Содержание к диссертации
Введение
Раздел 1. Обзор литературы 9
Глава 1.1. Цитокинины и их роль в росте растения 9
1.1.1. Физиологическая роль цитокининов 9
1.1.2. Многообразие цитокининов 9
1.1.3. Модификации цитокининов 10
1.1.4. Синтез цитокининов 10
1.1.5. Деградация цитокининов 14
Глава 1.2. Система рецепции и передачи цитокининового сигнала... 15
Глава 1.3. Роль цитокининов в процессах старения 18
Глава 1.4. Взаимосвязь цитокининового и нитратного метаболизма.. 19
1.4.1. Влияние форм азота в питательной среде на развитие растений 19
1.4.2. Влияние азотного питания на метаболизм цитокининов20
1.4.3. Влияние неорганического азота на гены синтеза цитокининов 21
1.4.4. Влияние неорганического азота на уровень цитокининов 23
1.4.5. Влияние неорганического азота и цитокининов на регуляторы ответа 25
Глава 1.5. Ген ARR5 и его использование для определения
цитокининового статуса растения 28
Раздел 2. Глава 2.6. Материалы и методы 38
Раздел 3. Результаты и их обсуждение 46
Глава 3.7. Анализ применимости метода оценки уровня цитокининов по активности GUS в тканях растений Arabidopsis thaliana, трансформированных маркерным геном GUS под контролем цитокинин-зависимого промотора ARR5-TQHSL 46
Глава 3.8. Сравнительное изучение роста листьев и активности GUS 62
Глава 3.9. Влияние нитратного и аммонийного азота в питательной среде на рост и цитокинин-зависимую активность GUS в растениях Arabidopsis 76
3.9.1. Изменение активности GUS в растениях, голодающих по нитрату 76
3.9.2. Характеристика роста и активности GUS в листьях растений, выращенных на питательной среде, содержащей аммонийный или нитратный азот 80
3.9.3. Сравнительное изучение влияния на рост и активность GUS в растениях Arabidopsis thaliana солей аммония в концентрациях 20 и 2 мМ 90
Глава 3.10. Морфологические параметры и активность GUS в корнях растений Arabidopsis thaliana, выращенных на средах с различными источниками азота 98
Глава 3.11. Влияние экзогенных цитокининов на растения Arabidopsis thaliana, выращенные на среде с 2 мМ аммония в качестве единственного источника азота 118
Заключение 125
Выводы 126
Благодарности 128
Список литературы 129
Приложения 146
- Многообразие цитокининов
- Влияние неорганического азота на гены синтеза цитокининов
- Сравнительное изучение роста листьев и активности GUS
- Сравнительное изучение влияния на рост и активность GUS в растениях Arabidopsis thaliana солей аммония в концентрациях 20 и 2 мМ
Введение к работе
Цитокинины принимают участие в регуляции жизни растения на всех этапах онтогенеза от оплодотворения яйцеклетки до старения и смерти. Они участвуют в регуляции деления клеток (Skoog and Miller, 1957), дифференцировке хлоропластов, индуцируют стеблевой морфогенез, задерживают старение листьев (Кулаева, 1962), участвуют в регуляции транспорта метаболитов в растении; с их помощью корневая система -регулирует функциональную активность в надземных органах, в частности, в листьях (Кулаева, 1973, 1987; Мок and Мок, 2001).
О связи цитокининового метаболизма с нитратным питанием известно ещё с 1962 г. (Кулаева, 1962), когда было обнаружено, что нитрат, подаваемый через корни, изменяет реакцию растений на их обработку кинетином. В последнее десятилетие были локализованы гены синтеза цитокининов (AtlPTl—9), и показано, что ген AtIPT3 играет основную роль в синтезе цитокининов в растении в ответ на нитратное питание при азотном голодании, а ген АІЇРТ5 — в условиях достаточности источников азотного питания (Miyawaki et al., 2004; Takei et al., 2004a). Показно, что при добавлении нитрата к голодающим растениям накапливаются транспортные формы цитокинина в корнях, увеличивается их содержание в пасоке и активных форм цитокининов в листьях, где они вызывают накопление транскриптов регуляторов ответа (Takei et al., 2001b; Sakakibara et al., 1998).
