Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 6
2.1 Роль цитокинина в развитии и функционировании хлоропластов. 6
2.1.1 Регуляция цитокинином развития пластид. 6
2.1.2 Влияние цитокинина на содержание и активность хлоропластных белков. 8
2.1.3 Эффект цитокинина на транскрипцию и пост-транскрипционньте процессы РНК хлоропластных генов . 10
2.2 Регуляция транскрипции в хлоропластах. 12
2.2.1 Организация пластома. 12
2.2.2 РНК-полимеразы пластид. 14
2.2.3 Транскрипционные факторы. 19
2.2.3.1 Сигма факторы. 19
2.2.3.2 Другие трапс-факторы. 24
2.2.4 Промоторы. 27
2.2.5 Регуляция транскрипции хлоропластных генов. 31
2.2.6 Заключение, 36
3. Материалы и методы исследования 37
3.1 Объект исследования. 37
3.2 Выделение хлоропластов из листьев ячменя. 37
3.3 Бактериальные штаммы и векторы, 40
3.4 Выделение ДНК. 40
3.4.1 Выделение тотальной растительной ДНК. 40
3.4.2 Выделение хлоропластной ДНК. 41
3.4.2.1 Выделение ДНК из изолированных хлоропластов. 41
3.4.2.2 Выделение хлоропластной ДНК в растворе высокой ионной силы. 41
3.4.3 Выделение плазмидной ДНК. 42
3.4.3.1 Микровыделение плазмидной ДНК. 42
3.4.3.2 Макровыдслепие плазмидной ДНК. 43
3.5 Клонирование фрагментов ДНК. 44
3.5.1 Подбор праймеров к клонируемому гену, 44
3.5.2 Полимеразная цепная реакция. 45
3.5.3 Электрофорез ДНК в агарозном геле. 47
3.5.4 Элюция фрагментов ДНК из геля. 48
3.5.5 Лигирование. 48
3.5.6 Трансформация клеток Е. соїі лигационпой смесью. 49
3.5.6.1 Приготовление компетентных клеток. 49
3.5.6.2 Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК. 50
3.5.7 Выращивание бактерий на агаризованной LB среде. 51
3.5.8 Поиск бактериальных колоний, несущих рекомбинантные плазмиды . 51
3.6 Рестрикция фрагментов ПЦР, плазмидной и хлоропластной ДНК. 54
3.7 Метод run on транскрипции, 57
3.7.1 Нанесение фрагментов ДНК на нейлоновую мембрану. 57
3.7.2 Подсчет количества хлоропластов. 57
3.7.3 Синтез меченных транскриптов в хлоропластом лизате. 58
3.7.4 ДНК-РНК гибридизация. 59
3.7.5 Экспозиция нейлоновой мембраны с рентгеновской пленкой и анализ результатов. 60
3.8 Нозсрп (Nothern) гибридизация. 60
3.8.1 Выделение тотальной растительной РНК с помощью триозола. 60
3.8.2 Электрофорез РНК в агарозном геле. 61
3.8.3 Перенос РНК на нитроцеллюлозную мембрану. 61
3.8.4 Синтез меченого зонда. 62
3.8.5 РНК-ДНК гибридизация. 62
3.8.6 Экспозиция нитроцеллюлозной мембраны с рентгеновской пленкой и анализ результатов . 63
4. Результаты и обсуждения 64
4.1 Клонирование фрагментов хлоропластных генов. 64
4.2 Эффект эндогенных и экзогенных факторов на регуляцию транскрипции
индивидуальных хлоропластных генов цитокинином. 70
4.2.1 Влияние цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов в листьях
первого яруса 4-дневных проростков ячменя. 70
4.2.2 Поиск условий постановки эксперимента, при которых экзогенный цитокинин регулирует транскрипцию хлоропластных генов в листьях ячменя. 75
4.2.3 Влияние экзогенного цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов в листьях первого яруса 4-дпевных проростков ячменя, выращенных на перлите. 77
4.2.4 Влияние цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов в листьях первого яруса 9-дневных проростков ячменя. 81
4.2.5 Влияние цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов в листьях первого яруса 9-дпевных проростков ячменя, прединкубированных 24 часа на воде . 84
4.3 Некоторые аспекты регуляции транскрипции хлоропластных генов ячменя цитокинином. 89
4.3.1 Влияние постоянного освещения на этапе прединкубации на регуляцию транскрипции хлоропластных генов ячменя цитокинином. 89
4.3.2. Регуляция транскрипции хлоропластных генов ячменя цитокинином в разных зонах листа и в листьях, отделенных от растений разного возраста. 92
