Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 7
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
I. Устьичный аппарат
1. Анатомические особенности в связи с основными функциями -
газообменом и транспирациеЙ
Анатомия устъичного аппарата 10
Распределение устьиц 12
Работа устьиц и транспирация 13
2. Развитие устьичного аппарата
2.1. Особенности развития устъичного аппарата 14
2.2. Регуляция развития устьичного аппарата 20
3. Особенности физиологии замыкающих клеток устьиц 30
Особенности биоэнергетики замыкающих клеток устьиц 31
Особенности углеводного метаболизма 34
ФЕП-карбоксилаза замыкающих клеток устьиц 38
4. Функционирование устьичного аппарата 42
АЛ. Анатомо-физиологические изменения, сопровождающие у стьичные
движения 45
4.2. Транспорт ионов в замыкающих клетках устьиц 52
Транспортные системы плазмалеммы замыкающих клеток 53
Транспортные системы тонопласта замыкающих клеток 61
4.3. Сопряжение ионных потоков 68
Открывание устьиц 69
Закрывание устьиц 72
5. Регуляция устьичных движений
Общие принципы регуляции 78
Предполагаемые механизмы фоторегуляции устьичных движений
Рецепторы СС в замыкающих клетках устьиц 83
Рецепторы КС в замыкающих клетках устьиц 87 II. Фитохромная система растений 89 1. Спектральные и молекулярные свойства фитохромов
Структура фитохрома 90
Спектральные свойства и фотохимия 93
Биосинтез фитохромов 95
Разнообразие фитохромов 95 2. Функционирование фитохромной системы 97
2.1. Пути передачи сигнала 97
Взаимодействие с криптохромами 100
Взаимодействие с фитогормонами 100
Содерэюание Сахаров, как регуляторный сигнал. Взаимодействие с фитохромным сигналом 101
2.2. Классификация фитохром-зависимых реакций по интенсивности и
качеству действующего света 102
2.3. Фитохромные реакции в развитии растений 104
III. Биологические часы растений.
1. Основные принципы устройства и функционирования
биологических часов 108
Современные представления о механизме биологических часов 109
Каноническая модель часов
Осциллятор ПО
Взаимодействие с окружающей средой. "Вход " сигнала 111
"Выход"сигнала 111
1.3. Молекулярные основы регуляции генов, участвующих в работе
биологических часов и контролируемых часами 113
Регуляция транскрипции 113
Регуляция процесса накопления транскрипта 113
Посттрансляционная регуляция в работе биологических часов 114
1.4. Посттрансляционный осциллятор: возможно, новый механизм работы
биологических часов 115
2. Биологические часы растений на примере Arabidopsis thaliana 116
2.1. Вход сигнала и настройка часов Arabidopsis thaliana 117
2.1.1. Светозависимая настройка биологических часов 117
2.1.2. Настройка биологических часов циклическими изменениями
температуры 121
2.1.3. «Включение» и исходная настройка биологических часов 121
Центральный осциллятор биологических часов Arabidopsis thaliana 121
Выход сигнала и ритмические процессы
Экспрессия генов 127
Кальций 129
Связь ритмической экспрессии генов с внешними ритмами 129
Температурная компенсация 130
Сколько часов в растении? 131
Зачем растениям биологические часы? 132 ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 134 ГЛАВА П. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследований и условия выращивания 136
Световая микроскопия 138
Определение среднего осмотического давления клеточного сока методом начинающегося плазмолиза 139
Электронная микроскопия 141
Приготовление и заливка препаратов
Получение и анализ срезов
Измерение спектров поглощения, пропускания и отражения 141
Условия освещения 142
Измерение спектра действия устьичных движений в красной области спектра действующего света
Устройство установки 143
Процедура измерений
Светозависимое открывание устьиц 144
Светозависимое закрывание устьиц 145
7.3. Построение спектра действия устьичных движений в красной
области спектра действующего света 145
8. Определение интенсивности (скорости) и ускорения транспирации
целого листа методом дифференциальной психрометрии
Устройство и принцип работы установки 146
Процедура измерений интенсивности и скорости транспирации 150
Расчеты
Интенсивность (скорость) транспирации 152
Ускорение (скорость изменения интенсивности) транспирации 153
Параметры ритмов 153 9. Представление результатов и обработка данных 154 ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Морфологические, ультраструктурные и физиологические
параметры замыкающих клеток устьиц исследованных растений
Линейные размеры устьиц 156
Среднее осмотическое давление в замыкающих клетках устьиц 158
Ультраструктура пластид замыкающих клеток устьиц гороха дикого типа и бесхлорофильного мутанта XL-18. 161
Оптические свойства листьев растений гороха дикого типа и бесхлорофильного мутанта XL-18. Расчеты интенсивности действующего монохроматического света, достигающего устьичных клеток 164
Влияние монохроматического света на скорость транспирации листьев гороха дикого типа и мутанта XL-18.