Нитратная и аммонийная форма азота оказывают серьёзное влияние на морфологию растения. На многие растения, в том числе Arabidopsis thaliana, аммонийная форма азота в качестве единственного источника азота, действует негативным образом: угнетается рост побегов (Walch-Liu et al., 2000) и корней (Cao et al., 1993). Ингибирование роста в присутствии аммония приписывают нескольким причинам, одну из которых видят в недостатке нитрата как молекулы, связанной с метаболизмом цитокининов (Walch-Liu et al., 2000). Угнетению роста растений табака на аммонийном
азоте соответствовало снижение содержания в пасоке зеатина и его рибозида (Walch-Liu et al., 2000). Перенос растений томатов с раствора аммония на раствор с нитратом вызывал синхронную активацию роста листьев и содержания в листьях и пасоке зеатина и его рибозида (Rahayu et al., 2005). Это подчёркивает сигнальную роль цитокининов в активации роста листьев нитратным азотом.
Гены ARR являются генами-регуляторами ответа в гистидин-киназном цитокининовом сигналинге Arabidopsis. Ген ARR5 относится к ARR-генам группы А, которые характеризуются быстрым и специфическим ответом на активные формы цитокининов, среди которых гены ARR4, 5 и 6 являются наиболее чувствительными и информативными репортёрами цитокининового действия (Brenner et al., 2005). В 2000 году (D'Agoustino et al., 2000) было получено трансгенное растение с конструкцией ARR5..GUS, где репортёрный ген (3-глюкуронидазы находился под контролем промотора гена ARR5. При обработке цитокининами активировалась экспрессия ARR5 во всех тканях растения. Было показно, что экспрессия конструкции ARR5::GUS повышалась при обработке Arabidopsis thaliana возрастающими концентрациями бензиладенина (D'Agoustino et al., 2000; Romanov et al., 2002; Lopez-Bucio et al., 2007), а при снижении концентрации эндогенных цитокининов в результате трансформации растений геном оксидазы цитокинина уровень ^Т^^/.-Сгб^-активности снижался (Werner et al., 2003). Aloni с соавторами (Aloni et al., 2005) с помощью иммунолокализации показали, что участки высокой GUS-активности совпадают с участками высоких концентраций цитокининов. Таким образом, было доказано, что GUS-активность конструкции ARR5::GUS действительно отражает уровень активных цитокининов в растениях.
Однако до сих пор не проводилось систематических исследований, позволяющих установить изменение распределения цитокининов по растению в ходе его развития. Также не было данных, характеризующих это
распределение при выращивании растений на различных источниках азотного питания в течение длительного срока развития. Использование экспрессии ARR5::GUS конструкции, в которой ген репортёрного белка GUS находился под контролем цитокинин-зависимого промотора, предоставила хорошие методические возможности для выяснения этих вопросов.
Многообразие цитокининов
Впервые вещество с цитокининовой активностью было обнаружено в лаборатории F. Skoog a (Skoog and Miller, 1957). Оно представляло собой 6-фурфуриладенин и было названо кинетином, поскольку на фоне ауксина способствовало делению клеток. Кинетин был выделен как продукт деградации ДНК. Однако недавно было показано его присутствие в растениях (Ge et al., 2005). Природный цитокинин растений транс-зе&шн был открыт в 1964 г. (Letham, 1964). Позднее было показано широкое распространение в растениях транс-зеатина и его производных, а также других цитокининов аденинового ряда, обладающих сходной активностью: изопентениладенин (ИПА), дигидрозеатин, 6-бензиладенин (БА). Последний долгое время считался синтетическим аналогом природных цитокининов, а затем в растениях были обнаружены тополины — производные бензиладенина (Strnad et al., 1997). Похожей цитокининовой активностью обладает и другая группа веществ, которые являются производными мочевины (Мок and Мок, 1994). Долгое время г/г/с-зеатин считался веществом с пониженной биологической активностью, однако в последнее время выясняется его значение для некоторых растений, например, кукурузы (Yonekura-Sakakibara et al., 2004).
