Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 5
2.1. Биогенетические особенности пластид 5
2.1.1. Пластиды растений 5
2.1.2. Пластом, перенос хлоропластных генов в ядерный геном 6
2.1.3. Хлоропластные белки 8
2.1.4. Основные аспекты биогенеза пластид 10
2.1.4.1. Деление пластид 10
2.1.4.2 Биогенез хлоропластов связан с программой развития листьев 11
2.1.4.3. Дифференциальное развитие пластид внутри листа 12
2.1.4.4. Дифференцировка специализированных типов пластид 14
2.1.4.5. Старение - завершающая стадия развития хлоропластов 15
2.1.5. Регуляция биогенеза пластид 15
2.1.5.1. Фотороцепторы и развитие хлоропластов 15
2.1.5.2. Гормональная регуляция биогенеза пластид 18
2.2. Транскрипция хлоропластных генов 29
2.2.1. Аппарат транскрипции пластома 29
2.2.2. Регуляция транскрипции в пластидах 31
2.3. Заключение 34
3. Материалы и методы 35
3.1. Объект исследований 35
3.2. Обработка листьев фитогормонами 35
3.3. Используемые в работе плазмидные векторы 41
3.4. Выращивание бактерий в LB среде и сине-белая селекция 43
3.5. Выделение плазмидной ДНК 44
3.6. Трансформация клеток Е. coli 47
3.7. Полимеразная цепная реакция 47
3.8. Электрофорез ДНК в агарозном геле 49
3.9. Выделение хлоропластов и пропластид 51
ЗЛО. Метод run-on транскрипции 53
3.10.1. Нанесение фрагментов ДІЖ на нейлоновую мембрану 53
3.10.2. Синтез меченых транскриптов в хлоропластном лизате 54
3.10.3. ДНК-РНК гибридизация 55
3.10.4. Экспозиция мембран и анализ результатов 56
3.11. Измерение концентрации хлорофилла в листьях ячменя 57
4. Результаты и обсуждение 58
4.1. Совместное действие БАП и света необходимо для регуляции транскрипции хлоропластных генов ячменя 58
4.1.1. Синергизм в действии БАП и света на транскрипцию хлоропластных генов 58
4.1.2. Интенсивность света влияет на транскрипцию хлоропластных генов и ее регуляцию цитокинином 62
4.2. Действие АБК на содержание хлорофилла и транскрипцию хлоропластных генов в листьях ячменя 71
4.2.1. Влияние АБК на содержание хлорофилла и транскрипцию хлоропластных генов на свету 71
4.2.2. Влияние АБК на транскрипцию хлоропластных генов в системе с предынкубацией срезанных листьев на воде 77
4.2.3. Влияние света на подавление АБК транскрипции хлоропластных генов 79
4.2.4. Участие разных РНК-полимераз в ингибировании транскрипции хлоропластных генов АБК 83
4.3. Антагонистическое действие БАП и АБК на транскрипцию хлоропластных генов 85
4.4. Влияние метилжасмоната на содержание хлорофилла и транскрипцию хлоропластных генов 87
4.4.1. Влияние метилжасмоната на содержание хлорофилла в листьях ячменя87
4.4.2. Влияние метилжасмоната на транскрипцию хлоропластных генов 89
158
4.5. Антагонистическое действие БАП и метилжасмоната на транскрипцию хлоропластных генов 94
4.6. Влияние ИУК на транскрипцию хлоропластных генов и содержание хлорофилла в листьях ячменя 96
4.7. Влияние ГКз на транскрипцию хлоропластных генов и содержание хлорофилла в листьях ячменя 101
4.8. Влияние эпибрассинолида на содержание хлорофилла и транскрипцию хлоропластных генов 106
4.9. Особенности регуляции транскрипции индивидуальных хлоропластных генов фитогормонами 108
7. Заключение 122
6. Выводы 127
6. Список сокращений
- Пластом, перенос хлоропластных генов в ядерный геном
- Выращивание бактерий в LB среде и сине-белая селекция
- Интенсивность света влияет на транскрипцию хлоропластных генов и ее регуляцию цитокинином
- Антагонистическое действие БАП и метилжасмоната на транскрипцию хлоропластных генов
Введение к работе
Пластиды являются уникальными органеллами растений, выполняющими большое количество метаболических функций, основной из которых является превращение солнечной энергии в энергию химических связей в процессе фотосинтеза (Neuhaus and Emes, 2000). Биогенез пластид тесно взаимосвязан с программой развития растения в целом и его различных тканей и органов (Lopez-Juez, 2007). Пластиды содержат свой собственный геном, в котором кодируется ряд «фотосинтетических» генов и генов «домашнего хозяйства» (Liere and Borner, 2006). В биогенезе пластид принимает участие экспрессия как ядерных, так и пластидных генов. Поэтому для биогенеза пластид очень важны сигналы, регулирующие экспрессию пластидных генов ядерного кодирования, самих пластидных генов, а также тесное взаимодействие и обмен информацией между ядерным и пластидным компартментами (Lopez-Juez, 2007). В регуляции всех этапов экспрессии генов активное участие принимают как внешние факторы, такие как свет, минеральное питание, доступность влаги, различные биотические и абиотические стрессы, так и внутренние факторы, как, например, фитогормоны и углеводы.
