Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1 .Салициловая кислота, общая характеристика 8
1.1.1. История открытия 8
1.1.2. Биосинтез салициловой кислоты 9
1.1.3. Содержание салициловой кислоты в тканях растений 12
1.1.4. Салициловая кислота и защита от биотического стресса 13
1.1.5. Участие салициловой кислоты в сигнальной трансдукции 19
1.1.6. Роль салициловой кислоты в генерации АФК 21
1.2. Роль салициловой кислоты в программируемой клеточной смерти 24
1.2.1. Общие характеристики программируемой клеточной смерти растений и животных 24
1.2.2. Участие салициловой кислоты в реакции сверхчувствительности 28
1.2.3. Роль салициловой кислоты у мутантов со спонтанной клеточной гибелью 30
1.2.4. Программируемая клеточная смерть, вызванная применением экзогенной салициловой кислоты 33
1.3. Явление индуцируемой термотолерантпости 35
1.4. Белки теплового шока 36
1.4.1. Семейство Clp/Hsp 100 37
1.4.2. Белки семейства Hsp90 40
1.4.3. Белки семейства Hsp70 40
1.4.4. Шаперонины (семейство Hsp60) 42
1.4.5. Низкомолекулярные БТШ 43
1.4.6. Регуляция экспрессии БТШ 44
1.5. Взаимодействие между салицилат-опосредованпыми сигнальными путями и ответами на действие повышенных температур 47
1.5.1. Влияние салициловой кислоты на устойчивость к повышенным температурам 50
1.5.2. Влияние салициловой кислоты на синтез БТШ 52
1.5.3. Взаимодействие ответов на действие повышенных температур и атаку патогенов 52
1.6. Роль митохондрий в стрессовых ответах 53
1.6.1. Роль митохондрий в синтезе БТШ 53
1.6.2. Влияние салициловой кислоты на функционирование митохондрий 56
1.7. Выводы из обзора литературы 59
2. Материалы и методы 61
2.1. Объект исследования 61
2.2. Температурные обработки 61
2.3. Обработка клеток салициловой кислотой, ингибиторами и разобщителями ЭТЦ..62
2.4. Методы оценки жизнеспособности клеток 62
2.4.1. Определение жизнеспособности клеток по восстановлению ТТХ 62
2.4.2. Окрашивание мертвых клеток 63
2.5. Выделение суммарного белка 63
2.6. Электрофорез в ПААГе с ДДС-Na 64
2.7. Окрашивание и обесцвечивание гелей 65
2.8. Вестерн-блотинг 65
2.9. Использованные антитела 66
2.10. ОТ-ПЦР-анализ 67
2.10.1. Выделение РНК 67
2.10.2. Денатурирующий РНК электрофорез 67
2.10.3. Синтез кДНК 67
2.10.4. Электрофорез в агарозном геле 68
2.11. Определение дыхательной активности 68
2.12. Микроскопические методы (флуоресцентная и световая микроскопия) 69
2.13. Определение содержания эндогенной салициловой кислоты 69
2.14. Статистическая обработка данных 70
3. Результаты 71
3.1. Влияние экзогенной салициловой кислоты на жизнеспособность культуры клеток Л. thaliana 71
3.1.1. Влияние длительной обработки салициловой кислотой на культуру клеток A. thaliana 71
3.1.2. Действие салициловой кислоты на движение цитоплазмы 75
3.1.3. Действие салициловой кислоты на морфологическую структуру клеток 76
3.1.4. Влияние предобработки мягким тепловым стрессом на жизнеспособность клеток, обработанных салициловой кислотой 77
3.2. Влияние салициловой кислоты на культуру клеток A. thaliana при мягком тепловом стрессе 79
3.2.1. Влияние кратковременной обработки салициловой кислотой на жизнеспособность клеток A. thaliana 79
3.2.2. Влияние салициловой кислоты на развитие индуцированной термотолерантности и синтез БТШ 81
3.3. Влияние салициловой кислоты на функции митохондрий 87
3.3.1 Изменение интенсивности поглощения кислорода в присутствии салициловой кислоты 87
3.3.2. Влияние салициловой кислоты на изменение потенциала внутренней митохондриальной мембраны 89
3.4. Экспрессия стрессовых генов при действии салициловой кислоты и мягкого теплового стресса 91
3.4.1. Действие салициловой кислоты на экспрессию стрессовых генов 91
3.4.2. Изучение экспрессии наметакаспазы МСЗ 94
3.4.2.1. Экспрессия гена МСЗ после инкубации клеток в условиях жесткого теплового шока 94
3.4.2.2. Экспрессия гена МСЗ в условиях мягкого теплового стресса 95
3.4.2.3. Экспрессия гена МСЗ при нарушениях митохондриальных функций 97
3.5. Сравнение динамики изменения потенциала на внутренней митохондриальной
мембране и эндогенного уровня салициловой кислоты при мягком тепловом стрессе .98
4. Обсуждение 101
4.1. Мягкий тепловой стресс способствует защите клеток от летального действия салициловой кислоты 101