4.3.3 Регуляция транскрипции хлоропластных генов ячменя цитокинином в изолированных хлоропластах. 99
4.3.4 Исследование регуляции транскрипции хлоропластных генов цитокинином в листьях мутанта ячменя albostrians. 103
4.3.5 Влияние цитокинина на тотальное содержание индивидуальных РНК некоторых хлоропластных генов. 105
5. Заключение 107
6. Выводы 111
7. Список литературы 113
8. Список сокращений 136
- Эффект цитокинина на транскрипцию и пост-транскрипционньте процессы РНК хлоропластных генов
- Поиск бактериальных колоний, несущих рекомбинантные плазмиды
- Экспозиция нитроцеллюлозной мембраны с рентгеновской пленкой и анализ результатов
- Влияние цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов в листьях первого яруса 9-дпевных проростков ячменя, прединкубированных 24 часа на воде
Введение к работе
Исследование механизма экспрессии генетической информации является одним из центральных вопросов современной биологии растений. Изучение принципов регуляции и регуляторных факторов дает возможность не только понять фундаментальные аспекты внутриклеточных процессов, по и, целенаправленно изменяя структуру генотипа, создавать более продуктивные сорта и линии растений.
Процесс транскрипции является первой стадией экспрессии генов, поэтому именно этот этап, зачастую, определяет количество транскриптов и, в конечном итоге, количество белка в клетке. Такая ситуация наблюдается для многих генов прокариот и генов ядерных геномов растений. Хотя хлоропласты и являются потомками бактерий, для них наиболее изученными, с точки зрения регуляции, являются этапы синтеза и функционирования белков. В регуляции этих процессов активное участие принимают свет - как внешний фактор регуляции и, фитогормоиы - как внутренние факторы.
Активация многих процессов в хлоропластах цитокинином была показана более 40 лет назад в работах К. Мотеса, О.Н. Кулаевой, И.Н. Свешниковой и др. (Mothes et.al., 1959, Кулаева, 1973, Свешникова и др., 1966). Точно установлено влияние цитокинина на накопление фотосинтетических пигментов, ультраструктуру хлоропластов, активность фотосинтетических ферментов, синтез хлоропластной рРНК, фотосинтетическую активность (Кулаева, 1973; Parthier, 1979; Kusnetsov et.al., 1994; Мекеев и др., 1996). Большинство ученых признают ведущую роль посттранскрипционных процессов в регуляции экспрессии пластидного генома.
В последние годы показана значительная сложность транскрипционного аппарата хлоропластов. Было установлено, что в пластидах функционируют, как минимум, две РНК-полимеразы: мультисубъединичная РНК-полимераза пластидного кодирования (PEP) и моносубьединичпая РНК-полимераза ядерного кодирования (NEP) (Hess and Boemer, 1999). Идентифицированы ядерные гены сигма-факторов РНК-пол имеразы пластидного кодирования. Разработаны удобные биологические модели для изучения роли РНК-полимераз в хлоропластной транскрипции. Стали накапливаться данные о световой регуляции транскрипции хлоропластных генов (Dubell and Mullet, 1995; Iratni et.al,, 1997). Однако, несмотря на большие успехи в изучении механизма световой регуляции транскрипции, до настоящего времени ни кем не была показана гормональная регуляция экспрессии пластидных генов на уровне транскрипции. На возможность существования такой регуляции указывали данные об активации тотальной хлоропластной транскрипции в условиях in vitro комплексом транс-зсатина с хлоропластным цитокинин-связывающим белком из листьев ячменя (Люкевич и др., 2002). Отсутствие данных по влиянию цитокинина на уровне транскрипции индивидуальных пластидных генов и перспективность изучения данного вопроса для понимания механизмов регуляции биогенеза хлоропластов и определили цель нашей работы.
Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы состояла в изучении гормональной регуляции экспрессии хлоропластных генов па уровне транскрипции.
Для ее достижения были поставлены следующие задачи:
1. Выбрать для анализа гены, входящие во все известные опероны пластидной ДНК ячменя, кодирующие функционально различные белки и РНК, провести клонирование фрагментов этих генов, оптимизировать основные этапы run on транскрипции.
2. Разработать биологическую систему на основе изолированных листьев ячменя, позволяющую изучить участие цитокинина в регуляции транскрипции пластидных генов.
3. Исследовать влияние света, возраста листьев и ряда других факторов на гормональную регуляцию транскрипции пластидных генов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Разработана биологическая система, позволяющая изучить участие цитокинина в регуляции транскрипции индивидуальных хлоропластных генов ячменя. Впервые показан факт гормональной регуляции хлоропластных генов на уровне транскрипции. Исследована регуляция цитокинином экспрессии 26 функционально различных хлоропластных генов. Показана зависимость такой регуляции от света (экзогенный фактор) и возраста растений (эндогенный фактор). Это вносит существенный вклад в понимание механизмов регуляции биогенеза хлоропластов фитогормонами и светом. Полученные результаты могут быть использованы для разработки теоретических основ управления продуктивностью растений.
Эффект цитокинина на транскрипцию и пост-транскрипционньте процессы РНК хлоропластных генов
Другим хлоропластным белком ядерного кодирования, для которого показана индукция накопления под действием цитокинина, является апопротеин хлорофилл, а/б связывающего полипептида ССК II. Такая индукция показана для суспензионной культуры клеток, полученной из каллюса паренхимы стебля табака (Lescure, Scyer, 1981), в культуре ткани Diantus caryophyllus (Szweykowska, 1992). В стареющих листьях ячменя показана не только индукция синтеза полипептида, но и предотвращение его деградации (Jockowski et. al., 1991).
Наиболее основательные исследования по влиянию цитокинина на содержание белков, необходимых для фотосинтеза были проведены в лаборатории экспрессии генома института Физиологии растений В.В.Кузнецовым (Кузнецов В. В., 1995). Методом имуноблотипга было тестировано накопление полипептидов, входящих в состав четырех основных белковых комплексов тилакоидных мембран, под действием света и гормона. Данные исследования позволили разделить исследуемые белки на три группы: 1. Конститутивный синтез полипептидов в темноте со слабой регуляцией их накопления цитокинипом и светом (апопротеины цитохромов Ъ6 и f, бета- и эпсилон-субъединицы АТФ-синтетазы, БС РБФК). 2. Абсолютная зависимость появления и накопления полипептидов от света. Цитокинин не индуцирует синтез указанных белков в темноте, но значительно активирует их накопление на свету (субъедипица 1 ФС-1 и 43 кД хлорофилл-связывающий полипептид ФС-2). 3. Цитокинин-зависимыс белки, синтез которых индуцируется цитокинипом в темноте (апопротеин цитохрома Ь559 ФС-2, субъедипица IV цитохромиого b/f комплекса и белок 33 кД кислородовыделяющего комплекса). Установлено, что белки, входящие в один функциональный комплекс, могут по разному регулироваться цитокинипом, даже если их гены относятся к одному оперону. Интенсивность реакции на цитокинин таких белков по времени тоже различна -полипептиды относящиеся к одному комплексу могут появляться под действием цитокинина с большим интервалом во времени (до 60 часов).
Экспериментально показано несколько возможных путей индукции накопления хлоропластных белков под действием цитокинина. На изолированных семядолях тыквы Клячко и Кулаевой было показано, что цитокинин индуцирует сборку полисом из предшествующих в такни моносом и мРНК (Klyachko et. al., 1979). Уже через час после обработки семядолей цитокинином значительное количество моносом были обнаружены в составе полисом. На основании того, что на этот процесс практически не влиял кордицепин и альфа-аманитин, авторы пришли к выводу, что сборка плисом в их экспериментах идет, главным образом, па предсуществующих матрицах. Таким образом, цитокинин активизирует синтез белка, увеличивая "размер" аппарата трансляции, повышая активность работы каждой полисомы и осуществляя сборку полисом из предсуществующих матриц и моносом.