Для цитокининов характерны различные модификации (гликозилирование основания, гликозилирование изопентенильного "радикала, гидроксилирование и др., восстановление боковых фрагментов), которые обеспечивают образование неактивных транспортных и запасных форм цитокининов. Наибольшей активностью обладают свободные основания. Рибозиды и риботиды служат транспортными формами, а О-гликозиды имеют запасающую функцию (Мок and Мок, 1994; Мок and Мок, 2001).
Довольно долгое время не были известны растительные гены синтеза .цитокининов. Впервые фермент, осуществляющий их биосинтез, выделен Chen (Chen, 1981) и тогда же предложен путь их биосинтеза. Этот фермент (оказавшийся крайне нестабильным) превращал А -изопентенилпирофосфат (IPPP, он же диметилаллилдифосфат — DMAPP) и 5 -АМФ в N6-(A2-изопентенил)-аденозинмонофосфат и был назван изопентенилтрансферазой (IPT). В генной инженерии широко использовались гр/-гены бактериального фермента. В 2001 году независимо в двух лабораториях были наконец обнаружены растительные гены цитокининового синтеза. Takei с соавторами (Takei et al., 2001а) выделили из Arabidopsis 8 генов синтеза цитокининов, а .Kakimoto (Kaklmoto, 2001) — 9. Растительные IPT принадлежат к группе трансфераз с иной специфичностью, чем у фермента, открытого Chen, который, по-видимому, имел бактериальное происхождение: они катализируют перенос IPPP на АДФ и АТФ (Takei et al., 2001а; Kakimoto, 2001). Некоторые из них могут использовать в качестве субстрата АМФ (Kakimoto, 2001; Sakakibara, 2006), но с меньшей чувствительностью, чем АТФ/АДФ.
Цитокинины преобладают в активно делящихся тканях: корневая и стеблевые меристемы, молодые листья и проростки. Обычно ткани с высоким уровнем цитокининов считались сайтами цитокининового синтеза, основным местом синтеза цитокининов в растениях являются корни. Поступление веществ с цитокининовои активностью из корней в надземные органы в составе пасоки впервые было показано в 1962 г. в работе Кулаевой на растениях махорки (Кулаева, 1962). Kende установил, что цитокинины в пасоке подсолнечника представляют собою зеатин и его рибозид (Kende, 1964). Впоследствии транспорт цитокининов из корней в надземные органы в составе пасоки был показан на большом числе растений (для обзора см.: Кулаева, 1973). Транспорт цитокининов из корней в надземные органы с транспирационным током был блестяще доказан в опытах Aloni (Aloni et al., -2005), который, изменяя скорость транспирации, показал, что снабжение надземных органов цитокининами происходит по сосудам ксилемы из корней. Однако было выяснено, что гены ключевых ферментов биосинтеза цитокининов — изопентенилтрансфераз (IPT) экспрессируются у A. thaliana практически во всех органах и тканях растений, характеризуясь тканевой специфичностью для каждого гена (Miyawaki et al., 2004) и (Takei et al., 2004a). В работе (Miyawaki et al., 2004) изучалась экспрессия гена P-GUS под контролем промотора соответствующих генов IPT, в работе (Takei et al., 2004а) — экспрессия GFP под промоторами /РГ-генов. Эти работы -подтвердили экспрессию генов синтеза цитокининов в активно пролиферирующих тканях. А именно: AtlPTlr.GUS — экспрессия в клетках-предшественниках ксилемы в кончике корня, яйцеклетках, незрелых семенах. Предполагается, что он может свидетельствовать о наличии ксилемных предшественников на ранней стадии развития и служить их маркером. Данные воспроизведены в экспериментах с GFP; AtIPT2::GUS и AtIPT9::GUS не имели конкретной локализации экспрессии, но преимущественно экспрессировались в пролиферирующих тканях, участвуя в модификации по строго определённым адениновым основаниям т-РНК; AtIPT3::GUS экспрессируется во флоэме, эксперименты с использованием GFP более чётко локализовали флуоресценцию в клетках-спутницах и показали, что она не является результатом транспорта; AtIPT4::GUS и AtIPT8::GUS экспрессируются в незрелых семенах с высоким уровнем экспрессии в халазальном эндосперме, экспрессия обоих исчезает на стадии «сердца». Синтез цитокининов в это время, видимо, индуцирует приток ассимилятов к развивающемуся зародышу и быстрое деление клеток эндосперма; AtIPT5::GUS — экспрессия в корневых примордиях, столбике корневого чехлика, клетках перицикла, верхней части молодых зон цветения, зоне опадения плодов; AtIPT6::GUS — в работе (Miyawaki et al., 2004) его экспрессию обнаружить не удалось, что может быть связано с недостатками генной конструкции. В работе (Takei et al., 2004а) транскрипт AtIPT6 обнаружен в стручках; AtIPT7::GUS найден в эндодерме зоны растяжения корня, трихомах молодых листьев, некоторых пыльцевых трубках.