4.2. Салициловая кислота вызывает ингибирование индуцируемой термотолерантности 104
4.3. Салициловая кислота активирует экспрессию гена метакаспазы МСЗ 108
4.4. Салициловая кислота посредством действия на митохондрии может менять экспрессию стрессовых генов 114
Выводы 120
Список литературы 121
Приложения 149
- Общие характеристики программируемой клеточной смерти растений и животных
- Взаимодействие между салицилат-опосредованпыми сигнальными путями и ответами на действие повышенных температур
- Влияние предобработки мягким тепловым стрессом на жизнеспособность клеток, обработанных салициловой кислотой
- Салициловая кислота вызывает ингибирование индуцируемой термотолерантности
Введение к работе
Известно, что температура — один из самых быстро меняющихся факторов окружающей среды. Большинство районов на Земле подвержены суточным колебаниям температуры, амплитуда которых может достигать десятков градусов, и эти изменения могут происходить в течение нескольких часов. Повышенная температура является одним из самых распространенных неблагоприятных факторов окружающей среды. По причине высокой температуры и засухи происходят большие потери урожаев, поэтому исследование механизмов устойчивости к тепловому стрессу имеет большое практическое значение и до сих пор остается актуальной задачей. і
Тепловой стрессор - фактор, действующий на все группы организмов, будь то бактерии, растения, грибы или животные. Общая черта ответа всех организмов на тепловой стрессор заключается в том, что предобработка мягкими температурами способствует выдерживанию организмом последующей летальной температуры. Это явление было названо «индуцируемой термотолерантностью». Устойчивость растений к тепловому стрессу во многом определяется белками теплового шока (БТШ). Структура и функции БТШ на сегодняшний день изучены довольно хорошо, однако в механизмах регуляции их синтеза до сих пор остается много неясного.
Растения, в силу своей природы, постоянно подвергаются действию различных неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе изменениям температуры. Из-за невозможности их избежать, растения должны быть хорошо приспособлены и быстро реагировать на изменения температуры. Митохондрии считаются основными сенсорами клеточного повреждения. На данный момент в литературе показана несомненная роль участия., как растительных, так и животных митохондрий в развитии I-программируемой клеточной смерти (ГЖС). Ранее на дрожжах и культуре клеток Arabidopsis thaliana было показано, что митохондрии арабидопсиса посредством изменения потенциала на внутренней митохондриальной мембране (mtAij/) регулируют экспрессию генов БТШ в условиях мягкого теплового стресса (Rikhvanov et al., 2007). Этот вывод подразумевал существование эндогенного соединения, способного модулировать функциональное состояние митохондрий клетки при стрессе. В случае растительных организмов этому условию может отвечать салициловая кислота (СК). СК является важной сигнальной молекулой в развитии устойчивости к биотическому стрессу. Известно, что СК во время атаки патогенов быстро накапливается в клетках, индуцируя программируемую клеточную смерть (ПКС) вокруг пораженного участка, так называемый сверхчувствительный ответ (СВЧ)^ и способствует формированию v пролонгированной системной приобретенной устойчивости (СПУ) к широкому спектру последующих инфекций (Mur et al., 2007). Также имеются данные о положительной роли СК в развитии устойчивости и к абиотическим стрессам, например, к тепловому. К настоящему времени накоплены достаточно обширные сведения о роли СК в защите от инфицирования патогенами. В то же время имеется относительно немного работ о действии СК на состояние митохондрий. Так, в литературе имеются сведения о влиянии СК на интенсивность поглощения кислорода, активацию альтернативной оксидазы (АО). Показано, что СК может действовать как разобщитель и ингибитор дыхания и окислительного фосфорилирования у табака (Xie, Chen, 1999; Maxwell et al., 2002; Norman et al., 2004). Также показано, что СК снижает уровень АТФ (Xie, Chen, 1999; Maxwell et al., 2002). Известно также, что в ответ на СК активируется экспрессия большого числа генов. Существует предположение, что СК может менять экспрессию генов посредством воздействия на митохондрии (Maxwell et al., 2002).