Цитокинин может активизировать процесс трансляции, вызывая фосфорелирование рибосомалыгых белков (Yakovleva, Kulaeva, 1987), Так же цитокинин может индуцировать накопление белковых факторов трансляции, как это было показано для фактора элонгации - EEF-1, выделенного из Arabidopsis thaliana (Gidekel et, al., 1994).
Таким образом, в приведенных работах убедительно показано стимулирующее действие цитокинина на накопление хлоропластных белков как хлоропластного, так и ядерного кодирования. Несомненно, что регуляция цитокинином происходит как минимум па трансляционном уровне.
Регуляция цитокинином процессов, влияющих па накопление РНК хлоропластных генов, изучена очень слабо. Благодаря активной транскрипции и возможности отделения от РНК цитоплазмы одним из первых было начато изучение регуляции рРНК. Было показано, что при инкубации в темноте дисков из листьев табака наблюдалась более быстрая убыль хлоропластной рРНК, чем цитоплазматической, однако БАП предотвращал процесс убыли рРНК (Takegami, 1975). В то же время он не влиял на содержание хлоропластной рРНК па свету. В других работах была показала активация цитокинином синтеза как хлоропластной, так и цитоплазматической рРНК и в темноте и на свету (Ananievet. al., 1987).
В ряде работ показано, что пластиды, находящиеся на разных стадиях развития включали ЗН-уридин в РНК хлоропластов из обработанных цитокинином семядолей более активно, чем из семядолей, инкубированных на воде (Mikulovich et. al., 1978; Neumann, Khokhlova, 1981). Оригинальный подход для доказательства слияния цитокинииа на набор транскриптов хлоропластных генов использовали Сойер и Лескьюер (Seyer, Lescure, 1984), работавшие на суспензионной культуре клеток табака. Они фракционировали в агарозном геле фрагменты, полученные при расщеплении хлДНК различными рестриктазами, и после переноса на нитроцеллюлозный фильтр гибридизовали их с высокомечепной (в условиях in vivo) РНК, выделенной из культуры клеток. РНК, выделенная из клеток, росших в присутствие цитокинииа, гибридизовалась не с теми фрагментами хлДНК, с которыми гибридизовалась РНК, выделенная из контрольных клеток. Такой подход говорит об избирательном влиянии цитокинииа на экспрессию различных хлоропластных генов, но не дает ответ о конкретных генах. В нескольких работах авторами показана положительная регуляция накопления мРНК rbcL гена под действием цитокинииа (Lerbs et. al., 1984; Abel et. al., 1989).
Исследуя гормональную регуляцию 15 генов хлоропластных белков пластидного и ядерного кодирования на уровне накопления соответствующих мРНК, Кузнецовым с соавторами показали, что цитокшшн существенно активизирует накопление транскриптов ядерных генов и слабее влияет на накопление мРНК хлоропластных генов (Кузнецов В. В., 1995).
Однако, почти во всех работах, посвященных данной проблеме авторами тестировалось тотальное содержание матриц, вследствие чего трудно сказать на каком этапе экспрессии (транскрипционном или пост-транскрипционном) происходит регуляция.
Наиболее явное доказательство регуляции именно транскрипции хлоропластных генов было получено в лаборатории экспрессии растений института Физиологии растений (Романко и др., 1982; 1986; 1991; Люкевич и др., 2002; Зубо и др., 2004). Были проведены эксперименты, в ходе которых хлоропласты в условиях in vitro более активно включали меченые предшественники в тотальную РНК в варианте с добавлением цитокинииа и ЗСБ (зеатин-связывающий белок), чем в контрольном варианте, или вариантах с одним цитокининм или ЗСБ. Поскольку реакция транскрипции в данных экспериментах не превышала по времени 10 мин можно сделать вывод о влиянии гормона именно на процессы транскрипции. Таким образом, показана принципиальная возможность регуляции транскрипции хлоропластных генов цитокинином. Однако до сих пор оставалась неизвестной реакция индивидуальных генов па гормон.
