Содержание к диссертации
Введение
1 Фоторегуляция роста и морфогенеза растений 10
1.1 Фоторецепторы, регулирующие морфогенез растений на синем и зеленом свету 11
1.2 Трансдукция светового сигнала 14
2 Гормональная регуляция фотоморфогенеза растений 17
2.1 Ауксины 18
2.2 Гиббереллины 20
2.3 Цитокинины 22
2.4 Абсцизовая кислота 23
2.5 Брассиностероиды 24
3 Объект и методики исследования 29
3.1 Объект исследования 29
3.2 Выращивание арабидопсиса на белом свету 32
3.3 Постановка эксперимента 32
3.4 Определение ростовых параметров 36
3.5 Определение эндогенных фитогормонов 37
3.5.1 Выделение фитогормонов 37
3.5.2 Количественное определение фитогормонов твердофазным иммуноферментным анализом 40
3.5.3 Выделение фракции растительного материала, содержащей брассиностероиды 42
3.6 Методы обработки данных 44
4. Роль селективного света и экзогенных брассиностероидов в регуляции морфогенеза проростков арабидопсиса 45
4.1 Влияние экзогенных брассиностероидов на рост арабидопсиса в темноте на начальных этапах онтогенеза 46
4.2 Действие синего и зеленого света на морфогенез проростков арабидопсиса 57
4.3 Роль экзогенных брассиностероидов в морфогенезе растений на синем и зеленом свету 66
5. Влияние селективного света разного спектрального состава и брассиностероидов на гормональный баланс проростков a. thaliana 74
5.1 Влияние экзогенных брассиностероидов на гормональный баланс арабидопсиса в темноте на начальных этапах онтогенеза 74
5.2 Влияние синего/зеленого света и брассиностероидов на гормональный баланс арабидопсиса 81
Заключение 91
Выводы 94
Список использованной литературы 95
Приложения 129
- Фоторецепторы, регулирующие морфогенез растений на синем и зеленом свету
- Количественное определение фитогормонов твердофазным иммуноферментным анализом
- Роль экзогенных брассиностероидов в морфогенезе растений на синем и зеленом свету
- Влияние синего/зеленого света и брассиностероидов на гормональный баланс арабидопсиса
Введение к работе
Актуальность. Растения, вследствие прикрепленного образа жизни, вынуждены быть особенно пластичными в ответах на воздействия окружающей среды. К наиболее важным внешним факторам относится свет, являю-
"* щийся не только источником энергии для фотосинтеза, но и сигналом, акти-
вирующим и изменяющим программу развития (Ничипорович, 1975; Воскресенская, 1979). Известно, что действие света на морфогенез растений реализуется через фоторецепторы, поглощающие красный свет (фитохром), си-ний/УФ-А/зеленый (криптохромы), синий (фототропины), синий/красный (суперхром) и систему вторичных посредников (мессенджеров) (Briggs and Olney, 2001). Имеется много работ по фитохромной регуляции роста и развития растений (Красновский, 1975; Кузнецов и др., 1986; Furuya, 1989; Воло-
** товский, 1987, 1999; Синещеков и др., 1989; Oelze-Karow and Mohr, 1989).
Значительно меньше исследований по действию синего света (Воскресенская
и др., 1968а, 19686; Voskresenskaya, 1972; Воскресенская, 1975, 1979) и прак
тически нет работ по выяснению роли зеленого света в морфогенезе и про
дукционном процессе растений (Карначук и др., 1972, 1978; Карначук, 1987).
Несмотря на интерес к передаче светового сигнала в растениях, процессы от
восприятия света фоторецептором до конечного физиологического ответа
мало исследованы. Известно, что фитогормоны выступают в роли возмож
на ных промежуточных трансдукторов светового сигнала, изменяя, в итоге, экс
прессию специфических генов, что проявляется в определенном морфологи
ческом ответе. Кроме того, некоторые фитогормоны в темноте могут вызы
вать реакции, запускаемые светом (Black and Vlitos, 1972; Brien et al., 1985;
Chory et al., 1994; Su and Howwell, 1995). Существует предположение о во
влечении брассиностероидов (БС) в передачу светового сигнала (Chory et al.,
Щ 1991; Hooley, 1996; Карначук и др., 2002; Tanaka et al., 2003). К настоящему
времени получено много информации относительно роли наиболее активного
брассиностероида - брассинолида в морфогенезе растений на красном свету
(Luccioni et al., 2002; Nemhauser et al., 2003). Участие остальных представите-
лей семейства брассиностероидов (гомобрассинолида и эпибрассинолида) в фотоморфогенезе еще не достаточно исследовано. Несмотря на то, что механизмы синтеза/инактивации БС напрямую связаны со спектральными характеристиками света, взаимодействие селективного света (зеленого и синего) и активных брассиностероидов (гомобрассинолида, эпибрассинолида и брас-синолида) не рассматривалось.