В связи с этим, целью настоящей работы было изучение влияния экзогенной СК на экспрессию стрессовых генов в культуре клеток Arabiclopsis thaliana в зависимости от её способности снижать потенциал на внутренней митохондриальной мембране.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Определить влияние салициловой кислоты на жизнеспособность культуры клеток A. thaliana.
Исследовать влияние экзогенной салициловой кислоты на развитие индуцируемой термотолерантности у культуры клеток A. thaliana.
Выявить влияние салициловой кислоты на потенциал на внутренней митохондриальной мембране и дыхательную активность клеток.
Изучить экспрессию стрессовых генов (генов БТШ; генов, продукты которых локализуются в митохондриях; генов, продукты которых, предположительно, связаны с ИКС) в зависимости от изменения потенциала на внутренней митохондриальной мембране.
Общие характеристики программируемой клеточной смерти растений и животных
Эукариоты в процессе эволюции выработали механизм клеточного самоубийства, называемый программируемой клеточной смертью/гибелью клеток (ПКС/ПКГ). У многоклеточных организмов (растений и животных) организованная гибель клеток необходима для процессов морфогенеза, при эмбриональном развитии, для удаления ненужных структур, повреждённых или инфицированных клеток (Beers et al., 2001).
ГЖС — это регулируемая форма гибели клетки, являющаяся результатом реализации ее генетической программы или ответом на внешние стимулы, и требующая затрат энергии и синтеза макромолекул de novo (Ярилин, 2003). ПКС является активным процессом и может начаться с изменения факторов жизнедеятельности, недостатка гормонов и ростовых факторов (Stupack, Cheresh, 2003). Этот процесс наиболее хорошо изучен у животных (Desagher, Martinou, 2000) и применительно к ним употребляется термин «апоптоз».
ПКС сопровождается набором определённых, характерных только для этого типа смерти, морфологических признаков и молекулярных процессов (маркеров ПКС), подтверждающих активный характер гибели. Так, для животных клеток были выявлены характерные признаки апоптоза, позволяющие отличить его от других процессов гибели, например, некроза: переход фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный монослой (Fadok et al., 2001), выход цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму (Yang et al., 1997), активация цистеиновых протеиназ (каспаз) (Yuan et al., 1993), образование АФК, сморщивание цитоплазматической мембраны, уменьшение объема клетки, разрывы ДНК в межнуклеосомальных участках (ДНК-ладдеринг) (Ярилин, 2003), конденсация хроматина по периферии ядра (маргинация), последующий распад ядра на части, фрагментация клеток на везикулы с внутриклеточным содержимым - апоптотические тельца (Ярилин, 2003), падение потенциала внутренней митохондриалыюй мембраны (mtA\/), зависимость от уровня АТФ в клетке (Nicotera, Melino, 2004).
У растений охарактеризовано несколько примеров ИКС — это гиперчувствительный ответ, терминальная или необратимая дифференциация, например, развитие трахеальных элементов у сосудистых растений (Fukuda, 1994), старение, эмбриогенез (Beers et al., 2001). Также растительные клетки, подобно животным, могут отвечать на различные абиотические стрессы запуском программируемой клеточной смерти (Lam, 2004).