Поиск бактериальных колоний, несущих рекомбинантные плазмиды
Последовательности, гомологичные митохондриальным промоторам найдены вблизи точки начала транскрипции многих пластидных генов и подробно проанализированы (Hess, Borner, 1999; Weihe, Borner, 1999). Показано, что промотор NEP состоит из двух элементов: GAA-бокс (-35) и YRT-бокс (-7). Однако часть промоторов не имеет GAA-бокса, а для многих вообще не найдено консервативных элементов. Мутационный анализ, проведённый пока только для 3 промоторов одного вида (N. tabacum), подтверждает такую классификацию: промотор ШрВ состоит из двух функциональных элементов [(GAA и YRT) Kapoor, Sugiura, 1999; Xie, Allison, 2002], Промотор гроВ имеет только один элемент [(YRT) Liere, Maliga, 1999], а промотор clpP(-53) - ни одного (Sriraman et al., 1998а). Сила промотора clpP(-53) зависит от участка, расположенного ниже сайта инициации транскрипции (-5 - +25), что напоминает промоторы ядерной РНК-полимеразы III (Paule, White, 2000). Сходная ситуация описана ранее для пластидных генов тРНК (irnRl и SI) S. oleracea: устранение последовательности ДНК вплоть до старта инициации транскрипции (+1) не влияет на интенсивность транскрипции этих генов (Gruissem et al., 1986). Возможно, NEP узнаёт эти промоторы с помощью специфичных транс-факторов, подобных CDF2 и/или сигма-подобным факторам митохондриальных РНК-полимераз, являющихся ортологами NEP (обзор Shadel, Clayton, 1993; Ikeda, Gray, 1999a).
Таким образом, часть пластомных промоторов гомологична -10/-35 промоторам бактерий (РЕР-промоторы), другая часть сходна с GAA/YRT промоторами моносубъединичных РНК-полимераз (NEP-промоторы), третья часть промоторов отличается от типичных промоторов PEP и NEP. Эти неконсервативные промотры могут взаимодействовать с PEP (как СРП psbD) или с NEP (как PC ггпіб) при помощи специальных транс-факторов, или их транскрипция обеспечивается неизвестной пока РНК-полимеразой.
Кроме промоторов в пластоме существуют и другие унс-элементы. У арабидопсиса, табака и шпината обнаружены структуры, подобные энхансерам и сайленсерам (Inada et al., 1997), а у С. reinhardtii - действующий энхансер (Anthonisen et al., 2002).
Пластомные промоторы имеют несколько особенностей своего расположения. Множественные промоторы существуют в про- и эукариотических системах, но в пластоме они распространены очень широко. Большая часть пластомных генов может транскрибироваться обеими РНК-полимеразами и, следовательно, имеет не менее двух промоторов. Рибосомальпый опероп имеет 4 потенциальных промотора, но у разных растений функционируют 1-2 из них (Lerbs-Mache, 2000). Гены табака clpP и ШрВ так же имеет по 4 промотора, один из которых NEP-промотор (VclpP-53 и PatpB-289), остальные - РЕР-промоторы (РфР-95, РфР-173, фР-5П; PatpB-255, PatpB-Ш, PatpB-6\\) (Orozco et al., 1990; Hajdukiewicz et al., 1997; Sriraman et al., 1998a; Xie, Allison, 2002). Гены/опероны, транскрибируемые одной РНК-полимеразой, также могут иметь несколько промоторов. Например, psbD-оперон, транскрибируемый PEP, имеет по 3-4 промотора у разных видов растений (Berends-Sexton et al., 1990а; Christiopher et al., 1992; Satoh et al., 1997).