Интерес к этой группе гормонов вызван тем, что брассиностероиды способны в малых дозах повышать урожайность сельскохозяйственных культур и увеличивать устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды. Кроме того, активное использование брассиностероидов в качестве принципиально новых препаратов сельскохозяйственного назначения, обусловлено их экологической безопасностью и способностью снижать накопление нитратов, тяжелых металлов, радионуклидов. Этим объясняется использование брассиностероидов в работе с растениями как для изучения механизмов действия, так и в целях практического применения (Ковганко, 1991; Хрипач и др., 1995; Szekeres and Koncz, 1998; Asami and Yoshida, 1999; Khripach et al, 1999; Miissig and Altmann, 1999).
Цель: Исследовать взаимодействие брассиностероидов и коротко-, средневолнового света в регуляции морфогенеза и баланса эндогенных гормонов у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Для решения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи:
Изучить влияние различных концентраций экзогенных брассиностероидов (гомобрассинолида, эпибрассинолида и брассинолида) на морфогенез арабидопсиса экотипов Landsberg erecta и Columbia и их мутантов hy4 и det2 в темноте;
Исследовать роль зеленого (515, 524.5, 532 им) и синего (max 439 нм) света в регуляции морфогенеза проростков арабидопсиса на ранней стадии онтогенеза;
Оценить влияние брассиностероидов (брассинолида, эпибрассинолида и гомобрассинолида) на морфогенез проростков арабидопсиса дикого типа
Ler и Col и мутантов hy4 и detl при деэтиоляции синим светом;
4. Изучить действие эпибрассинолида в концентрации 1-Ю"6 М на рост и гормональный баланс проростков дикого типа Ler и мутанта hy4 в темноте и на зеленом свету (max 543 нм).
Объект исследований. Работа выполнена на модельном растении Arabidopsis thaliana экотипов Landsberg erecta и Columbia, а также мутантах, полученных на их основе - hy4, с нарушенным фоторецептором синего/УФ-А/зеленого света, и detl, с недостаточным синтезом брассиностероидов.
Практическая значимость работы состоит в изучении действия перспективных для растениеводческой практики регуляторов роста - брассиностероидов на морфогенез проростков арабидопсиса, а также их взаимодействие со светом. Результаты данной работы используются в учебном процессе при чтении курсов «Физиология растений», «Рост и морфогенез растений» в Томском государственном и педагогическом университетах при подготовке биологов и специалистов агрономического профиля.
Научная новизна полученных результатов:
Мутант по фоторецептору (hy4) и с нарушенным синтезом гормона {detl) являются удобной моделью для изучения путей трансдукции светового сигнала от фоторецептора до конечного физиологического ответа через изменение баланса эндогенных фитогормонов.
Впервые показано, что подавление роста осевых органов и увеличение площади семядолей арабидопсиса экотипа Ler и мутанта Иу4 под влиянием экзогенного эпибрассинолида (10" М) сопряжено с увеличением эндогенного уровня индолил-3-уксусной и абсцизовой кислот. Экзогенный брассинолид,
11 11 К
10"" М, эпибрассинолид, 10" Ми гомобрассинолид, 10" М ускоряли рост гипокотиля detl.
Впервые показано, что криптохром 1 является возможным рецептором зеленого света max 543 нм, контролирующий морфогенез арабидопсиса. Одним из механизмов трансдукции сигнала зеленого света может быть изменение уровня индолил-3-уксусной кислоты и зеатина.
Впервые обнаружено, что при совместном действии экзогенного эпи-брассинолида и зеленого света (max 543 нм) наблюдалось сложение эффектов на морфогенез проростков арабидопсиса Ler, при одновременном повышении уровня цитокининов. Эпибрассинолид, 10"6 М на зеленом свету регулировал уровень свободных ИУК и АБК в проростках Ler и Ьу4.
Брассинолид и гомобрассинолид могут снимать ингибирующее влияние синего света (СС) в ростовой реакции гипокотиля Ler и Ьу4. С другой стороны, синий свет подавлял удлинение гипокотилей det2, вызванное экзогенным брассинолидом.
Работа являлась частью плановых исследований кафедры физиологии растений и биотехнологии ТГУ выполненных в соответствии с НП "Университеты России" по теме "Роль селективного света и фитогормонов в регуляции продуктивности растений" (2004, УР.07.01.042) и ПИР, выполняемой в рамках ФЦНТП совместно с лабораторией химии стероидов ИБОХ НАН Беларуси по теме «Участие брассиностероидов в светорегулируемом развитии растений. Аналитический контроль уровня БС-гормонов» (2005, Гос. контракт от "5" сентября 2005 г. № 02.444.11.7098).
