературе данными о повышении уровня эндогенного цАМФ под действием фитогормонов, о непосредственном измерении активности аденилатциклазы и стимуляции ее активности фитогормонами.об имитации экзогенным цАМФ действия различных фитогормонов на рост,активность ферментов и различные физиологические процессы, имелся целый ряд публикаций об отсутствии влияния фитогормонов на активность аденилатциклазы, о незначительном содержании цАМФ или даже отсутствии его в растениях. Кроме того, очищенный цАМФ-связывающий белок растений не проявлял протеинкиназной активности. Все это служило основанием тому, чтобы подвергнуть сомнению само существование системы цАМФ и ее роль в регуляции клеточной активности растений CAmrhein, 1977; Letham, 1978). Полагали, что в растениях цАМФ может играть роль, подобную обнаруживаемой в прокариотах, где цАМФ оказывал свое действие на транскрипцию в комплексе с рецептором --цАМФ-связывающим белком,который специфически связывался с ДНК С Яворская, Калинин, 1984; Newton, Brown, 1986). Функционирование цАМФ-
- 4 -зависимых протеинкиназ у прокариот .отрицалось CPastan, Adhya, 1976}, однако, в последующем было доказано CSaier et al., 1990). Отрицательные результаты, полученные при исследовании цАМФ-мессенджерной системы в растениях, очевидно, не случайны. В растениях обнаружены соединения, мешающие определению содержания цАМФ СJohnson et al.,1981; Nikaido et al.,1987). Отмечается необходимость обеспечения нативности клеточных структур при определении цАМФ в растениях CGadeyne et al., 1990; Roef et al.,1990), что важно и при определении активности аденилатциклазы. Опреде- . лению активности цАМФ-зависимых протеинкиназ в грубых экстрактах растений может мешать наличие их ингибиторов CWalsh et al.,1971) и других протеинкиназ - известно,что в тканях животных активность только небольшой части протеинкиназ зависит от цАМФ CLangan, 1973).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение возможности и особенностей функционирования системы цАМФ в клетках высших растений,а также :роли цАМФ-зависимого фосфорили-рования белков растений в регуляции их важнейших физиологических функций:транспорте Са и воды. В задачи исследования входило:
проверить надежность применяемого в изучении животных объектов простого и доступного метода анализа цАМФ по Gilman С1970) для тканей растений и определить содержание этого циклонуклеотида в клетках и его секрецию в зависимости от различных физиологических условий; .
выявить активность ключевых ферментов системы цАМФ: аденилатциклазы и цАМФ-зависимых протеинкиназ в растениях;
изучить особенности функционирования цАМФ-зависимых протеинкиназ и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков растений;
выявить роль фосфопротеинфосфатаз в регуляции уровня фосфори-лированности белков растений;
изучить влияние цАМФ'на транспорт ионов кальция ССа2+) в клетках растений, так как наряду с цАМФ важнейшим вторичным посредником регуляции метаболизма живых клеток являются ионы кальция. В связи с этим чрезвычайно важна регуляция их концентрации в компартментах клетки различными мембранными транспортными механизмами;
изучить механизмы регуляции транспорта воды в растениях вторичными мессенджерами: цАМФ и Са , т.к. важнейшим условием обеспечения оптимального функционирования живых клеток является сохранение их оводненности.что обеспечивается метаболическое
- 5 -регуляцией транспорта воды.
Основные исследования выполнены на этиолированных проростках гороха, зеленых листьях и корнях гороха и бобов, выращенных в лабораторных условиях.
Научная новизна работы. Подтверждена надежность применения простого метода определения цАМФ по Gilman С1970) в экстрактах тканей растений, очищенных с помощью ионообменных смол и окиси алюминия. Диапазон содержания цАМФ в тканях растений соответствовал уровню циклонуклеотида в тканях животных. Стресс Сотрезание ткани от целого растения, удаление клеточной стенки) вызывал резкое увеличение содержания цАМФ в клетках и его секрецию в среду. Секреция цАМФ клетками растений зависела от присутствия гормонов и Сай+ в среде.
Показана роль Са2+ в действии гормонов на активность адени-латциклазы в тканях гороха.
Впервые показано, что цАМФ-зависимые протеинкиназы в тканях растений могут быть активированы в разной степени уже в процессе приготовления гомогената и выделения белков,что может быть одной из причин трудностей в определении активности ферментов. Продемонстрирована регуляция цАМФ-зависимой протеинкиназной активности в тканях растений различными агентами,влияющими на конформа-цию биополимеров.
Впервые показано усиление цАМФ-зависимого фосфорилирования белков растений при ингибировании Са^-зависимых фосфопротеинфос-фатаз, что согласуется с гипотезой Ingebritsen, Cohen С1983) о каскадной регуляции фосфорилирования - дефосфорилирования белков. Ингибиторы фосфатаз увеличивали содержание фосфата в белках этиолированных листьев гороха; при этом изменялась степень чАМФ- и Са -зависимого фосфорилирования белков.