К настоящему времени хорошо установлена регуляторная роль цитокининов в биогенезе хлоропластов, которая состоит в активации цитокинином структурной и биохимической дифференциации хлоропластов (Микулович и др., 1971; Partiег, 1979; Кулаева, 1973; Kusnetsov et al., 1994; Caers and Vendrig, 2006). Показано антагонистическое действие в регуляции биогенеза хлоропластов цитокининов, которые активируют этот процесс, и абсцизовой кислоты (АБК), а также метилжасмоната (МеЖа), которые его ингибирует как на структурном, так и на биохимическом уровне (Кравяж и др., 1977; Хохлова и др., 1978; Reinbothe et al., 1997; Ananieva et al., 2007).
Показана активация цитокинином синтеза РНК в хлоропластах (Микулович и др., 1977; Roussaux et al., 1976; Зубо и др., 2005), активация экспрессии ядерных генов, кодирующих хлоропластные белки (Chory et al., 1994; Kusnetsov et al., 1994; Hutchison and Kieber 2002; Rashotte et al., 2003; Kiba et al., 2005; Brenner et al., 2005), получены данные в пользу посттранскрипционного влияния цитокининов на экспрессию хлоропластных генов (Kusnetsov et al., 1994).
Самым первым этапом экспрессии генов является транскрипция. Ранее было показано, что цитокинин может специфически активировать транскрипцию ряда хлоропластных генов (Зубо и др., 2005). Метил жасмонат (МеЖа), как было недавно установлено, также влияет на транскрипцию хлоропластных генов, но подавление, в данном случае, было показано на уровне суммарной транскрипции хлоропластных генов (Ananieva et al., 2007). Из литературы известны отдельные факты влияния гибберелинов, ауксинов и брассиностероидов на отдельные этапы биогенеза пластид.
Интенсивное изучение аппарата транскрипции пластидного генома привело к открытию двух разных РНК-полимераз, функционирующих в пластидах. РНК-полимераза фагового типа состоит из одной субъединицы, которая кодируется ядром. У РНК-полимеразы бактериального типа четыре субъединицы кодируются пластомом, а о-субъединицы, определяющие специфичность связывания с промотором этой полимеразы, кодируются в ядре (Liere К. and Borner Т., 2006). Эти данные вызвали значительный интерес к изучению транскрипционной регуляции экспрессии пластидных генов.
Однако до настоящего времени не было работ, которые рассмотрели бы возможное участие в регуляции биогенеза хлоропластов не только света, но и большой группы фитогормонов на уровне регуляции транскрипции хлоропластных генов.
Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы состояла в изучении гормональной и световой регуляции экспрессии хлоропластных генов на уровне транскрипции.
Для ее достижения были поставлены следующие задачи:
1. Выбрать для анализа гены, входящие во все известные опероны пластидной ДНК ячменя, кодирующие функционально различные белки и РНК. 2. Изучить принципиальную возможность регуляции транскрипции в разных сегментах листьев разных возрастов под действием АБК, ИУК, ГК3, ЭБ и МеЖа.