Личный вклад соискателя состоит в проведении экспериментальной работы, в осуществлении поиска путей достижения цели, в интерпретации полученных результатов. Постановка задач, решение методических проблем, подготовка материалов для научных публикаций осуществлялись совместно с профессором, д-ром биол. наук Р.А. Карначук и доцентом, канд. биол. наук И.Ф. Головацкой. Эксперименты с применением лазерной техники проводились совместно с профессором, д-р. физ.-мат. наук и доцентом, канд. физ.-мат. наук В.А. Светличным. Синтетические аналоги брассиностероидов (гомобрассинолид, эпибрассинолид и брассинолид) получены в лаборатории химии стероидов ИБОХ НАН Беларуси (Минск) под руководством чл.-корр. НАН Беларуси, проф., д-р. хим. наук В.А. Хрипача, ст. науч. сотр., д-р. хим. наук Р.П. Литвиновской и канд. хим. наук СВ. Драч.
Апробация основных результатов работы. Материалы работы были представлены на V Региональной конференции молодых ученых (Томск, 2000); VI Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» (Москва, 2001); II Международной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2001); VII Всероссийской конференции молодых ученых (Томск, 2003); Международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии растений а XXI веке» (Сыктывкар, 2001); XIII и XIV Международных конференциях по физиологии растений (Ираклио - Греция, 2002; Краков - Польша, 2004); Региональной конференции, посвященной 125-летию ТГУ и 70-летию БПФ (Томск, 2003); V Съезде общества физиологов растений России и международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003); XLII Международной конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2004); Международной конференции «Проблемы рационального использования растительных ресурсов» (Владикавказ, 2004); Годичных собраниях общества физиологов растений России (Петрозаводск, 2004; Вологда, 2005); VI Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2005); 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2006), научных семинарах Томского отделения РОФР.
Отдельные этапы данного исследования отмечены грантом для участия в XIII Международной конференции физиологов растений (Греция, 2002).
Опубликованность результатов. Результаты диссертации изложены в 23 научных работах, из них 4 в рецензируемых изданиях, всего 56 стр.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения; обзора литературы по теме диссертации; экспериментальной части, обсуждения результатов исследований, заключения и списка использованных литературных источников (343 источника, из них 107 отечественных и 236 зарубежных). Работа изложена на ]_29 стр., содержит 2 таблицы, 3J. рисунок и 21 приложение.
Фоторецепторы, регулирующие морфогенез растений на синем и зеленом свету
В 1881 году Ч. Дарвин в опытах по изучению фототропизма у канареечной травы показал, что экран из раствора бихромата калия, который не пропускал синий свет, полностью снимал эффект фототропизма (цит. по Fankhauser, Staiger, 2002). В ходе дальнейших исследований 10. Сакса по изучению спектральных характеристик света, вызывающего реакцию фототропизма, стало понятно, что растение «чувствует» синий свет.
Однако только в конце 19 века удалось охарактеризовать рецептор синего света, который был назван криптохромом (от лат. слова "криптос" -скрытый). Эта группа фоторецепторов воспринимает УФ-А (390 нм), синий (440-490 нм) и зеленый свет (490-532 нм) (Lin et al., 1995а; Batschauer, 1998; Рорре et al., 1998; Ahmad et al., 2002). В 1980 году Корнеев (Koornneef) на основе отбора растений по чувствительности к синему свету (СС) получил мутант арабидопсиса hy4 с нарушенным синтезом криптохрома 1 (CRY1), рост его гипокотиля на синем свету не подавлялся. И только в 1993 году М. Эхмэд и А.Р. Кэшмор отобрали среди мутантных растений арабидопсиса те, которые давали удлиненный гипокотиль, как в темноте, так и на синем свету. В дальнейшем это дало возможность клонировать соответствующие гены и получить полную последовательность нуклеотидов для генов криптохрома (Ahmad and Cashmore, 1993).
Семейство криптохромов включает в себя от двух (CRY1 и CRY2 у Arabidopsis) до пяти представителей (CRY1 - CRY5 у Adiantum capillus-veneris) (Imaizume et al., 2000). Криптохром состоит из пигмента, поглощающего свет (хромофора), представленного птерином (5,10-метенилтетрагидрофолат) и/или флавином, а также белка-эффектора (75,8 кДа апопротеина). Аминокислотная последовательность белков криптохромов на N-конце высоко гомологична последовательности ДЫК-фотолиаз, однако, несмотря на это, криптохромы не могут выполнять основную функцию фотолиаз (восстановление сшивок, разрушающиеся в ДНК после облучения УФ) (Jenkins et al., 1995; Lin et al., 1995b). Физиологические функции, клеточную локализацию и внутримолекулярные взаимодействия криптохрома определяет дополнительный участок (DAS) на С-конце состоящий из 186 аминокислот у CRY1 и 120 остатков CRY2 (Ahmad et al., 1999; Lin et al., 1998; Lin and Shalitin, 2003).