Впервые показано,что цАМФ in vivo сильнее всего фосфорили-ровал полипептиды мол. массы 11,13,18,27,39 и 120 кДа. Полипептиды мол. массы 11,13 и 27 кДа фосфорилировались цАМФ как in vivo, так и in vitro.,.
Впервые установлено, что 1 мМ цАМФ имитировал эффект ИУК in vivo в этиолированных проростках гороха на повышение фосфорилирования полипептида мол. массы 25 кДа; 1 мкМ цАМФ имитировал действие кинетина и АБК на повышение фосфорилирования аолипепти-да мол. массы 37 к Да.
Впервые выявлена резкая стимуляция экзогенным цАМФ фосфорилирования полипептидаСов) мол. массы 9-Ю кДа при +4 С за 2 часа
инкубации проростков гороха, что может иметь значение в приспособительных реакциях растений на низкотемпературный стресс. Фи-тогормон АБК в условиях низкотемпературного стресса (+4С) повышал уровень фосфорилирования большого числа полипептидоз, в том числе полипептидаСов) мол. массы 9-Ю кДа.
Получены данные о регуляции экзогенным цАМФ и фитогормоном ИУК транспорта Са в клетки растений. Данные о снятии эффекта ИУК и АТФ нифедипином,блскатором фосфорилированкых Са2+-каналов, позволяют сделать вывод о том, что фитогормон ИУК регулирует транспорт Сай+ в клетках растений через системы вторичных мессенджеров.
Экзогенные цАМФ и Са регулировали транспорт воды в клетках растений. Показано участие цАМФ- и Са"+- зависимых протеинкиназ в транспорте воды и необходимость цАМФ- и Са2+-зависимого фосфорилирования белков для удержания воды в клетках растений.
Практическая значимость работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание физиологе - биохимических механизмов, лежащих ї основе регуляции клеточной активности растений.
Выявленная роль цАМФ, Са ,активируемого ими фосфорилирования белков и связанных-с этим процессов транспорта воды и ионов является базой для создания более эффективных биотехнологических приемов выращивания растений из каллусов и культуры клеток,повышения устойчивости сельскохозяйственных культур к низким температурам и другим видам стрессоров.
Полученные результаты использовались в учебном процесса при чтении лекций на кафедрах физиологии и биохимии Казанского гос. университета, а также на кафедре промышленной биотехнологии Казанского технологического университета. На защиту выносятся следующие положения:
-
В клетках растений функционирует цАМФ-мессенджерная система регуляции метаболизма. Это положение обосновывается фактами нахождения активности аденилатциклазы и цАМФ-зависимых протеинкиназ и фосфопротеинфосфатаз в клетках высших растений и ее частях, а также обнаружением цАМФ-зависнмого фосфорилирования белков в тканях растений при действии различных факторов.
-
В механизмы действия фитогорконов включена цАМФ- мэссенджэр-ная система; она тесно связана с Саг+-полифосфоинозитольной мессенджернои системой.
-
В приспособительных реакциях растений на действие стресс-факторов принимает участие цАМФ-зависимое фосфорилирование бел-
ков, которое включено в механизмы действия фатогормона АБК. 4. цАМФ- мессенджэрная система принимает участие в регуляции
физиологических функций клеток растений - транспорте воды и
Саг* Апробация работы, Материалы диссертации доложены на Всесоюзном симпозиуме "Водный режим растений в связи с разными экологическими условиями" СКазань, 1976), на Международных конференциях "Бода и ионы в биологических системах" СРумыния, Бухарест, 1080, 1934, 1987), "Вода и зодннэ растворы в биологических системах" (Югославия, Блед, 1931), на 7 я 8 Всесоюзных симпозиумах походному режиму растений СКиев, 1981; Ташкент, 1984), на II В^есота-ной конференции "Биосинтез целлюлозы" СКазань, 1983), на У Всесоюзном биохимическом съезде СКиев,1986), на 17 съезде Федерации Европейских биохимических обществ (Зап.Берлин, 19S5), на 14-м Международном Конгрессе биохикаксв СЧССР, Прага, 1988), на 6-м Конгрессе Федерации Европейских обществ физиологов растений (Югославия, Сплит, 1988), на Всесоюзной конференция "Регуляторы роста и развития тзастеняй (Клев, 1988), на X объединенной симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР (Ташке&т,1839), на Всесоюзном совещании "Ионный транспорт и регуляция функций клетки" (Ленинград, 1990), на II съезде ВОФР (Минск, 19S05, на симпозиуме стран СНГ "Пути передачи внеклеточного сигнала"'СЗвенигород, 1993), на 3-м съезде ЕО'Р (С.-Петербург, 1993), на семинарах и итоговых научных конференциях КНЦ РАН (Казань, 1976-1993). Публикация. По материалам диссертации опубликовано 44 работы. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 318 страницах машинописного текста Свключая иллюстрации и список литературы) и состоит из введения, трех глав, заключения и выводов. В работе представлены: 51 таблица, 59 рисунков, 4 фотографии. Список литературы включает 529 наименований,из них 348 на иностранных языках
Основные исследования выполнены на корнях и зеленых листьях гороха и бобов,зеленых проростках пшеницы, этиолированных проростках гороха, кояеоптелях кукурузы,выращенных в лабораторных условиях на 1/4 среды Хогланда-Арнона под люминостатом (или в темноте) и культуре одноклеточной водоросли Chlaaydomonas "rein-chardiii CW-15.