Ещё одна особенность пластома - компактность. Например, у риса некодирующие последовательности занимают лишь 32% птДНК (Hiratsuka et al., 1989). Вследствие этого промоторы часто располагаются близко друг к другу и конкурируют за возможность связаться с РНК-полимеразой. Например, промоторы генов rbcL и atpB располагаются на разных нитях птДНК и разделены расстоянием менее 100 нукулеотидов. У табака -10 элементы промоторов rbcL и PatpB-Ы 1, повидимому, перекрываются (Orozco et al., 1990). Оба промотора взаимодействуют с PEP (Orozco et al., 1990; Allison et al., 1996; Hajdukiewicz et al., 1997). Присутствие промотора rbcL на столь близком расстоянии уменьшает силу промоторов ШрВ в несколько раз (Bradley, Gatenby, 1985). У разных растений обнаружено несколько близко расположенных, почти перекрывающихся промоторов рибосомального оперопа (Lerbs-Mache, 2000). У большинства растений активен промотор -117 Р2 (PEP), близко расположенный промотор -142 PC (NEP) не активен. У шпината транскрипционный фактор CDF2 блокирует взаимодействие PEP с её промотором Р2 и делает возможным взаимодействие NEP с промотором PC (Iratni et al., 1997; Sriraman et al, 1998b; Bligny ct al., 2000). Очень похоже располагаются промоторы atpB табака: -255 (PEP) и -289 (NEP) (Xie, Allison, 2002).
В пластидах промоторы не только располагаются близко друг к другу, но и к другим генам. Некоторые из них находятся в кодирующей части других генов. Так промоторы генов гр132 и clpP (-511) совпадают на противоположной нити ДНК с кодирующей последовательностью генов ndhF (Vera et al., 1992; 1996) и psbB (Hajdukiewicz et al., 1997) соответственно. Промоторы генов aipE и psbC, по-видимому, располагаются в кодирующей этой же нитью ДНК последовательности генов atpB и psbD соответственно (Zurawski et al., 1982; Yao et al., 1989; Kapoor et al., 1994). А энхансер гена rbcL С. reinhardtii расположен в кодирующей части своего гена (Anthonisen et al., 2002)
На данный момент наиболее изучена регуляция транскрипции хлоропластных генов двумя факторами - генетической программой развития и светом. Регуляторная роль программы развития реализуется во время дифференциации, развития и старения клеток. Так, для ряда хлоропластных генов показано, что динамика транскрипции на предшествующих и последующих стадиях различается, активация транскрипции генов не зависит от способности клеток формировать зрелые хлоропласты (Satoh et ah, 1999; Emanuel et al., 2004), Следовательно, такая активация обусловлена программой развития, записанной в геноме. Другим примером реализации программы развития могут служить ядерные гены, кодирующие 0-факторы - наблюдается дифференциальная экспрессия таких генов в различных тканях и органах растения.
В целом транскрипция пластома увеличивается во время превращения этиопластов (и, видимо, пропластид) в хлоропласты (Deng, Gruissem, 1987; Klein, Mullet, 1990; Krupinska, Apel, 1989; Schrubar et al., 1990), и уменьшается при превращении хлоропластов в хромопласты и амилопласты (Deng, Gruissem, 1988; Ngernprasirtsiri et al., 1990b; Kobayashi et al., 1990). При этом происходит синхронное изменение транскрипции большинства изученных генов. Одни аналитики объясняли это как отсутствие дифференциальной регуляции отдельных генов, и изменение только общей интенсивности транскрипции (Gruissem, 1989). Есть и другое объяснение (Mullet, 1993), Белки и РНК пластомного кодирования нужны для фотосинтеза, либо для самого процесса, либо для экспрессии фотосиитетических генов. Практически все они входят в состав сложных комплексов (РНК-поли мераза, рибосомы, фотосинтетичесие комплексы) и нужны в определённых пропорциях, поэтому следует ожидать существование механизмов, поддерживающих пропорциональный синтез, в том числе и на уровне транскрипции. Действительно, в целом транскрипция генов изменяется сходным образом, но всё же наблюдаются отличия в "поведении" отдельных генов. Это свидетельствует в пользу того, что регуляция транскрипции пластома осуществляется через дифференциальную регуляцию транскрипции отдельных генов.