У ПКС растений и животных имеется общие черты. Изменения в морфологии растительных клеток при ПКС во многом сходны с изменениями в животных клетках. Наблюдается конденсация хроматина и часто фрагментация ядра, протопласт сжимается, цитоплазматическая мембрана образует складки, в клетку устремляется поток Са2+, в наружном монослое плазматической мембраны появляется фосфатидилсерин, происходит олигонуклеосомальная фрагментация ядерной ДНК, происходит разрыв плазмодесм - мембранных каналов, соединяющих протопласты соседних клеток (Reape, McCabe, 2008), чтобы возможная инфекция не распространилась из заражённой клетки в соседние.
Отличительной особенностью ПКС растений является способ утилизации мертвых клеток. Если конечным результатом ПКС животных (в случае классического апоптоза) является разрушение клеток с образованием апоптозных везикул, фагоцитируемых макрофагами и соседними клетками, то у растений дело обстоит иначе. Формирование апоптозных везикул, образующихся при дроблении протопласта, происходит не всегда, поскольку из-за отсутствия фагоцитоза у растений в их появлении нет особой необходимости, а содержимое протопласта разрушается с помощью гидролитических ферментов до мономерых остатков, которые утилизуются соседними клетками (Самуилов, 2001). Кроме того, отсутствие апоптотических телец часто связывают с наличием клеточной стенки (Mur et al., 2007). А вместо самоуничтожения на основе погибших клеток зачастую создаются конструкции, жизненно важные для растений.
У животных митохондрии играют важную роль в ПКС. В ответ на апоптозные стимулы наблюдается пермеабилизация внешней митохондриальной мембраны; проапоптозный белок Вах семейства Вс1-2 формирует поры во внешней митохондриальной мембране и запускает выход цитохрома с. (Kaufmann, Hengartner, 2001). Ключевой шаг апоптоза у животных — это выход цитохрома с в цитозоль, где он активирует каспазный каскад (Thornberry, Lazebnik, 1998; Wolf, Green, 1999).
Каспазы - это семейство цистеиновых протеаз семейства СИ (CD) со специфичностью к остатку аспарагиновой кислоты, которые активируют клеточную смерть у различных групп животных, таких как млекопитающие, нематоды, насекомые (Shi, 2002). Сигналы ПКС у животных запускают самопроцессирование неактивных каспазных зимогенов (прокаспаз). Эта необратимая активация запускает протеолитический каскад ферментов, участвующих в клеточной смерти (del Pozo, Lam, 1998; Watanabe, Lam, 2004). Каспазы работают в виде каскада, в котором ипициаторные каспазы взаимодействуют со специфичными адапторными молекулами, чтобы облегчить их автокаталитический процессинг и далее активируют каспазы-исполнители. (Thornberry, Lazebnik, 1998). Каспазы гидролизуют пептидные связи на С-концевой стороне аспарагагиновой кислоты, так называемое Р1 основание (del Pozo, Lam, 1998).
Сходство ПКС животных и растений заставляло искать растительные каспазы. Первоначальные работы давали сведения, поддерживающие теорию о существовании растительных каспаз (Rotari et al., 2005). Несмотря на то, что не выявлено явных гомологов каспаз у растений, данные литературы свидетельствуют о наличии каспазо-подобной активности у растений (Sanmartin et al., 2005), которая в некоторых случаях связана с выходом цитохрома с из митохондрий (Zuppini et al., 2006).
У растений выделяют 5 классов протеаз: сериновые (ЕС 3.4.21), цистеиновые протеазы (ЕС 3.4.22), аспарагиновые эндопептидазы (ЕС 3.4.23), металлопротеазы (ЕС 3.4.24), и треониновые протеазы (ЕС 3.4.25) (Zuppini et al., 2006).