Анализ содержания цАМФ в тканях растений и его секреции в
среду проводился с применением метода изотопного разведения с использованием цАМФ-связывающего белка фирмы "AmershanTCАнглия) или "Алга" (С.-Петербург) согласно Gilman С1970). Гомогенаты тканей, инкубационные среды перед определением очищались с помощью колоночной : хроматографии с применением ионообменной смолы Дауэкс 50Wx8 или 1x8 С200-400 меш) в форме катионита и высушенной AlpOg, нейтральной по Брокману П. Воздействие физиологически активных соединений проводилось при инкубации целых проростков, отрезанных стеблей или корней растений, клеток водорослей (или изолированных протопластов) за различные промежутки времени.
Активность аденилатциклазы определяли в гомогенатах из тканей растений двумя методами: с помощью а **Р-АТФ (White, Zenser, 1971) и с помощью цАМФ-связывающего белка (Авдонин,Ткачук,1978).
Протеинкиназная активность определялась во фракциях гомоге-ната (супернатант и осадок 20 000 g после 3-минутного центрифугирования) согласно Kikkawa et al.(1983) в модификации Алахова и др.(1986) в присутствии различных эффекторов.Удельную активность ферментов выражали в пмолях 3 Р ка мг белка в минуту. Белок определяли по Лоури в осадках ТХУ. После определения активности фермента часть реакционной смеси использовали для электрофореза согласно Laemmli (1970) в ПААГ с 0,1% ДДС-На с линейным градиентом 6-16% акриламида.Радиоавтографию получали при экспозиции геля 14 дней при -20С, гели и радиоавтографы сканировали на денситог-рафе LKB'2202 ("LKB", Швеция).
Фосфорилирование белков in vivo проводилось за 2 часа инкубации на слабом рассеянном свету отделенных стеблей с листьями или целых проростков в растворах с Р-ортофосфорной кислоты и эффекторов.Затем ткани быстро гомогенизировались,учитывалось по-глощение Рн проростками и фосфорилирование белков. Разделение фосфорилированных белков проводили методом электрофореза по Laemmli (1970) с последующей ргдиоавтографией.
Для изучения поглощения Са использовали изотоп Са и культуру одноклеточной водоросли Chlamydomonas г. CW-15 "Сштамм без клеточной стенки) из коллекции ИФР им. Тимирязева, которая любезно была предоставлена нам М.Г.Владимировой (Владимирова, Маркелова,1980). Радиоактивность просчитывали на счетчике "Дель-та-300" (США).
Транспорт воды изучали рефрактоыетрическим методом (Гусев, 1964) с модификациями.
Опыты проводились в 3-х биологических повторностях от 3 до
- 9 -Э раз. Экспериментальные данные обрабатывали статистически. Критерия достоверности определяли при уровне значимости Р <0,01 доверительного интервала. В диссертации приводятся значения биологических повториостей и 'средние ошибки.
В работе использовали наборы для определения цАМФ фирмы "Amersham" (Англия), "Алга" (С.-Петербург); для определения про-теинкиназной активности использовали у-жР-АТФ (удельная активность 1000 Кори ммоль-1) фирмы "AmershanT и ГО "изотоп" (Ташкент); для фосфорилирования белков in vivo использовали Р-ортофосфорную кислоту (удельная активность 5000 Кюри-ммоль-1) ГО "изотоп". МдС12 "ВДН" (Англия), PIPES, ДТТ, ЭГТА, цАМФ, SJ5S, акри ламид и бис-акриламид, Кумасси R-250, PMSF, белковый ингибитор цАМФ-зависимых протеинкиназ (БЮ фирмы "Serva", с удельной активностью 3 пмоль/мг белка в мин. БИ - также фирмы "Алга" (С.-Петербург), вазопрессин "Calbiochem", тритон Х-100 "Ferak",cora волъ-фрамата, молибдата, ванадата отечественные, хч; CaClg.NaCl, КС1, Са(Ш^)2 - хч, перекристаллизованные.