3. Выяснить роль света при действии цитокинина и абсцизовой кислоты на транскрипцию хлоропластных генов.
4. Исследовать взаимодействие фитогормонов-антагонистов: БАЛ и АБК, а также БАЛ и МеЖа - в регуляции транскрипции хлоропластных генов.
5. Изучить на albostrians мутанте ячменя участие РНК-полимеразы бактериального типа в регуляции транскрипции пластидных генов абсцизовой кислотой.
6. Выявить закономерности регуляции транскрипции индивидуальных хлоропластных генов фитогормонами.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Разработана биологическая система, позволяющая изучить участие АБК, 3-индолилуксусной кислоты (ИУК), гибберелловой кислоты (ГКз), эпибрассинолида (ЭБ) и МеЖа в регуляции транскрипции индивидуальных хлоропластных генов ячменя. Впервые показано, что гормоны АБК, ИУК и ГКз могут регулировать экспрессию ряда хлоропластных генов на уровне транскрипции. Показана необходимость света и важность его интенсивности для активации транскрипции хлоропластных генов цитокинином. Выяснено, что при ингибировании транскрипции хлоропластных генов под действием АБК свет не играет такой важной роли, как при активации транскрипции цитокинином. Выявлено антагонистическое действие БАЛ и АБК, а также БАЛ и МеЖа на уровне регуляции транскрипции хлоропластных генов. Получены косвенные доказательства участия РНК-полимеразы бактериального типа в регуляции транскрипции пластидных генов абсцизовой кислотой. Эти результаты вносят существенный вклад в понимание механизмов регуляции биогенеза хлоропластов фитогормонами. Полученные результаты могут быть использованы для разработки теоретических основ управления продуктивностью растений.
Пластом, перенос хлоропластных генов в ядерный геном
В процессе эволюции большинство генов, ранее кодировавшихся в геноме предшественника хлоропластов, было перенесено в ядро. Причем часть полипептидов, кодируемых этими генами, направляется обратно в хлоропласт, тогда как другая часть белков цианобактериального происхождения функционирует вне хлоропластов. Кроме того, многие эукариотические белки и белки митохондриального происхождения стали выполнять определенные функции в хлоропластах (Timmis et al., 2004). Пластидный геном (пластом) кодирует 125 -130 генов. Многие из этих генов организованы в опероны. Кодируемые пластомом белки включают в себя субъединицы РНК полимеразы бактериального типа, ферменты, участвующие в сплайсинге, рибосомные белки, фотосинтетические полипептиды, в том числе несколько основных белков тилакоидных комплексов, гены субъединиц НАДН дегидрогеназы и несколько белков с другими функциями. Кроме того, в пластоме есть гены для всех рРНК и тРНК хлоропластов (Sugiura, 1998).
Пластомы растений очень консервативны. Ввиду того, что большая часть хлоропластных генов была перенесена в ядро, а в хлоропластах остался определенный набор генов, общий практически для всех растений. Возникает вопрос, почему именно эти гены не были перенесены в ядро растительной клетки? Существует несколько гипотез, объясняющих, почему в хлоропластах сохранились функционально-активные гены (Allen, 2003a,b). По одной из них, хлоропластные гены оказались как бы "заперты" внутри хлоропласта, поскольку они кодируют сильно гидрофобные белки, транспорт которых из цитоплазмы оказался, вероятно, невозможным. По другой гипотезе, которая выглядит достаточно убедительной после определения полной первичной последовательности геномов ряда высших растений (Maier et al., 1995; Saski et al., 2005; Saski et al., 2007; Hirao et al., 2008), процесс переноса генов в ядро эволюционно не завершен, и мы, в настоящее время, являемся свидетелями этого процесса. Нельзя исключить, что он и не будет никогда завершен, из-за какого-то глобального природного катаклизма, который в прошлом приостановил перенос генов. Наиболее стройная теория называется CORR (co-location for redox regulation of gene expression; Allen, 2003a,b). Основной идеей в этой теории является то, что биосинтез некоторых генов, кодирующих белки тилакоидных мембран должен быстро и напрямую контролироваться окислительно-восстановительным статусом компонентов электрон-транспортной цепи и растворенными окислительно-восстановительно активными белками хлоропласта (Pfannschmidt, 2003). Было показано, что транскрипция генов psaA, psaB, psbA и psbB действительно изменяется под влиянием окислительно восстановительных сигналов от пула пластохинонов и других компонентов электрон-транспортной цепи (Pfannschmidt et al., 1999, Tullberget al.,2000).