3.1. Влияние синего света на ускорение транспирации (і) растений гороха
дикого типа и бесхлорофильного мутанта XL-18 170
3.2. Влияние красного и дальнего красного света на ускорение
транспирации бесхлорофильного мутанта гороха XL-18 171
3.3. Дозовая зависимость ответа на красный свет бесхлорофильного
мутанта гороха XL-18 174
3.4. Влияние красного и дальнего красного света на ускорение
транспирации растений гороха дикого типа
Освещение КС с последующим освещением ДКС 174
Освещение ДКС с последующим освещением КС 177
Освещение ДКС абаксиальнои стороны листьев растений гороха дикого типа 178
4. Спектр действия устьичных движений 179
Подбор условий для получения спектра действия 179
Световые кривые и спектр действия 183
5. Исследование роли фитохромной и фотосинтетической
составляющих в регуляции транспирации. Ритмы транспирации
5.1. Исследование суточных изменений транспирации растений гороха
дикого типа и бесхлорофильного мутанта XL-18
5.1.1. Ритмы транспирации растений гороха дикого типа на
естественном фотопериоде и в постоянной темноте 185
5.1.2. Ритмы транспирации бесхлорофиллъного мутанта гороха XL-18 на
естественном фотопериоде и в постоянной темноте 188
5.2. Исследование суточных изменений транспирации растений томата
дикого типа и бесфитохромного мутанта аигеа 190
Ритмы транспирации растений томата дикого типа на естественном фотопериоде и в постоянной темноте 191
Ритмы транспирации бесфитохромного мутанта томата аигеа на естественном фотопериоде и в постоянной темноте 193
6. Исследование ритмов устьичных движений 196
6.1. Ритмы устьичных движений растений гороха дикого типа и
бесхлорофиллъного мутанта XL-18 199
6.2. Ритмы устьичных движений растений томата дикого типа и
бесфитохромного мутанта аигеа 201
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 202
ВЫВОДЫ 204
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 205
ПРИЛОЖЕНИЯ 207
Список цитированной литературы 211
Введение к работе
Необходимость контроля процессов газообмена и водообмена для роста, развития и продуктивности растений трудно переоценить. Важной составляющей этого контроля являются движения замыкающих клеток устьиц, обеспечивающих как газообмен, так и испарение воды (транспирацию). Вследствие этого устьичный аппарат представляет собой яркий пример высокоспециализированного образования с комплексной регуляцией, осуществляющего связь с окружающей средой, и, в то же время, находящегося под контролем растительного организма.