Взаимодействие между салицилат-опосредованпыми сигнальными путями и ответами на действие повышенных температур
Влияние салициловой кислоты на устойчивость к повышенным температурам СК является сигнальной молекулой, влияющей на широкий спектр физиологических процессов. Эндогенные изменения уровня СК или привнесение ее извне влияют не только на экспрессию генов защиты от биотического стресса, но также на экспрессию генов, участвующих в энергетическом обмене (яркий пример этому активация АО СК), процессах клеточной гибели, защите клеток от различных абиотических стрессов. Поэтому роль СК в клетках растений не ограничивается защитой от патогенов. СК также может участвовать в развитии устойчивости и к абиотическим стрессам, таким как: УФ-облучение, озон, охлаждение (Senaratna et al., 2000). Обработка СК приводила к локальной защите тканей растений табака и огурца при окислительном стрессе, вызванного паракватом и медной кислотой (Strobel, Кис, 1995). Также предобработка СК защищала растения томата при солевом, осмотическом и холодовом стрессе (Szepesi et al., 2005). Показано, что СК способствует повышению устойчивости к некоторым абиотическим факторам через поддержание окислительно-восстановительного статуса клетки и возможности выполнения антиоксидантных программ (Sharma et al., 1996). Также показано, что СК может активировать глутатион-8-трансферазы - ферменты, участвующие в защите клеток от АФК (Chen et al., 1996).
Что касается действия повышенных температур, то показано, что СК способствует развитию устойчивости к ним (Dat et al., 1998; Larkindale, Knight, 2002). Обработка экзогенной СК горчицы (Dat et al., 1998), арабидопсиса, (Larkindale, Knight, 2002), винограда, картофеля (Lopez-Delgado et al., 1998), бобов и томатов (Senaratna et al., 2000) приводит к развитию устойчивости при жестком тепловом стрессе. Максимальная термоустойчивость проростков, обработанных СК, наблюдалась от 1,5 до 4 часов (Dat et al., 1998).
По данным Dat с соавт. (1998) СК способствовала повышению термоустойчивости в низких концентрациях лучше (0,01-0,1 мМ), чем в высоких (0,5-1 мМ) (Dat et al., 1998). Lopez-Delgado с соавт. (1998) в опытах по акклимации микрорастений картофеля в условиях теплового стресса использовали АСК, которая также способствовала повышению устойчивости в низких концентрациях (0,001-0,01 мМ) (Lopez-Delgado et al., 1998).
Данные о повышении термоустойчивости при обработке СК изначально были получены на двудольных растениях. Работы по однодольным растениям появились несколькими годами позже. Показано, что СК способствовала повышению термоустойчивости мятлика лугового (Роа pratensis L.) (Не et al., 2005), стелящегося бентграса (Agrostis pahistris Hiids.) (Larkindale, Huang, 2004) и овсяницы тростниковой (Festuca arundinacea Schreb.) (Larkindale, Huang, 2004). He с соавт. (2005) показали, что причиной СК-индуцируемой термотолерантности является увеличение активности каталазы и СОД, которые помогают справиться с АФК (Не et al., 2005), хотя у двудольных растений СК является ингибитором каталазы (Chen et al., 1993; Ruffer et al., 1995). Таким образом, с одной стороны СК является инициатором окислительного взрыва, а с другой — активирует ферменты, помогающие с ним справиться.
Известно, что эндогенная СК может накапливаться в растениях не только в ответ на биотический стресс, но и в ответ на другие стрессы. Известно, что аккумуляция СК в листьях табака может быть индуцирована Н2Ог (Leon et al., 1995). Показано, что эндогенная СК накапливается при обработках, вызывающих окислительный стресс, таких как УФ-облучение у табака и обработка озоном у табака и арабидопсиса (Sharma et al., 1996). Экспрессия NAHG в трансгенных растениях делала их более чувствительными к повреждению озоном (Sharma et al., 1996).
Мягкий тепловой стресс также сопровождается кратковременным повышением уровня эндогенной СК (Kaplan et al., 2004; Suzuki et al., 2008). Dat с соавт. показали, что прогрев проростков горчицы приводил к заметному накоплению СК (Dat et al., 1998). Содержание эндогенной СК в листьях винограда повышалось в 4 раза через час после начала инкубации растений при 38С, а через сутки возвращалось на исходный уровень, причём этот подъём в содержании СК происходил за счёт свободной, а не гликозилированной СК (Ван и др., 2005). Suzuki с соавт. (2008) показали, что при действии повышенной температуры (38С) происходит увеличение эндогенной СК в течение 10 мин, через 30 мин её уровень уже возвращается до уровня контроля, однако далее уровень СК продолжает снижаться и спустя ещё 30 мин он становится ниже своего исходного уровня (Suzuki et al., 2008).