Несмотря на то, что почти все хлоропластые белки кодируются ядром, гены пластома, очевидно, выполняют очень важные функции в пластидах, поскольку даже в нефотосинтезирующих растениях сохранилась функционально активная хлоропластная ДНК (Barbrook et al., 2006). В нефотосинтезирующих тканях зеленых растений пластиды играют роль метаболических станций, обеспечивая растение множеством продуктов своих биосинтезов (Hess and Borner, 1999).
Подавляющее большинство белков хлоропластов кодируется ядром. На N-конце у таких белков для транспорта в хлоропласты находится транзитный пептид. С помощью комплекса алгоритмов у Arabidopsis было предсказано 2100, а у риса 4800 хлоропластных белков ядерного кодирования (Richly and Leister, 2004). Причем, из них общими для обоих видов являются только половина белков, что может говорить о существенных различиях в функционировании хлоропластов у двудольных и однодольных растений. При применении экспериментального масспектрометрического метода в хлоропластах было определено 690 белков у Arabidopsis и 369 у риса (Klefmann et al., 2004, 2007). Среди них были обнаружены фотосинтетические белки и белки аминокислотного и углеводородного метаболизма, различные транспортеры, ассоциированные с внутренней и наружной мембранами хлоропластов, белки, участвующие в защитных реакциях, а также ферменты фолдинга и модификации белков, компоненты транскрипционной и трансляционной систем, белки, задействованные в репликации ДНК и функционировании клеточного цикла. Между количеством транскриптов ядерных генов, задействованных в функционировании хлоропластов, и количеством соответствующих хлоропластных белков была обнаружена сильная корреляция, что может свидетельствовать о регуляции ядерных хлоропластных генов преимущественно на уровне транскрипции (Lopez-Luez and Руке, 2005).
Выращивание бактерий в LB среде и сине-белая селекция
Бактерии Е. coli штамм DH5a, содержащие плазмиды pUC57 с необходимыми для работы фрагментами хлоропластной ДНК выращивали сначала на агаризированной LB среде (табл. 2), содержащей по 50 мг/мл IPTG и X-gal и 50 мкг/мл ампицилина. Посев бактерий на агаризованную среду проводили микробиологической петлей, колонии появлялись после ночи инкубации при 37С. Эти реактивы обеспечивают так называемую "бело-голубую селекцию", с помощью которой можно производить первичный скрининг бактериальных колоний: колонии белого цвета обычно содержат рекомбинантную плазмиду, колонии синего цвета - с большой вероятностью плазмиду без вставки. Это явление основано на том, что многие плазмиды имеют LacZ ген, кодирующий фермент необходимый для сбраживания лактозы. X-gal является искусственным аналогом лактозы, продукты его расщепления имеют синюю окраску. Регуляция транскрипции LacZ гена складывается из двух основных этапов. Во-первых, это субстратное регулирование, которое определяется наличием лактозы в среде. Во-вторых, для запуска транскрипции необходим индуктор, IPTG. Таким образом, если в среде присутствуют эти вещества, и бактерии несут вектор, имеющий LacZ ген, то колонии таких бактерий будут окрашены в синий цвет. Однако одной из отличительных особенностей LacZ гена, встроенного в плазмиды, от LacZ гена дикого типа является наличие полилинкера, встроенного в 5 -область гена. Полилинкер представляет собой искусственно синтезированный олигонуклеотид, несущий набор сайтов рестрикции, по которым происходит вставка чужеродного фрагмента ДНК. Его длина небольшая и он не влияет на активность белка, кодирующегося LacZ геном. Однако если в полилинкер встраивается какой-либо фрагмент, то последовательность гена им прерывается, и матричная РНК, считываемая с такого гена, чаще всего кодирует нефункциональный белок. Таким образом, бактерии, несущие плазмиды со вставкой, неспособны расщеплять X-gal, колонии таких бактерий остаются белого цвета. Однако иногда, при лигировании вектора без вставки плазмида утрачиваем несколько нуклеотидов. Это приводит к прерыванию LacZ гена и, хотя такой вектор не содержит вставки, колонии бактерий, содержащих данную плазмиду, будут белого цвета. Обратную ситуацию можно наблюдать, когда встроенный фрагмент (особенно если он небольшого размера) не изменяет рамку считывания гена, и колонии окрашиваются в синий цвет. Описанные выше возможные исключения делают бело-голубою селекцию методом первичного скрининга, данные которого необходимо подтверждать более прямыми методами. Для окончательного поиска бактерий с рекомбинантными плазмидами мы использовали метод выделения плазмидной ДНК с последующим рестрикционным анализом, метод ПЦР с выделенных плазмид и секвенирование фрагментов.