Влияние неорганического азота на гены синтеза цитокининов
Этот вопрос был изучен в работах (Miyawaki et al., 2004) и (Takei et al., 2004a). В работе (Miyawaki et al., 2004) было выявлено увеличение уровня экспрессии AtIPT3::GUS в ответ на помещение на сутки голодающих по N растений в питательную среду, содержащую KNO3, в отличие от сред, содержащих в виде источника азота NH4. При этом усиление экспрессии наблюдалось и при отделении побегов от корней и последующей обработке нитратом в течение суток. Количество транскриптов АИРТЗ увеличивалось за 1 час обработки нитратом, при этом циклогексимид не оказывал влияния на эффект, что свидетельствует о первичности воздействия нитрата на гены IPT. На другие гены цитокининового синтеза того же ряда такая обработка не влияла. Такая реакция АйРТЗ на приложение нитрата к голодающим по азоту растениям была подтверждена в работе (Takei et al., 2004а), в том числе с помощью мутанта с инсерцией в АґІРТЗ. В последнем случае уровень AtIPT3 снижался в 20 раз и почти исчезала нитрат-зависимая индукция его экспрессии.
В этих же экспериментах обнаружено, что накопление транскриптов AUPT5 в корнях положительно коррелирует с концентрацией N03 и NH4 в питательной среде. Уровни экспрессии остальных IPT, включая AtIPT3, были ниже в корнях растений, помещённых на среду с аммонием, нежели с нитратом. В побегах накопление AtlPTl, AtIPT5, АІЇРТ7 отрицательно коррелировало с содержанием азота в среде питания. В мутанте по АІЇРТЗ наблюдалось накопление АІЇРТ5 в корнях, которое продолжалось в течение 24 часов, тогда как в диком типе его экспрессия была слегка повышенной в течение 3 часов. АІЇРТ7 репрессируется нитратом в диком типе за 12 часов, но частично восстанавливается в мутанте с инсерцией в АІЇРТЗ.
Прямая индукция нитратом генов цитокининового биосинтеза была показана Wang с сотрудниками (Wang et al., 2004) с помощью микрочипов. Детектировалась только экспрессия AtIPT2, AtIPT3, AtIPT7, AtIPT9. При помещении голодающих по азоту растений в среду с нитратом реакция на него была показана только для гена AtIPT3, который сильно индуцировался в корнях и слабо — в побегах. Подобное явление наблюдалось как в случае нормального растения, так и в случае нуль-мутанта по нитрат-редуктазе (HP). Это доказывает, что индуктором в данном случае служила молекула нитрата, а не продукты его дальнейших превращений в организме.
Секвенирование гена АІЇРТЗ обнаружило, что в его промотере есть 2 элемента из 12 п.о., необходимых для активации транскрипции нитратом. .Подобный элемент найден и в гене нитратредуктазы Nia-І. У этих генов наблюдается сходная кинетика нитратной индукции, не нарушаемая циклогексимидом, что предполагает похожий механизм их активации (Hwang et al. 1997; Takei et al., 2004a).