Экспозиция нитроцеллюлозной мембраны с рентгеновской пленкой и анализ результатов
Предварительно охлаждали ступку с пестиком жидким азотом. В последней порции жидкого азота замораживали растительную пробу (1-2 г растительной ткани) и растирали ее до пудрообразпого состояния. Переносили пробу в 2 пробирки типа Эпендорф, содержащих по 700 мкл лизирующего буфера (или стеклянную пробирку на 10 мл), тщательно перемешивали. Добавляли смесь фенола/хлороформа 1:1 (равный объем), перемешивали 3 мин, центрифугировали 5 мин на максимальной интенсивности, на микроцентрифуге Mini spin (Eppcndorjf). Переносили водные фазы в новые пробирки, добавляли равный объем хлороформа, перемешивали 3 мин, центрифугировали 5 мин на максимальной интенсивности. Переносили водную фазу в новые пробирки, добавляли 1/10 объема 3 М ацетата натрия и равный объем изопропанола в каждую пробирку, перемешивали. Формирующуюся «медузу» нуклеиновых кислот наконечником микропипетки переносили в новую пробирку. Добавляли к нуклеиновым кислотам 0,5 мл 75% этанола, центрифугировали 3 мин па максимальной интенсивности, отбирали спирт, высушивали осадок, растворяли его в воде - 300-500 мкл. Для наилучшего растворения осадок нуклеиновых кислот после высушивания необходимо растирать стеклянной палочкой, добавляя по 10-20 мкл воды несколько раз, после чего добавить воду до конечного объема. Если после добавления изопропанола и ацетата натрия нуклеиновые кислоты не образуют видимой «медузы», то пробирку необходимо инкубировать при -20С 1 час (или ночь). После растворения в воде добавляли фермент РНКазу 1 (10мг/мл) из расчета 4 мкл на 100 мкл водного раствора нуклеиновых кислот, инкубировали при 37С 30-60 мин. Добавляли равный объем фенол/хлороформа и производили депротеинезацию как описано выше. После обработки хлороформом водную фазу переносили в новую пробирку типа Эпендорф, добавляли 1/10 объема З М ацетата натрия и равный объем изопропанола, инкубировали в холодильной камере на -20С 1 час (или ночь). Центрифугировали 10 мин на максимальной интенсивности микроцентрифуги, отбирали изопропанол. Промывали осадок 75% этанолом, центрифугировали 3 мин при максимальной интенсивности. Отбирали спирт, подсушивали осадок, растворяли его в воде.
Перед выделением хлоропластной ДНК (хлДНК) выделяли хлоропласты как описано выше (пункт 3.2). После второй промывки буфером А осадок лизировали в лизирующем буфере, аналогичном используемому для выделения тотальной растительной ДНК. Далее проводили операции аналогичные операциям, проводимым при выделении тотальной растительной ДНК (см пункт 3.4.1). Однако, хлДНК, выделенная этим методом была частично разрушена и при рестрикции не давала набора полос (пункт 3.6, рис. 6). Качество такой ДНК была неудовлетворительным.
Использование в данном методе раствора высокой ионной силы предотвращает, по мнению авторов данного метода, налипание ядерной ДНК на оболочку хлоропластов (Bookjanns G,, 1984). Метод требует большого количества растительного материала, выход ДНК меньше, по сравнению с методом выделения хлДНК из выделенных хлоропластов, однако ДНК получается более высокого качества, что видно при ее рестрикции (см. пункт 3.6, рис. 6),
Срезанные листья, раскладывали по 15 г порциям, гомогенизировали каждую порцию в 60 мл буфера для гомогенизации (количество растительного материала - 500 г). Гомогенат фильтровали через 1 слой марли и 2 слоя мераклоса. Далее фильтрат разливали по 100 мл стаканам и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин на центрифуге К-23 (все следующие центрифугирования при выделении хлДНК проводили на этой же центрифуге). Супернатант отбрасывали. Осадок в каждом стакане ресуспендировали в 80 мл буфера 1, центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, супернатант отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 20 мл лизирующего буфера (25 мМ Трис НСІ, рН=8Д 10 мМ ЭДТА, рН=7,5). Добавляли ДДС и лаурилсаркозинат до конечной концентрации 0,5% и 2% соответственно. Суспензию инкубировали при комнатной температуре 20 мин. Проводили 2 депротеинизации фенол/хлороформом и 1 хлороформом, аналогично депротеинезациям, проводимым в методике выделения тотальной растительной ДНК (см пункт 3.4.1). После обработки хлороформом к отобранной водной фазе добавляли 2,5 объема 96% этанола и 1/10 объема 3 М ацетата натрия, рН=6,0. Инкубировали ночь при -20 С. После инкубации центрифугировали 15 мин при 4000 об/мин, отбрасывали спирт, промывали осадок 3 мл 75% этанола, центрифугировали 3 мин при 4000 об/мин. Отбрасывали спирт, высушивали осадок, растворяли в 50 мкл дистилированной воды.