Для выделения препаративных количеств плазмидной ДНК применяли метод, разработанный ранее Birnboim and Doly (1979), с небольшими модификациями. Далее приведен состав растворов, необходимых для выделения плазмидной ДНК этим методом (табл. 3).
Переносили 100 мкл ночной культуры бактерий в 100 мл LB среды, добавляли ампицилин до концентрации 100 мкг/мл, растили ночь при 37С при - постоянном встряхивании. Переносили ночную культуру в стаканы для центрифугирования на 100 мл, центрифугировали 7 мин при. 4 тыс об/мин на центрифуге К-23. Отбрасывали супернатант, ресуспендировали осадок в 10 мл раствора I, инкубировали 3 мин при комнатной температуре. Добавляли 10 мл раствора II; осторожно перемешивали, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. ацетат натрия, рН 6.0 з.м. Добавляли 10 мл раствора III, осторожно перемешивали, переворачивая закрытый стакан, инкубировали 15 мин во льду. Центрифугировали 10-15 мин при 4 тыс об/мин, собирали супернатант, переносили его в новый стакан для центрифугирования. Добавляли равный объем изопропанола, перемешивали, инкубировали при -20С 1 час. Центрифугировали 15 мин при 4 тыс. об/мин, отбрасывали супернатант. Промывали осадок 5 мл 75% этанола, центрифугировали 3 мин при 4 тыс. об/мин. Отбрасывали спирт, высушивали осадок, растворяли его в 8 мл воды, добавляли 6 мл 6 М LiCI, инкубировали 30-60 мин во льду. Центрифугировали 10 мин при 4 тыс об/мин, переносили супернатант в новый стакан для центрифугирования, добавляли равный объем изопропанола (14 мл), инкубировали при -20С 1 час (или ночь). Центрифугировали 15 мин при 4 тыс об/мин, отбрасывали супернатант, промывали осадок 75% этанолом, центрифугировали 3 мин при 4 тыс об/мин. Отбрасывали спирт, высушивали осадок, растворяли его в 4.5 мл воды, добавляли 0.5 мл 10-кратного буфера для РНКазы и 15 мкл РНКазы А (10 мг/мл), инкубировали 30 мин при 37С. Для удобства переносили раствор в колбу на 30 мл, проводили депротеинезацию фенол-хлороформом. Центрифугировали смесь в пробирках на 30 мл 8 мин при 4 тыс. об/мин. Отбирали водную фазу, повторяли депротеинезацию еще раз со смесью фенол/хлороформ и один раз с хлороформом, для удаления остатков фенола. После обработки хлороформом отбирали водную фазу, добавляли 1/10 объема З М ацетата натрия рН 6.0 (примерно 0.5 мл) и равный объем (примерно 5 мл) изопропанола, инкубировали при -20С 1час (или ночь). Центрифугировали 15 мин при 4 тыс об/мин, отбрасывали супернатант, промывали осадок 75% этанолом, центрифугировали 3 мин при 4 тыс об/мин. Отбрасывали спирт, подсушивали осадок, растворяли в 100 мкл стерильной воды.