Физиологические функции CRY1 и CRY2 до некоторой степени сходные, скорее всего это обусловлено тем, что N- и С-терминальные домены CRY1 и CRY2 взаимозаменяемы (Batschauer, 1998; Ahmad et al., 1998, 1999). Например, они подавляют удлинение гипокотиля и индуцируют синтез анто-цианов, но CRY1 выполняет свои функции при высокой интенсивности ос-вещения (1-100 мкмоль/м с), a CRY2 при низкой (0,6 - 5,5 мкмоль/м"с) (Ahmad et al., 1995, 1998; Bruggemanna et al., 1998; Lin et al., 1998; Hennig et al., 1999). Помимо общих функций криптохромные белки имеют индивидуальные функции. Так, например, CRY2 отвечает за увеличение размеров семядолей и контролирует время цветения, в то время как CRY1 регулирует внутренние циркадные ритмы и отвечает за индукцию некоторых генов, вовлеченных в биосинтез флавоноидов и накопление антоцианина в арабидопсисе (Fuglevand et al., 1996; Ahmad, 1998, 1999; Imaizumi et. al, 2000; Smith, 2000; Chatterjee et al., 2006). Криптохромы обнаружены и вне растительного царства - в дрозофилах, мышах и человеке, где они играют важную роль для поддержания внутренних циркадных ритмов (Imaizumi et al., 2000; Smith, 2000).
Локализация большинства криптохромов зависит от условий освещения. Так, CRY1 может перемещается из ядра в цитоплазму в ответ на свет, CRY3 - импортируется в ядро в темноте или на красном свету и локализован в цитоплазме на синем свету. CRY2 и CRY4 накапливаются преимущественно в ядре, a DASH находится в хлоропластах и митохондриях (Kleine et al., 2003; Lin and Shalitin, 2003; Daiyasu et al., 2004). Экспрессия криптохромных генов Adiantum capillm-veneris зависит от возраста растений. Например, экспрессия CRY1, CRY2 и CRY3 осуществляется в ходе жизненного цикла папоротника. CRY4 преобладает в спорах и молодых листьях, выросших в темноте, его количество снижается при восприятии света. CRY5 практически отсутствует в спорах, но появляется при прорастании споры (Smith, 2000).
Известно, что зеленый свет (ЗС) отвечает за регуляцию многих процессов морфогенеза растений, однако фоторецептор зеленого свет еще не открыт (Карначук и др., 1972; Карначук, 1987). Относительно существования фоторецепторов зеленого света в настоящее время существует несколько спорных мнений. Одни исследователи считают, что за восприятие средневолновой области спектра отвечают криптохромы (Lin et al., 1995; Jenkins et al., 2001; Ahmad et al., 2002). Другие полагают, что фитохромы (скорее всего, phyB) могут поглощать зеленый свет (ЗС), т.к. некоторые эффекты, вызываемые освещением ЗС обращались дальним красным светом (ДКС) (Карначук и др., 1978; Шапиро и др., 1988; Головацкая, 1992, 1998). Тот факт, что не все процессы, запускаемые ЗС снимаются ДКС говорит о наличии фоторецептора ЗС, взаимодействующего с фитохромом (Vicente and Garcia, 1981; Головацкая, 1998). О существовании отдельного фоторецептора зеленого света свидетельствуют и работы других исследователей (Карначук, 1967, 1987; Карначук и др., 1981; Шкорбатов и Шахбазов, 1988; Folta, 2004).
Зеленый свет тормозит клеточное деление и задерживает растяжение клеток; ускоряет формирование мембранной системы пластид на ранних этапах и стимулирует накопление хлорофилла (Карначук, 1987; Шапиро, 1988; Шахов, 1993). В результате чего формируются вытянутые осевые органы, тонкие листья с меньшим числом клеток и хлоропластов и самым низким фотосинтезом на единицу площади листа, но более высоким в расчете на хлоропласт (Klein, 1965, 1967; Мошков Б.С, цит. по Константиновой и др., 1975; Карначук, 1987). Кроме того, показано участие зеленого света в фотопериодических реакциях (Константинова и др., 1968). 1.2 Трансдукция светового сигнала
Развитие растений может происходить согласно двум программам -скотоморфогенезу (в темноте) и фотоморфогенезу (на свету). В условиях темноты наблюдается инактивация фоторецепторов и положительных регуляторов фотоморфогенеза через убиквитинирование, осуществляемое СОР1 (Constitutively Photomorphogenic 1; ЕЗ убиквитин белковая лигаза), а также посредством взаимодействия с сигналосомой СОР9 и белками СОРЮ, DET1 (De-etiolated 1), FUS6 (Fusca, накопление антоциана) и SUB1 (цитоплазмен-ный Са" -связывающий белок) (McNellis et al., 1994; Whitelam and Devlin, 1998; Stoop-Myer et al., 1999; Walters et al., 1999; Guo et al., 2001; Kim et al., 2002; Liscum et al., 2003; Seo et al., 2004). В результате чего ставится запрет на программу светового развития.