Отсюда сделан вывод, что АІЇРТЗ и AtIPT5 играют основную роль в синтезе цитокининов в корнях, AtIPT3 — в побегах в ответ на азотное питание. АіІРТЗ быстро и специфически реагирует на появление азота в N-лимитированных условиях, в то время как АІЇРТ5 отвечает за синтез цитокининов в условиях достаточности источников азотного питания. Тот .факт, что в мутанте по АйРТЗ в ответ на нитрат накапливается AtlPTS, свидетельствует о некоторой взаимозаменяемости систем цитокининового биосинтеза. Для изучения цитокининового метаболизма анализ данных об экспрессии ІРТ-генов требует учёта данных об уровне цитокининов в разных органах, соотношению их форм и об их изменении под действием азотных сигналов.
В исследовании (Takei et al., 2001b) было установлено, что в корнях кукурузы при добавлении нитрата к голодающим по азоту растениям начинает накапливаться в течение часа изопентениладенозин-5-монофосфат (ІРМР). Его накопление двухфазно: в течение полутора часов после добавления нитрата его содержание увеличивается в 4 раза, затем через 4 часа снижается до начального уровня, после чего в течение 24 часов снова повышается. Накопление изопентениладенозина (ІРА) значительно не отличается у растений с разными азотными статусами, изопентениладенин (ІР) остаётся на низком уровне, не изменяясь. Количество форм z/wc-зеатина и дигидрозеатина лежит ниже детектируемого уровня. После 3—6 часов в корнях накапливается транс-зеатинрибозид-монофосфат (ZMP), транс-зеатин-рибозид (ZR) и транс-зеатпп (Z).
В мутанте с инсерцией в AtIPT3 (Takei et al., 2004a) нитрат-зависимое накопление цитокининов ІР- и tZ-тшіа в корнях было заметно ниже, чем в диком типе, вплоть до исчезновения. В растениях дикого типа содержание ZMP, ZR и Z (а также Z-O-глюкозида — ZOG) в этом случае увеличивалось. Под действием нитрата увеличивается скорость экссудации ксилемного сока, изменяется корневое давление и проницаемость корней для воды. В пасоке увеличивается концентрация цитокининов с преобладанием ZR. В исследовании (Takei et al., 2004а) в побегах сильно увеличивалось количество -цитокининов (максимум у ZMP), ZOG, iPR и ІРМР, а в мутанте по AtIPT3 увеличение сохранялось только в случае с -формами и ІРМР. В листьях после 4 часов предоставления растению нитрата накапливается преимущественно Z и продолжает накапливаться до 24 часов. Количество рибозидов Z-типа в листьях ниже и не изменяется. Накопление ІРМР приводит к снижению деградации цитокининов, поскольку нуклеотидные формы не расщепляются цитокинин-оксидазой. Данные о сниженном количестве цитокининов в мутанте по АІЇРТЗ подтверждают важность этого фермента, однако слабое повышение их уровня в ответ на нитрат свидетельствует в пользу заменяемости систем синтеза (Takei et al., 2004а). В срезанных листьях табака ионы аммония и нитрата индуцировали накопление Z в листьях, но для этого требовалось около 60 часов (Singh et al., 1992). Угнетению роста растений табака на аммонийном азоте -соответствовало снижение содержания в пасоке зеатина и его рибозида (Walch-Liu et al., 2000). Перенос растений томатов с раствора с NH на раствор с NO3 вызывал синхронную активацию роста листьев и содержания в листьях и пасоке зеатина и его рибозида (Rahayu et al., 2005). Это подчёркивает сигнальную роль цитокининов в активации роста листьев нитратным азотом. Эти данные позволяют выдвинуть предположение, что цитокинины Z-типа синтезируются в корнях в ответ на добавление к ним нитрата. При этом в корнях преобладает нуклеотидная форма. Затем усиливается транспорт цитокининов по ксилеме вместе с током воды, и здесь увеличивается концентрация рибозидной и риботидной форм цитокининов Z-типа. В листьях же появляется и накапливается активная негликозилированная форма, служащая сигналом для дальнейших процессов.