Защитные ответы растений на тепловой стресс обеспечиваются синтезом БТШ. СК, оказывая влияние на термотолерантность, может воздействовать и на синтез БТШ.
Известно, что СК участвует в развитии как базовой, так и индуцируемой термотолерантности (Dat et al., 1998; Lopez-Delgado et al., 1998; Larkindale, Knight, 2002). Показано, что экзогенная СК может вызывать экспрессию генов БТШ (Бурханова и др., 1999). Известно , что предобработка СК и аспирином приводит к повышению тепло-индуцированной экспрессии Hsp70 у млекопитающих и растений (Fawcett et al., 1997; Cronje et al., 2004). Увеличение уровня Hsp70 в ответ на экзогенную СК наблюдалось на протопластах табака (Cronje et al., 2004), проростках арабидопсиса (Snyman, Cronje, 2008). Также показано, что БТШ синтезировались в ответ на добавление СК и аспирин в отсутствии теплового шока (Neuhaus-Steinmetz, Rensing, 1997).
Что касается литературных данных при исследовании изменения синтеза БТШ, непосредственно участвующих в ИТ, то одни авторы показали, что СК индуцирует синтез БТШ 17.6, правда ниже, чем при тепловом стрессе (Clarke et al., 2004). Другие авторы, наоборот, показали, что СК снижала индукцию Hspl7.6 при тепловом шоке (Cronje, 2002). Есть работы, в которых показано, что СК ингибирует экспрессию индуцируемых тепловым шоком генов у дрожжей (Giardina, Lis, 1995) и у Drosophila melanogaster (Winegarden etal., 1996).
Влияние предобработки мягким тепловым стрессом на жизнеспособность клеток, обработанных салициловой кислотой
Известно, что БТШ играют важную роль в ответе клетки на тепловой стресс. Развитие устойчивости к жесткому тепловому шоку, вызванной мягким тепловым стрессом, во многом определяется повышением уровня синтеза HsplOl (Queitsch et al., 2000) и нмБТШ, к которым относятся белки Hspl7.6 (Wehmeyer et al., 1996). На настоящий момент известно, что в геноме арабидопсиса идентифицировано 2 гена, гомологичных по своим последовательностям HSP101: ClpB-m/ClpB2 (At2g25140) и С1рВ-р (At5gl5450). Судя по последовательностям транзитного пептида, С1рВ-т и С1рВ-р имеют митохондриальную и хлоропластную локализацию, соответственно. Позже их локализация была подтверждена с помощью GFP-конструкции (Lee et al., 2007). Было предположено, что ингибирующий эффект СК на индуцированную термотолерантность (рис. 3.8) может объясняться ее способностью подавлять индукцию синтеза БТШ при мягком тепловом стрессе.
Для проверки этого предположения в суспензионную культуру клеток арабидопсиса добавляли СК в концентрациях: 0,1; 0,25; 0,5 и 1 мМ, инкубировали в течение 120 мин при температуре 26 и 37С, после чего пробы замораживали в жидком азоте. Накопление транскриптов соответствующих генов анализировали с помощью полуколичественного ОТ-ПЦР анализа. Результаты, представленные на рисунке 3.9а, показали, что СК в концентрациях 0,1; 0,25 и 0,5 мМ не оказывала влияния на экспрессию HSP101, его гомологов (С1рВ-т и С1рВ-р), а также HSP 17.61 при обычной температуре инкубации (26С). Мягкий тепловой стресс (37С 120 мин) активировал экспрессию БТШ HSP101 и HSP 17.61, при этом уровень HSP60 не менялся. Экспрессия С1рВ-т и С1рВ-р активировалась при 37С аналогично HSP101. При используемой в экспериментах температуре 37С у гомологов HSP101 наблюдалось нарушение сплайсинга, так называемое удержание интронов. Амплифицированный фрагмент гена С1рВ-р с используемых нами праймеров включает в себя 2 интрона, поэтому при 37С наблюдалась лестница из всех 4-х форм (от полностью сплайсированной формы, до формы, содержащей все интроны). Аналогичная картина наблюдалась и у С1рВ-т.