Квант синего света (СС) воспринимается птерином ядерного крипто-хрома, затем сигнал передается на флавин, находящийся в стабильной семи-хинонной форме, который частично восстановлен и легко отдает электроны. Поглотив квант света флавин ядра возбуждается и, в результате, редокс-потенциал резко изменяется. Возбужденный флавин является сильным восстановителем. Это, в свою очередь, приводит к фосфорилированию крипто-хромов (сгу2, сгуЗ, сгу4) через STAES мотив на С-конце благодаря фоторецептору красного света (фитохрому) или к самофосфорилированию cryl и cry5 (Ahmad et al., 1998; Batschauer, 1998; Bouly et al., 2003; Liscum et al., 2003).
Количественное определение фитогормонов твердофазным иммуноферментным анализом
Морфогенез растительного организма находится под непосредственным контролем внешних и внутренних факторов. Свет, как внешний фактор, регулирует рост и развитие растений в зависимости от интенсивности и спектрального состава (Клешнин, 1954; Шульгин и др., 1963; Воскресенская, 1975; Куперман и Ржанова, 1978; Протасова, 1981, 1996; Золотухин и др., 1983; Карначук и др., 1986, 1987, 1988; Лисовский и др., 1987; Тихомиров и др., 1987, 1991; Шалаева и др., 1991). С другой стороны, имеются эндогенные регуляторы - фитогормоны, которые могут быть вовлечены в управление фотоморфогенезом (Chory et al., 1994, 1995; Chory and Li, 1997; Kraepiel and Miginiac, 1997; Карначук и др., 2002, 2003). Было высказано предположение, что одними из них являются брассиностероиды (БС) (Li et al., 1996). Биосинтез, инактивация и ответная реакция на брассиностероиды зависит от света (Neffet al., 1999; Symons and Reid, 2003, 2004; Turk et al., 2003). В свою очередь, БС могут «имитировать» действие света, сходным образом контролируя скорость и характер протекания морфофизиологических процессов в растениях (Карначук и др., 2001, 2002; Leubner-Metzger, 2001, 2003; Khripach et al., 2003; Nemhauser et al., 2003).
Наиболее показательными являются реакции растений на ранних стадиях онтогенеза. В связи с этим мы изучали особенности ростовых ответов 7-дневных проростков Arabidopsis thaliana в темноте, под действием экзогенных брассиностероидов и при деэтиоляции на синем и зеленом свету разной интенсивности и продолжительности действия. Для исследования механизма фоторегуляции морфогенеза были взяты мутанты с нарушенным фоторецептором синего света CRY1 (hy4) и недостаточным синтезом брассиностероидов (det2).
Морфометрические исследования проростков A. thaliana, выросших в темноте, показали, что длина гипокотилеи и площадь семядолей у мутанта hy4 были достоверно меньше, чем у дикого типа Ler (Рисунок 6, Приложение 5). Полученные данные согласуются с описанными для ку4 другими авторами (Ahmad and Cashmore, 1993; Jackson and Jenkins, 1995; Тищенко и Карна-чук, 1998; Головацкая и др., 2001; Карначук и др., 2001, 2002).
Отсутствие продукта гена DET2 (стероид-5а-редуктазы), сопровождалось недостаточным синтезом наиболее активного брассиностероида - брас-синолида, и приводило к тому, что мутант det2 отличался от исходной линии дикого типа Col значительным укорочением гипокотиля и корня (в 2,2 раза), а также большей площадью семядолей (Рисунок 6; Приложение 5). Короткий гипокотиль и корень проростков det2 можно объяснить с одной стороны низким уровнем брассиностероидов, а с другой стороны - утратой чувствительности к гиббереллину и ослабленной экспрессией GA5 на уровне транскрипции, что сопровождалось изменением активности гиббереллина (Reid and Ross, 1989; Nomura et al., 1997, цит. no Steber and McCourt, 2001; Bouquin, 2001). Снижение уровня активных гиббереллинов могло привести к подавлению эндоредупликации (Gendreau et al, 1999), что и вызвало укорочение осевых органов. Увеличение площади семядолей det2, вероятно, было обусловлено повышенной концентрацией цитокининов в проростках (Ефимова и др., 2005). Участие различных брассиностероидов в регуляции морфогенеза растений мало изучено и это предполагает исследование их роли в ското- и фотоморфогенезе арабидопсиса дикого типа и мутантов. Для этого проводили серию экспериментов по выявлению действующей концентрации гомобрас-синолида (ГБ), эпибрассинолида (ЭБЛ) и брассинолида (БЛ) в условиях темноты, а также на селективном свету.