Иногда применяли былее быстрый метод выделения плазмидной ДНК, для которого использовали такие же растворы, что были описаны выше. Бактерии в этом случае выращивали в 4 мл LB среды, откуда отбирали 1,5 мл в стерильных условиях и переносили в пробирку на 1,5 мл. Осаждали клетки на максимальных оборотах настольной центрифуги без охлаждения (MiniSpin, Eppendorf), отбрасывали супернатант, клетки последовательно обрабатывали тремя вышеуказанными растворами (по 200 мкл), с той разницей, что к первому раствору добавляли 10 мкл РНКазыА (Юмг/мл). Далее, осаждали денатурировавшие белки и бактериальную ДНК также на настольной центрифуге, супернатант собирали в новые пробирки, проводили одну депротеинизацию фенол-хлороформом, затем хлороформом и осаждали ДНК изопропанолом 1 час при -20С. После последующего центрифугирования промывали осадок 75% этанолом, высушивали его и растворяли в деионизованной воде.
Интенсивность света влияет на транскрипцию хлоропластных генов и ее регуляцию цитокинином
Чтобы изучить роль интенсивности света в регуляции цитокинином транскрипции хлоропластных генов, был проведен ряд экспериментов, в которых ячмень выращивали и инкубировали отделенные от него листья при более слабой интенсивности освещения - 130 мкмоль квантов м 2с" .
Работа выполнена на апикальных сегментах листьев 9-дневных растений ячменя, которые были инкубированы в течение 24ч на воде в темноте или при постоянном освещении более слабой интенсивности (130 мкмоль квантов м" с" ). Полученные результаты приведены на рисунке 11. В данной постановке опыта транскрипция большинства генов при инкубации срезанных листьев на постоянном свету активировалась, особенно сильная активация наблюдалась у генов, кодирующих некоторые тРНК и рРНК, а также atpE, psbK и rpsl6 генов. При инкубации срезанных листьев в темноте транскрипция большинства генов снижалась. Важно отметить, что интенсивность транскрипции генов субъединиц РНК-полимеразы бактериального типа не изменялась ни на свету, ни в темноте, что позволяет говорить об отсутствии регуляции транскрипции светом данной группы генов. Ранее в нашей работе было показано (Zubo et al., 2008), что в условиях более сильной интенсивности света (270 мкмоль квантов м" с" ) транскрипция всех изученных хлоропластных генов после 24 часовой предынкубации на воде на свету снижалась по сравнению с интенсивностью транскрипции в интактных растениях. Таким образом, разная интенсивность освещения во время выращивания растений и инкубации срезанных листьев на воде по-разному влияет на транскрипцию хлоропластных генов в апикальных сегментах срезанных листьев 9-дненых растений ячменя: сильный свет и темнота во время инкубации срезанных листьев на воде подавляют транскрипцию, тогда как слабый свет ее активирует.
Было установлено, что в условиях освещения 130 мкмоль квантов м" с" содержание хлорофилла в листьях, срезанных с 4-дневных растений, при инкубации в течение 3 дней на воде существенно не изменялось (рис. 13 А). На растворе БАП у таких листьев наблюдалось слабое повышение содержания хлорофилла после одного дня инкубации, после чего этот показатель снижался до уровня контрольного варианта. Поэтому опыты на 4-дневных растениях не продолжались. Инкубация листьев 9-дневных растений на растворе БАП на второй и третий день приводила к небольшому повышению содержания хлорофилла в апикальных сегментах листьев, в базальных частях достоверного изменения в содержании хлорофилла в ходе инкубации не наблюдалось (рис. 13Б). Таким образом, при интенсивности освещения 130 мкмоль квантов M V1 у срезанных листьев 4- и 9-дневных растений при их инкубации на воде при постоянном освещении не происходит снижение содержания хлорофилла по сравнению с интактными листьями. На этом фоне БАП достоверно повышает его содержание только в наиболее старой, апикальной, части листьев 9-дневных растений на третий день инкубации.