Экспрессия HSP101, как и его гомологов, также как и HSP 17.61, была полностью подавлена в присутствии 1 мМ СК (рис. 3.96). Экспрессия Hsp60 практически не менялась во всех вариантах эксперимента.
Полностью аналогичные результаты были получены при иммуноблоттинге с антителами против HsplOl, Hspl7.6, Hsp60 и Hsp70 (рис. ЗЛО). Мягкий тепловой стресс 37С индуцировал появление Hspl7.6 и HsplOl (К37), также увеличивал уровень Hsp70. При температуре 37С СК в минимальной концентрации (0,1 мМ) заметно снижала синтез HsplOl и Hspl7.6, а в концентрации 0,5 мМ почти полностью их подавляла. Что касается Hsp70, то в условиях мягкого теплового стресса наблюдалось некоторое его ингибирование.
Таким образом, мягкий тепловой стресс индуцирует экспрессию и синтез БТШ HSP101 и его хлоропластного и митохондриального гомологов, а также HSP17.61. Присутствие СК при мягком тепловом стрессе ингибирует тепло-индуцируемую экспрессию БТШ, чем может и объясняться подавляющий эффект СК на ИТ. Экспрессия HSP60 практически не менялась ни при каких используемых обработках - ни при добавлении СК, ни при тепловом стрессе, ни при совместном действии этих факторов. Гомологи HSP101 (ОрВ-т и С1рВ-р) во всех случаях экспрессировались аналогично HSP101, что говорит о возможной схожести их функций.
Известно, что при стрессовых воздействиях происходит общее угнетение синтеза белков. Нельзя было исключить, что эффект СК на экспрессию БТШ объясняется ее способностью подавлять общий синтез белка. Чтобы проверить, так это или нет, были использованы трансгенные линии арабидопсиса расы Nossern с конститутивным синтезом HsplOl: линия sense (S) и линия antisense (A) (Queitsch et al., 2000).
Салициловая кислота вызывает ингибирование индуцируемой термотолерантности
СК является сигнальной молекулой, индуцирующей развитие реакции СВЧ (Mur et al., 2007). В случае СВЧ предполагается, что накопление критической концентрации эндогенной СК в клетках запускает процессы клеточной гибели (Mur et al., 2007). Достоверно известно, что клеточная гибель в процессе СВЧ идет по механизму ПКС со многими характерными для неё чертами, такими как остановка цитоплазмы (Shimmen, 2004), ДНК-ладдернинг (Yao et al., 2002; Kiba et al., 2006; Тарчевский и др., 2008), падение mtA\/ (Yao et al., 2004), выход цитохрома с (Kiba et al., 2006), активация каспазной активности (del Pozo, Lam, 1998) и др. Накопление СК в клетке в концентрации меньше критической, индуцирующей СВЧ, приводит не к гибели клеток, а к активации программ, направленных на выживание: развитию СПУ (Hoeberichts, Woltering, 2002). Считается, что растение посредством изменения концентрации СК регулирует выполнение ПКС. В инфицированных участках ПКС происходит в местах накопления максимальной концентрации СК (Enyedi et al., 1992).
Показано, что применение экзогенной СК также может вызывать гибель клеток (Kawai-Yamada et al., 2004; Garcia-Heredia et al., 2008; Тарчевский и др., 2008). Однако действующие концентрации экзогенной и эндогенной СК, инициирующие СПУ или ПКС, различаются. Требуется значительно меньше эндогенной СК, чтобы запустить эти процессы. Так, экспрессия PR-белков и индукция СПУ у табака наблюдается при эндогенном уровне СК в концентрации несколько мкМ (0,5-1,5 мкМ) в обычных листьях инфицированного растения (Vernooij et al., 1994), тогда как для индукции сходного уровня устойчивости и экспрессии защитных генов экзогенной СК требуются на порядки большие концентрации (10 и более мкМ) и длительное время обработки. Индукция СВЧ у табака наблюдалась при концентрации эндогенной СК, равной приблизительно 70 мкМ (Enyedi et al., 1992), тогда для индукции ПКС требовалась обработка клеток экзогенной СК в концентрации 750 и более мкМ (Kawai-Yamada et al., 2004). Таким образом, сравнение действующих концентраций экзогенной и эндогенной СК не является корректным, потому что не принимается во внимание ряд важных факторов, влияющих на поглощение СК, метаболизм и компартментацию в растительных клетках. Кроме того, при длительных обработках нельзя не учитывать тот факт, что СК является довольно нестабильной молекулой и быстро разрушается. Известно также, что экзогенная СК быстро поглощается и выводится из клеток (Chen et al., 2001). Chen с соавт. (2001) показали, что более 85% поглощенной СК экскретировалось клеткой в течение 5 часов как Са2+-зависимым, так и Са2+-независимым способом (Chen et al., 2001). В связи с этим, очевидно, что для достижения физиологического эффекта требуется гораздо большая концентрация экзогенной СК, чем эндогенной (Xie, Chen, 1999).