В темноте ответная реакция на экзогенные брассиностероиды выражалась укорочением длины гипокотилей у проростков дикого типа Ler и Col и мутанта hy4, а также увеличением размеров семядолей у всех исследуемых линий. Наибольший эффект наблюдался при использовании экзогенного брассинолида (Рисунки 7-9; Приложения 6, 7).
Брассинолид подавлял рост гипокотилей дикого типа Col и стимулиро-вал их удлинение у мутантных проростков det2 в концентрации 1-Ю М (Рисунок 7а). Вероятно, ингибирование роста гипокотилей арабидопсиса дикого типа было обусловлено высоким уровнем эндогенных брассиностероидов в проростках (Neff et al., 1999; Noguchi et al., 1999; Kang et al., 2001; Symons and Reid, 2004). Нарушенный биосинтез БС в мутантных проростках det2 приводил к ослаблению растяжения клеток гипокотиля, а добавление его извне стимулировало удлинение клеток гипокотиля примерно в 2 раза (Тапака et al., 2003).
Роль экзогенных брассиностероидов в морфогенезе растений на синем и зеленом свету
Использование мутанта по фоторецептору синего/зеленого света (hy4) и мутанта det2 позволяет выяснить роль селективного света в морфогенезе растений, а также возможных участников в трансдукции светового сигнала (DET2). Несмотря на значительное число работ по действию синего света (СС) на рост и фотосинтез растений (Воскресенская и др., 1968а, 19686; Воскресенская, 1975; Voskresenskaya, 1972) остается не мало вопросов об участниках трансдукции сигнала СС в морфогенезе растений. Роль же зеленого света (ЗС) практически не исследована (Карначук, 1987; Карначук и др., 2002). В наших экспериментах использовали СС и ЗС, чтобы сравнить ростовые ответы арабидопсиса на ранних этапах онтогенеза.
Ежедневное 30-минутное досвечивание проростков Ler синим светом на протяжении 7 дней (A,max = 439 нм) приводило к укорочению длины гипо-котиля как при интенсивности 3.0, так и 5.2 мкмоль/м с (Рисунок 12, 13; Приложение 12). Одновременно увеличивалась площадь семядолей. Длина гипокотилей hy4 практически не изменялась на СС, что можно объяснить отсутствием фоторецептора CRY1. Эти данные согласуются с результатами других исследований (Jackson and Jenkins, 1995; Карначук и др., 2001). Контроль за удлинением гипокотиля на синем свету могут осуществлять фито-хромы в фотостационарном состоянии (Schafer and Haupt, 1983, цит. по Thum et al., 2001; Neff and Chory, 1998; Chun et al., 2001) и фототропины (Briggs and Huala, 1999; Lasceve et al., 1999; Ohgishi et al., 2004). Кроме того, имеются доказательства действия других фоторецепторов синего света, это DASH или сгуЗ (Jackson and Jenkins, 1995; Liscum et al., 2003).
Синий свет низкой интенсивности (3 мкмоль/м с) не подавлял рост ги-покотиля у арабидопсиса другого экотипа Col, также как и мутанта det2. Следует отметить, что det2 отвечал на световое воздействие более значительным увеличением размеров семядолей, чем родительская линия Col (Рисунок 13; Приложение 12 А). Вероятно, это обусловлено тем, что на свету происходит увеличение уровня эндогенных брассиностероидов (Symons and Reid, 2003, 2004).