В условиях яркого света (270 мкмоль квантов м" с" ) содержание хлорофилла в срезанных листьях 9-дневных растений при инкубации их на воде резко снижалось в течение пяти дней (Zubo et al., 2008). Причем наиболее сильное падение в содержании хлорофилла отмечалось в апикальных сегментах листьев. При инкубации таких листьев на растворе БАП за первые три дня содержание хлорофилла в апикальных частях листа повышалось примерно на 30%, а к пятому дню - снижалось до изначального уровня. Таким образом, в условиях яркого света содержание хлорофилла в срезанных листьях, инкубировавшихся несколько суток на воде, очень сильно снижалось. В то же время, БАП приостанавливал процесс разрушения хлорофилла, поддерживая его содержание на таком уровне, какой наблюдался в только что срезанных листьях и на третий день инкубации даже повышал его содержание (Zubo et al., 2008).
Следовательно, интенсивность света очень сильно влияет на содержание хлорофилла в срезанных листьях ячменя. При освещении 130 мкмоль квантов м" с" в срезанных листьях ячменя, инкубировавшихся на воде, содержание хлорофилла оставалось постоянным, тогда как при освещении 270 мкмоль квантов м"2с-1 его содержание снижалось. На этом фоне БАП в случае слабого света практически не повышал содержание хлорофилла, а при сильном свете не только поддерживал его содержание, но и значительно повышал. Ввиду того, что снижение содержания хлорофилла является одним из основных признаков прогрессирующего старения листа, сильное освещение способствует более быстрому старению листа, и в такой системе ярко проявляется влияние БАП на задержку старения. Напротив, при более слабом освещении ткани листа стареют медленнее, в срезанных листьях снижение содержания хлорофилла при инкубации на воде не наблюдается, БАП при этом немного повышает его содержание только в апикальных сегментах листьев 9-дневных растений. Таким образом, не только наличие или отсутствие света отражается на действии БАП на замедление старения в срезанных листьях ячменя, но и его интенсивность.
Чтобы определить, предшествовало ли задержке распада хлорофилла в листьях цитокинином его влияние на скорость транскрипции пластидных генов, листья ячменя, выращенного при интенсивности освещения 130 мкмоль квантов м" V , после срезания инкубировали на воде или растворе цитокинина в течение Зч. Результаты показали, что инкубация на растворе БАП в течение 3 часов срезанных листьев 4- и 9-дневных растений, выращенных при слабом освещении, не приводила к существенным изменениям интенсивности транскрипции изучаемых хлоропластных генов в апикальных сегментах листьев (рис. 14). Данные на рисунке 14 и в дальнейшем на аналогичных диаграммах представлены в виде десятичного логарифма отношения исследуемого варианта к контрольному (водному) варианту. Активация или ингибирование транскрипции мы условно считаем достоверным в том случае, когда интенсивность транскрипции исследуемого варианта больше или меньше контрольного не менее чем в два раза с учетом стандартных отклонений. То есть, значения десятичных логарифмов, которые больше значения 0.3 или которые меньше значения -0.3 по оси Y соотвествуют активации или ингибированию транскрипции более чем в 2 раза. Активация транскрипции цитокинином некоторых хлоропластных генов наблюдалась после 24ч инкубации срезанных листьев на растворе БАП при постоянном освещении в апикальных сегментах как 4-, так и 9-дневных растений.
Антагонистическое действие БАП и метилжасмоната на транскрипцию хлоропластных генов
Можно было ожидать, что МеЖа, подбно АБК, в первый период инкубации подавляет скорость транскрипции пластидных генов, что может быть, одной из причин ускорения старения листьев ячменя. Однако, инкубация срезанных листьев 4- и 9-дневных растений в течение 3 часов на растворе МеЖа насвету не повлияла на интенсивность транскрипции хлоропластных генов в апикальных сегментах листьев (рис. 26).
Увеличение времени обработки МеЖа листьев, срезанных с 4-дневных растений до 24 часов на свету, приводило к» существенному снижению в апикальных частях интенсивности транскрипции многих генов, а именно: большинства генов субъединиц АТФазы (atpB, atpE, atpF, atpH), ряда генов субъединиц НАДН-дегидрогеназы {ndhC, ndhl, ndhK), всех генов РНК-полимеразы (rpoB, rpoCl, гроС2), всех генов пп оперона (ггпіб, гт23, гт4.5-5, trnl), а также clpP, matK, petLG, rbcL, гріїб, rpl23-2 и rpsl6 генов. Транскрипция- остальных изученных генов также ингибировалась, но не достоверно (рис. 27).