Сравнительное изучение роста листьев и активности GUS
Для того чтобы сравнивать изменения цитокинин-зависимой активности GUS в растениях при их развитии на средах, содержащих различные источники азота, вначале необходимо остановиться на том, как изменяется активность GUS при нормальном развитии.
На среде, не содержащей азота вообще или содержащей очень мало (сотые доли миллимоля), растения не развиваются и быстро погибают. Поэтому в качестве контрольной вначале была выбрана среда, содержащая в равных концентрациях нитрат и аммоний (по 10 мМ). Однако, растения, выращенные на такой среде, и растения, выращенные на нитрате (20 мМ) мало отличались друг от друга по морфологическому развитию и не отличались — по проявляемой активности GUS. Поэтому в качестве среды, служащей эталоном для сравнения и обеспечивающей нормальное развитие растений, была выбрана среда, содержащая нитрат в качестве единственного источника азота.
Концентрация в 20 мМ была выбрана потому, что она составляет примерно половинную долю нитратных солей среды Мурасиге и Скуга. Эта среда в половинной концентрации наиболее часто используется в литературе для выращивания Arabidopsis.
Метод, использующий для определения активности субстрат X-Gluc, дающий синее окрашивание в точках активной экспрессии, трудно поддаётся количественной оценке, что подробно проанализировано в главе 3.7. Тем не менее, в литературе показано, что при снижении количества активных цитокининов снижается интенсивность синей окраски, вызванной активностью GUS (Werner et al., 2003), а при увеличении содержания цитокининов в тканях увеличивается интенсивность и расширяются области этой окраски по органам (Werner et al., 2003; Aloni et al., 2005; Lopez-Bucio et al., 2007). Хорошую возможность для оценки степени окрашивания дала программа для анализа изображений (Пожванов и др., 2008). С её помощью удалось установить воспроизводимые закономерности динамики активности GUS при развитии отдельных органов растений и найти её отличия при различных условиях выращивания.
Для соблюдения стерильности и строгого состава питательной среды растения выращивали на твёрдых средах в чашках Петри. Жизненный цикл их, однако, при этом оказывался несколько короче, чем у растений, выращиваемых в почве. Возможно, это связано с истощением питательной среды по мере роста растений. Поэтому основные данные были получены для периода первых трёх-четырёх недель развития — до перехода растений к цветению.
В ходе работы была выявлена неоднородность имеющейся популяции трансгенных растений Arabidopsis по проявлению GUS-активности. Индивидуальные растения отличались по GUS-активности друг от друга в несколько раз, при этом различия наследовались. Причины различий пока не выявлены. Однако после того, как выяснилось, что такие различия существуют и наследуются, были получены чистые линии растений (растений, происходящих от одного предка), характеризующихся высокой и низкой GUS-активностью. В дальнейшем работа велась параллельно на двух этих линиях. Они обозначены следующим образом: линия с высокой активностью GUS — «В», линия с низкой активностью GUS — «Н».
Сравнение этих двух линий позволило установить общие для всей популяции закономерности изменения активности GUS. Отличие в суммарной активности GUS позволило на одной линии выявить свойства, малозаметные на другой. Поскольку активность GUS отражает уровень физиологически активных цитокининов, снижение её от черешка к жилкам более высоких порядков и окраска в гидатодах указывает на путь цитокининов в лист от черешка по сосудистой системе листа. Почти сразу после достижения листом максимального размера происходило значительное снижение активности GUS в пластинке (рис. 24В, Г; 25Г, Д; 26Д, Е; 27В, Г). Дольше всего активность GUS сохранялась в базальных областях листа, в сосудистой системе черешка и в гидатодах (рис. 24В, Г; 25Д; 26Г, Е; 27В, Г). Длительное сохранение активности GUS в тканях черешка может свидетельствовать об оттоке цитокининов из листовой пластинки.