Одним из основных факторов окружающей среды, регулирующих работу устьичного аппарата, является свет. Согласно современным представлениям, практически все известные фоторецепторы растений участвуют в фоторегуляции устьичных движений: рецепторы синего света (СС) и ультрафиолета (УФ) - фототропины (Kinoshita et al., 2001), криптохромы (Мао et al., 2005) и зеаксантин (Talbott et al., 2003a). Показано, что СС низкой интенсивности вызывает увеличение концентрации растворимых Сахаров в замыкающих клетках за счет деградации крахмала, тогда как СС высокой интенсивности вызывает накопление К+ и также деградацию крахмала, но сопряженную с синтезом малата (Tallman, Zeiger, 1988). При этом фототропины вызывают активацию Н^-АТФазы плазмалеммы замыкающих клеток, что в свою очередь приводит к изменению направления транспорта ионов и накоплению К+ в этих клетках (Kinoshita et al., 2001; Liscum et al., 2003). Пути передачи сигнала от криптохромов интенсивно изучаются, однако пока известен лишь один компонент сигнального каскада и не ясно, как он связан с изменением содержания осмотиков в замыкающих клетках (Yang et al., 2001; Мао et al., 2005). Сигнальный каскад, связанный с участием зеаксантина пока существует лишь в теории (Zeiger, 2000) и не имеет экспериментальных подтверждений.
Ситуация с рецепторами красного света (КС) еще более неоднозначна. Большинство исследователей относили ответы на КС к хлорофилл-зависимым, опосредованным работой фотосинтетического аппарата самих замыкающих клеток устьиц и (или) подлежащих клеток мезофилла
(Vavasseur, Raghavendra, 2005). Однако ряд авторов получили косвенные доказательства участия в регуляции устьичных движений рецептора КС -фитохрома (Habermann, 1973; Roth-Bejerano, Itai, 1981; Eckert, Kaldenhoff, 2000; Talbott et al., 2003b). Таким образом, теоретически две рецепторные системы: хлорофилл-зависимая и фитохром-зависимая, - могут регулировать процессы устьичных движений и транспирации в ответ на КС, однако участие фитохромов в регуляции этих процессов нуждается в дополнительных прямых доказательствах.
Эндогенным механизмом, обеспечивающим тонкую настройку работы устьичного аппарата, являются биологические часы. Циркадные (с периодом около суток) ритмы устьичных движений являются одним из классических примеров работы биологических часов растений. Показано, что механизм биологических часов подстраивается к 24-часовому периоду и местному времени с помощью ежесуточных колебаний свет/темнота и в этом процессе участвует ряд фоторецепторов растений - криптохромы и фитохромы. В свою очередь, часы регулируют экспрессию генов этих фоторецепторов, а также фазу (фотофильная и скотофильная) и амплитуду фотоответов (Gardner et al., 2006). В таком случае встает вопрос, какие именно фоторецепторы участвуют в настройке суточного ритма устьичных движений - фитохромы или (и) рецепторы синего света?
Наиболее адекватным подходом для решения этой задачи является изучения КС-зависимых ответов на бесхлорофильных мутантах, лишенных фотосинтетической составляющей ответа. Этот подход активно использовался, однако в литературе содержатся единичные упоминания об экспериментах на истинных бесхлорофильных растениях (Skaar, Johnsson, 1980), ряд авторов использовали вариегатные растения (Laffray et al., 1991), в которых, однако, возможно наличие нормальных хлоропластов в замыкающих клетках устьиц, расположенных над бесхлорофильными участками мезофилла (Virgin, 1957; Sharkey, Ogawa, 1987); некоторые авторы использовали растения, обработанные гербицидами (Karlsson et al., 1983; Sharkey, Ogawa, 1987), значительно изменяющими метаболизм.
Таким образом, до наших исследований на бесхлорофильных растениях не было прямых доказательств участия фитохрома в регуляции устьичных
движений и транспирации. Ранее в нашей лаборатории на бесхлорофильном мутанте гороха XL-18 было показано КС-зависимое увеличение скорости транспирации. Детальное изучение этого феномена и стало основным направлением наших исследований.
Целью данной работы было изучение природы КС-зависимых транспирационных и устьичных ответов с использованием бесхлорофильных и бесфитохромных мутантных растений, а также выявление различий в регуляции циркадных ритмов устьичных движений и транспирации рецепторами красного света.