Инкубация в течение 24 часов срезанных листьев 9-дневных растений на растворе МеЖа на свету приводила к ингибированию интенсивности транскрипции от 2 до 6 раз всех генов, как в апикальных, так и в базальных частях листьев (рис. 27). Такое подавление транскрипции всех изучаемых генов, возможно, является неспецифичным, и, ввиду длительности обработки, скорее всего, является следствием значительного ускорения-программы старения листа. Подобное влияние МеЖа ранее наблюдалось на тотальную транскрипцию хлоропластных генов семядолей кабачка (Ananieva et al., 2007). В наших экспериментах интенсивность транскрипции хлоропластных генов ингибировалась
МеЖа в апикальных и базальных частях листьев в среднем на 86% - 87%. В изолированных семядолях кабачка после 24 часов инкубации на МеЖа тотальная интенсивность транскрипции снижалась на 70%. Авторы этой статьи предполагают, что тотальное снижение транскрипции в обработанных МеЖа семядолях, определяется, главным образом, подавлением транскрипции фотосинтетических генов. Однако нами было установлено, что в листьях ячменя обработка МеЖа приводит к общему снижению транскрипции, в том числе и генов «домашнего хозяйства». Можно предположить, что данное тотальное ингибирование транскрипции координируется ядром, посредством снижения активности РНК полимеразы бактериального типа, что может быть связано или с подавлением экспрессии о-факторов или с изменением экспрессии каких-то других факторов транскрипции, транспортирующихся в хлоропласты. Вполне возможно также подавление активности и РНК-полимеразы фагового типа. Для более глубокого понимания механизма действия МеЖа требуются дополнительные исследования.
Инкубация свежесрезанных листьев в течение 3 часов на растворе МеЖа не привела к изменению интенсивности транскрипции. В работе Зубо с соавторами (Zubo et al., 2008) при изучении влияния БАЛ на транскрипцию хлоропластных генов в листьях ячменя была применена предынкубация листьев на воде при постоянном освещении в течение 24 часов, которая позволила наблюдать активацию транскрипции ряда генов после последующей инкубации листьев в течение 3 часов на растворе БАП. В статье Ананьевой с соавторами (Ananieva et al., 2007) была установлена корреляция между снижением интенсивности транскрипции хлоропластных генов под воздействием МеЖа и снижением содержания физиологически активных цитокининов в семядолях. Мы предположили, что этап предынкубации на воде приведет к большей чувствительности хлоропластной транскрипции к МеЖа из-за изменения гормонального статуса листа.
Схема проведения таких экспериментов представлена на рисунке 2В. После введения периода прединкубации листьев на воде в течение 24 часов при постоянном освещении и трех часов инкубации на растворе МеЖа транскрипция многих хлоропластных генов снижалась. Ингибирование интенсивности транскрипции наблюдалось только в базальных частях листьев (рис. 28). Наиболее сильно снижалась транскрипция генов субъединиц РНК-полимеразы бактериального типа. Кроме того, ингибировалась транскрипция почти всех генов АТФазы, clpP, matK, ndhK, petLG, psaA, psaB, psbA, psbB, гріїб, rpl23-2, 3 rpsl2, rpsl4, rpsl6 и trnl генов. Таким образом, введение этапа предынкубации срезанных листьев на воде выявило ряд генов наиболее отзывчивых на действие МеЖа, причем, ингибирование скорости транскрипции генов происходило только в более молодой ткани листа.
В целом, длительное действие МеЖа на срезанные листья ячменя приводит к сильному снижению содержанию хлорофилла, и неспецифическому ингибированию пластидной транскрипции. После предынкубации на воде в течение 24 часов, 3 часа обработки листьев МеЖа приводят к более специфическому подавлению транскрипции только в базальной части листа.