Линия В отличалась высокой активностью GUS в мезофилле листьев, поэтому изменение активности GUS здесь прослеживается более отчётливо (рис. 27В). На растениях линии Н сильнее проявляется преобладание активности GUS в сосудистой системе, приуроченность её к областям гидатод и смещение с возрастом максимумов активности GUS с апикальных областей листа на базальные (рис. 25В—Д).
В целом данные, полученные на двух линиях, указывают на одинаковые закономерности: 1) преобладание активности GUS в проводящей системе, 2) увеличение активности GUS в ходе роста листа и 3) её снижение после прекращения роста листа.
Сходные закономерности проявлялись в семядолях (рис. 28) на обеих линиях (данные приведены для линии Н): наиболее высокая активность GUS в областях сосудистой системы (рис. 28В), значительное снижение активности GUS в пластинке после достижения семядолей максимального размера (рис. 28А, Б, В); активность дольше сохранялась в сосудистой -системе черешка и в гидатодах (рис. 28Б, В). Менее резко выражена стадия усиления активности GUS на ранних этапах роста семядолей.
Сравнительное изучение влияния на рост и активность GUS в растениях Arabidopsis thaliana солей аммония в концентрациях 20 и 2 мМ
Используемая в предыдущих экспериментах 20 мМ концентрация азотных солей в питательной среде была выбрана по двум причинам. Во-первых, из-за того, что она составляет приблизительно половинную концентрацию азотных солей среды Мурасиге и Скуга, использующуюся в большинстве исследований для выращивания Arabidopsis. Во-вторых, при такой концентрации ярко проявляется влияние аммония на растение. При.; выборе между сульфатной и хлоридной солью аммония предпочтения были отданы сульфатной соли, поскольку концентрация ионов хлора в 20 мМ могла бы оказаться слишком высокой и внести свои негативные тенденции при развитии растения Arabidopsis.
Мы считали необходимым сравнить рост растений и активность GUS при замене в питательной среде солей аммония в концентрации 20 мМ на 2 мМ. Растения выращивали на половинной питательной среде Мурасиге и Скуга, содержащей в качестве единственного источника азота 2 мМ соответствующей соли аммония. Снижение концентрации позволило ввести в рассмотрение в качестве источника азота не только (NH SC , но и NH4CI.
Динамика активности GUS в листе растений, выращенных в присутствии в питательной среде 2 мМ NHU, характеризовалась теми же закономерностями, что и у растений, росших на среде, содержащей 20 мМ соли аммония (рис. 43, 47). Мало отличалась активность GUS в растениях, которые выращивались на хлориде аммония и сульфате аммония. Общими при развитии растений, независимо от источника азота, на котором они росли, являлись снижение активности GUS в листе после прекращения роста и высокая интенсивность окраски в сосудистой системе. У всех вариантов растений, выращенных на аммонии, проявлялось также характерное отсутствие максимумов окраски в областях гидатод. При снижении концентрации аммония сохранялись различные аномалии развития сосудистой системы в листе и в большинстве случаев отсутствовали жилки третьего порядка.
Сравнение роста и активности GUS в листьях 1 яруса растений, выращенных на средах с 2 мМ сульфата (А, Б, В) или хлорида (Г, Д, Е) аммония в качестве единственного источника азота. Линия В. А, Г — площадь листа. Треугольники — площадь листа растения, выросшего на среде, содержащей аммонийную соль. Для сравнения приведены данные для листа 1 яруса растения, выросшего на среде, содержащей 2 мМ нитрата калия в качестве единственного источника азота (квадраты). Б, Д — активность GUS в пластинке листа. Серые квадраты — активность GUS в центральной части листа, чёрные треугольники — активность GUS в области предполагаемой апикальной гидатоды. В, Е — активность GUS в сосудистой системе листовой пластинки. Чёрные квадраты — активность GUS в главной жилке, кресты — активность GUS в жилках 2 порядка Мы сравнили также рост и активность GUS у растений на питательной среде, содержащей 2 мМ хлорида аммония или 2 мМ сульфата аммония. Развитие надземной части растений, получавших 2 мМ хлорида аммония, мало отличалось от растений, выращенных на 2 мМ сульфата аммония (рис. 48). В некоторых опытах развитие растений на среде с 2 мМ NH4C1 опережало развитие растений на среде с (NH SC (рис. 49). На 2 мМ хлорида аммония увеличивалась площадь листьев растений, тогда как количество листьев было приблизительно одинаковым. Возможно, в этом последнем случае проявлялось свойство хлорида заменять нитрат в качестве осмотически активного иона при недостатке нитрата в тканях растения (Мейчик и др., 1998). Таким образом, хлорид мог способствовать увеличению размеров листьев за счёт накопления воды в вакуолях.