Показано, что экзогенная СК может вызывать гибель клеток не только у табака, но и у арабидопсиса (Garcia-Heredia et al., 2008). Несмотря на то, что арабидопсис, как и табак, считается растением с низким конститутивным содержанием СК (Yu et al., 1997; McDowell, Dangl, 2000), тем не менее, эти два объекта различаются по чувствительности к экзогенной СК. В наших условиях обработка 1 мМ СК в течение 24 ч приводила к чуть менее 50%-ной гибели клеток A. thaliana (рис. 3.1), тогда как для индукции ПКС табака требовалось вдвое меньшее время инкубации (12-18 ч) и более низкая концентрация (0,75 мМ) (Kawai-Yamada et al., 2004). В нашем случае наиболее эффективная гибель клеток наблюдалась в случае обработки 5 мМ СК в течение 24 ч (рис. 3.1а, 3.2а), причем гибель клеток происходила в зависимости от времени инкубирования с СК (рис. 3.2). Аналогичные данные с использованием той же самой концентрации СК получены Garcia-Heredia с соавт. (2008) на культуре клеток арабидопсиса. Поэтому в дальнейшем для индукции гибели, мы также использовали 5 мМ СК.
По имеющимся в литературе данным СК вызывает клеточную гибель по типу ПКС, с характерными для неё чертами, такими как ДІЖ-ладдеринг (Robson, Vanlerberghe, 2002; Тарчевский и др., 2008), повышение каспазной активности и выход цитохрома с (Garcia-Heredia et al., 2008). В наших условиях гибель при действии СК развивалась во времени (рис. 3.2), сопровождалась остановкой цитоплазмы (см. табл.) и наблюдался один из характерных признаков ПКС — отставание цитоплазмы от клеточной стенки (рис. 3.3). Плазмолиз и дальнейшая конденсация протопласта у растений являются активными процессами и не проявляются у клеток, погибающих некротическим путём, так как вакуоль растительной клетки играет ведущую роль при проявлении конденсации протопласта. (Swidzinski et al., 2002).
Таким образом, СК может вызывать гибель клеток, которая, согласно данным литературы, определяется как программируемая. Предполагается, что ПКС, вызванная СК, происходит за счет накопления большого количества перекиси водорода, перекисного окисления липидов и окислительного повреждения белков (Rao, Davis, 1999). Перекись водорода сама по себе является индуктором ПКС, причем более эффективным по сравнению с СК (Garcia-Heredia et al., 2008).
На настоящий момент известно, что БТШ могут подавлять апоптоз у животных, вызванный различными стимулами, такими как тепловой шок (Вееге, 2004; Bettaieb, Averill-Bates, 2005; Didelot et al., 2006), УФ, хемотерапевтическими агентами, фактором некроза опухолей (TNF) (Вееге, 2004). Показано, что некоторые БТШ могут играть как анти-, так и проапоптозную роль (Didelot et al., 2006). Предполагается, что развитие ПКС растений и животных сопровождается синтезом Hsp60 (Xanthoudakis et al., 1999; Rikhvanov et al., 2007). У растений как про-, так и антиапоптозная роль БТШ практически не изучена. Показано, что инкубация культуры клеток арабидопсиса в условиях мягкого теплового стресса (37С), при котором синтезируются БТШ (HsplOl, Hsp70 и Hspl7.6 (I и II класса)), защищала от ПКС, вызванной жестким тепловым шоком (Rikhvanov et al., 2007).