Влияние зеленого света на рост гипокотилей дикого типа Ler также зависело от длины волны, уровня облученности (Е) и продолжительности облучения. Освещение 3-дневных этиолированных проростков арабидопсиса Ler зеленым светом с длиной волны 515 нм (30 импульсов, Е = 0,7 Вт/м ) вызывало наиболее значительное подавление роста гипокотиля по сравнению со светом 532 нм (30 импульсов, Е = 0,7 Вт/м ). Увеличение продолжительности облучения до 300 импульсов усиливало эффект зеленого света всего диапазона (Рисунок 14 а). Ростовая реакция семядолей Ler при 30 импульсах ЗС в меньшей степени зависела от длины волны (Рисунок 14 в). Сходная реакция проростков арабидопсиса дикого типа и мутанта hy4 на зеленый свет 515 и 532 нм, вероятно, связана с активностью криптохрома 2 или неидентифици-рованного рецептора зеленого света (Рисунки 14 а - г) (Ефимова и Головац-кая, 2001; Головацкая и Ефимова, 2003; Головацкая и др., 2003). Было показано, что криптохромы могут воспринимать свет с длиной волны от 390 до 532 нм (Ahmad et al., 2002). Частичное сохранение ответной реакции на 542 нм у проростков Ьу4 позволяет предполагать участие CRY1 и возможного рецептора зеленого света (Рисунок 14 6, 14 г).
Ежедневная 60-минутная деэтиоляция на зеленом свету (Х,шх = 524.5 нм, 2.5 мкмоль/м"") на протяжении 3-х дней вызывала более значительное подавление роста гипокотилей дикого типа
Более длительное освещение (7 дней) приводило к большему увеличению площади семядолей двух линий дикого типа Ler и Col (Приложения 13 Б, 13 В). Ответная реакция гипокотилей мутантных проростков hy4 и detl на ЗС превышала эффект вызванный у двух линий арабидопсиса дикого типа Ler и Сої в два раза и отличалась от ответа на синий свет (Рисунок 13, 15). Вероятно, за восприятие светового сигнала зеленого света (max 524.5 нм) отвечает гипотетический фоторецептор, вступающий в отрицательное взаимодействие с CRY1.
Аналогичные ответы были получены при использовании монохроматического света Ащах= 543 нм (плотность потока квантов 3,7 мкмоль/м2с), которым освещали арабидопсис на протяжении 60 минут в течение 7 дней. Также наблюдалось ингибирование роста гипокотиля у дикого типа по сравнению с темнотой, тогда как площадь семядолей у Ler и hy4 возрастала, причем в большей степени у мутанта (Рисунок 16; Приложение 14 А). Отсутствие ответной реакции гипокотилей hy4 на зеленый свет предполагает участие крип-тохрома 1 в восприятии ЗС max 543 нм. 30-минутное освещение проростков зеленым светом более высокой ин-тенсивности (плотность потока квантов 4,2 мкмоль/м с) незначительно замедляло процессы растяжения гипокотиля у дикого типа и мутанта по CRY1. Тогда как длительная экспозиция на зеленом свету (60 минут), ингибировала рост гипокотиля и увеличивала длину/ширину семядолей Ler и Иу4 (Рисунок 17, Приложение 14 Б) (Ефимова и Головацкая, 2001).
Таким образом, кратковременное освещение синим светом (30 минут, max = 439 нм, 3.0 мкмоль/м с) приводило к уменьшению длины гипокотиля у проростков дикого типа Ler, распрямлению гипокотильной петли и увеличению площади семядолей у Ler, Col и det2 по сравнению с контролем. Зеле-ный свет (60 минут, max = 524 нм, 2.5 мкмоль/м с) стимулировал увеличение площади семядолей и укорочение гипокотиля у всех изучаемых линий арабидопсиса (Ler, hy4, Col и det2).
Влияние синего/зеленого света и брассиностероидов на гормональный баланс арабидопсиса
Фитогормоны являются важными эндогенными регуляторами морфогенеза растений. Наиболее исследовано действие ауксинов, гиббереллинов, этилена, абсцизовой кислоты и цитокининов (Креславский и др., 1988; Кефе-ли и др., 1983, 1989; Креславский и др., 1988; Полевой и Полевой, 1992; Cowling and Harberd, 1999; Collet et al., 2000; Finkeistein et al., 2002; Ross et al., 2003; Vandenbussche et al., 2003a, 2003b). Менее изучено влияние брасси-ностероидов на морфогенез растений (Clouse et al., 1993; Хрипач и др., 1995). Также было показано взаимодействие света разного спектрального состава и эндогенных гормонов в регуляции морфогенеза растений (Kende and Lang, 1964; Карначук и др., 1988; Спринчану и др., 1990; Behringer et al., 1992; Toyomasu et al., 1993; Chory et al., 1996; Головацкая, 1998; Reed et al., 2002). Мало изучена роль коротко- и средневолнового участка спектра и брассино-стероидов в формировании гормонального баланса растений (Neff et al., 1999; Карначук и др., 2001, 2002; Kamachuk et al., 2002; Khripach et al., 2003).
Для того чтобы оценить значение синего и зеленого света и экзогенных брассиностероидов в координации процессов роста и развития растений мы изучали влияние этих факторов на гормональный баланс арабидопсиса дикого типа (Ler и Col) и мутантов (hy4 и detl).