Суммарная площадь листьев растений, выращенных на питательной среде, содержащей 2 и 20 мМ нитрата калия. Тёмные значки — растения, выращенные на 2 мМ нитрата, белые значки — растения, выращенные на 20 мМ нитрата. Квадратами обозначены данные для растений линии В, кругами — для растений линии Н
Однако следует отметить, что при снижении концентрации аммонийных солей в среде от 20 до 2 мМ у 1—2% растений происходило активное развитие. При этом площадь семядолей, листьев 1 и 2 ярусов достигала размеров листа растений, выращенных на нитрате (3—4 мм для семядолей, 4—7 мм2 для листьев), листья имели сформированные черешки, однако, меньшей длины, чем черешки листьев растений, выращенных на нитрате (около 3 мм при 6—7 мм длины черешков растений, выращенных на нитрате). Листья таких растений имели развитую сеть жилок. К сожалению, при столь редком появлении растений с резко сниженными проявлениями отрицательного действия аммония на росте не было возможности проследить развитие в них активности GUS. Возможно, такое отклонение в реакции на аммоний у 1—2% опытных растений объясняется не стопроцентной генетической однородностью опытных растений (Rauh et al., 2002).
Снижение концентрации (NH4)2S04 в 10 раз не изменило закономерностей, обнаруженных нами при концентрации соли 20 мМ. При использовании сульфата и хлорида аммония в концентрации 2 мМ также проявлялось существенное подавление роста листьев, особенно черешков, и угнетение развития сосудистой системы в листе. Активность GUS, по которой мы судили о присутствии в растениях цитокининов, подтвердила, что максимальное содержание цитокининов совпадало с максимальным ростом листа и резко снижалось после его завершения или даже несколько раньше. Наибольшая активность GUS была приурочена к сосудистой системе черешка и листа. Существенное снижение у 1—2% растений угнетающего действия аммония на ростовые процессы позволяет предположить, что ответ! на аммоний определяется генотипом растений. Это подтверждается литературными данными о существовании различий ростового ответа на аммоний у представителей различных видов (Drew, 1975; Bedell et al., 1998; Crawford and Forde, 2002) и внутривидовых различий (Rauh et al., 2002).
Полученные в нашей работе на основании активности GUS данные о снижении в содержании цитокининов в растениях на аммонийном (по сравнению с нитратным) источнике азота хорошо согласуется с данными (Walch-Liu et al., 2000) о том, что перенос растений табака со среды, "содержащей NH4NO3, на среду с аммонийным азотом снижал содержание зеатина и его рибозида в пасоке, тогда как в присутствии NO 3 в питательном растворе в пасоке поддерживался высокий уровень цитокининов. Снижению цитокининов в пасоке у растений табака на NHJ соответствовало угнетение роста листьев. Введение в питательную среду наряду с NH+ также NOj устраняло подавление роста аммонийным азотом, что привело авторов к выводу, что угнетение роста в их опытах вызывал не ион NHJ, а отсутствие нитратного азота (Walch-Liu et al., 2000). Это представление получило дальнейшее развитие в опытах на томатах, для которых было показано, что угнетению роста растений на аммонийном азоте соответствовало снижение в 2,5 раза содержания в пасоке зеатина и его рибозида. Перенос растений с раствора с NH+ на раствор с NO" вызывал синхронную активацию роста листьев и содержания в листьях и пасоке зеатина и его рибозида (Rahayu et al., 2005). Это подчёркивает сигнальную роль цитокининов в активации роста листьев нитратным азотом.