Для понимания роли брассиностероидов и света в формировании гормонального баланса арабидопсиса необходимо выяснить действие этих факторов по-отдельности. Поэтому мы изучали влияние экзогенных брассиностероидов на уровень эндогенных фитогормонов в условиях этиоляции. Анализ гормонального баланса показал, что укороченный гипокотиль hy4 может быть результатом высокого уровня свободной формы абсцизовой кислоты (АБК) (Рисунок 23; Приложение 16 Б) (Головацкая, Ефимова, 2001, 2004; Карначук и др., 2004; Минич и др., 2006), которая, проявляет ингибиторное действие на рост, возможно, через нарушение распределения микротрубочек (Sakiyama and Shibaoka, 1990, цит. по Volmaro et al., 1998; Wang and Nick, 2001). В то же время, содержание гормона-стимулятора индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) в проростках hy4 и Ler не имело достоверных отличий (Рисунок 24; Приложение 16 А). Возможной причиной, определяющей отставание роста и меньшую площадь семядолей у hy4 в темноте, может быть пониженное содержание зеатина по сравнению с диким типом (Рисунок 25; Приложение 16А). Низкое содержание эндогенных цитокининов (транс-зеатина) было характерно и для проростков табака с нарушенным фитохромом (Kraepiel et al., 1995, цит. по Novakova et al., 2005). Одновременно для проростков hy4 характерно высокое содержание свободной и связанной формы гиббереллина (ГК(.з) (в 4 и 2 раза, соответственно) по сравнению с Ler (Рисунок 26; Приложение 16 В). Уровень связанных ГК4.7, свободной и связанной ГК9 был ниже, чем в Ler (в 2 раза, на 33 % и 30 %).
Гиббереллины стимулируют рост растений через усиление растяжения клеток или клеточное деление (Муромцев и др., 1978; Муромцев и Агнисти-кова, 1984). Существует мнение, что растяжение клеток под действием ГК реализуется через подавление поступления пероксидазы к клеточной стенке (Fry, 1979, цит. по de Souza and MacAdam, 2001), благодаря чему образование внутримолекулярных мостов при димеризации феруловой кислоты гемицел-люлоз замедлялось. Однако укорочение гипокотиля проростков hy4 наряду с увеличением свободной формы ГК],з было, вероятно, вызвано тем, что мутация привела к снижению чувствительности зародышевого стебля к эндогенным гиббереллинам. Подобное изменение чувствительности частей проростка наблюдалось у мутантов гороха и арабидопсиса с нарушенным фоторецептором красного света (phyB) (Reid and Ross, 1988, цит. no. O Neill et al., 2000; Reed et al., 1996; Ait-Ali et al., 1999). Также возможно, что повышенное содержание ГКі,з в свободной и связанной форме у hy4 относительно дикого типа могло быть причиной подавления роста гипокотилей мутанта из-за ин-гибирующего эффекта. Вероятно, криптохромы совместно с фитохромами контролируют содержание эндогенных гиббереллинов и/или чувствительность растения к ним.
У мутанта другого типа, с нарушенным синтезом брассиностероидов, det2, гипокотили которого отставали в росте, по сравнению с родительской линией, обнаружено иное соотношение некоторых эндогенных гормонов: низкое содержание свободной формы индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) (в 2 раза) и брассиностероидов (эпибрассинолида и эпикастастерона и др.) (в 4 раза) (Рисунок 24; Приложение 16 А). Формирование у мутанта крупных семядолей, вероятно, связано с высоким содержанием цитокининов, как зеати-на, так и рибозид зеатина (Рисунок 25; Приложение 16 А) (Ефимова и др., 2005).
Экзогенные брассиностероиды значительно изменяют гормональный баланс проростков арабидопсиса. Как показано в наших опытах, при действии эпибрассинолида в концентрации 10"6 М, наблюдалось замедление роста гипокотиля her и hy4. Это сопряжено с изменениями баланса эндогенных фитогормонов. Добавление ЭБЛ в темноте в несколько раз увеличивало уровень свободной формы ИУК, причем в большей степени в проростках дикого типа her, у которых также возрастало содержание связанной формы ИУК (Рисунок 27 А; Приложение 17 А) (Карначук и др., 2002). Однако, несмотря на повышение уровня ауксина под действием экзогенного брассиностероида, удлинения гипокотилей не наблюдается, хотя известно, что приток ИУК необходим для этого процесса (Cleland, 1995, цит. по Yang et al., 1996). По-видимому, синтезированная de novo индолил-3-уксусная кислота была избыточной. Подобной точке зрения придерживается и С. Коллет с соавторами (Collet et al., 2000).