Микровыделение плазмндной ДНК используется для скрининга бактериальных колоний на наличие рекомбипаитных плазмид или во всех других случаях, когда не требуется препаративных количеств ДНК (например метод полимеразпой цепной реакции). Плазмиднуго ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Bimboim, Doly, 1979). Часть колонии бактерий переносили с чашки Петри в пробирку с 4 мл жидкой LB среды, добавляли соответствующий антибиотик и инкубировали ночь при +37С при постоянном встряхивании (ночная культура). Переносить бактерии с чашки Петри в жидкую среду можно либо с помощью деревянных зубочисток, либо наконечниками микропипетки, сбрасывая наконечник в пробирку. Переносили 1,5 мл ночной культуры бактерий в пробирку типа Эпепдорф, центрифугировали при максимальной интенсивности 3 мин (это и последующие центрифугирования производили на настольной микро центрифуге Mini spin plus (Eppendorf)). Для большего выхода ДНК можно после центрифугирования добавить еще 1-1,5 ночной культуры в пробирку и центрифугировать вновь. Перенос бактерий с чашки Петри в пробирки, а так же перенос ночной культуры в пробирки типа Эпепдорф необходимо производить в стерильных условиях.
Отбрасывали супернатант, ресуспендировали осадок в 200 мкл раствора 1, инкубировали при комнатной температуре 3 мин. Добавляли 200 мкл раствора 2, осторожно перемешивали пробирку, инкубировали при комнатной температуре 5 мин. Добавляли 200 мкл раствора 3, осторожно перемешивали, инкубировали 15 мин во льду. После добавления раствора 3 выпадали хлопья белого цвета, которые представляют собой комплексы белков и бактериальной высокомолекулярной ДНК. Если бактериальная ДНК будет разрушена (при интенсивном встряхивании), то небольшие ее фрагменты перейдут в раствор, и в дальнейшем будут загрязнять препарат плазмидной ДНК.
После инкубации во льду центрифугировали 5 мин при максимальной интенсивности. Отбирали суперпатант, добавляли 450 мкл изопропанола, инкубировали 30-60 мин при комнатной температуре. Отбрасывали супернатант, добавляли к осадку 100 мкл 75% этанола, центрифугировали 3 мин при максимальной интенсивности. Отбрасывали спирт, высушивали осадок, растворяли в 25 мкл воды.
Влияние цитокинина на транскрипцию хлоропластных генов в листьях первого яруса 9-дпевных проростков ячменя, прединкубированных 24 часа на воде
Как видно из таблицы 2, нами выбраны представители всех фунционально-различных групп генов пластома. Во-первых, это гены, продукты которых необходимы для фотосинтеза, а именно: для ФСІ - psaA ген, ФСП - psb гены, АТФ синтетазного комплекса - atp гены, цитохром Ьб/f комплекса - pet гены, НАДФН дегидрогсназпого комплекса - ndh гены. Во-вторых, это гены "домашнего хозяйства": так, например, гроВ ген, который кодирует р субьединицу РНК- полимеразы бактериального типа, rps и грі гены, кодирующие белки малой и большой субъединиц рибосом, а также гены рибосомной РНК (нами взят ген гт16) и несколько генов транспортных РНК.
Для ячменя не известна полная нуклеотидная последовательность пластома, а, следовательно, и полная оперонная структура. Имеются лишь сведения об организации небольшого числа оперонов. Однако известно, что пластом более консервативен, чем ядерный геном и по нуклеотидной последовательности генов (особенно белок-кодирующих последовательностей) и по своей архитектуре. Поэтому, анализируя принадлежность генов к оперонам, мы опирались на данные по пластому риса, который секвенирован и для которого организация оперонов известна полностью (Kanno, Hirai, 1993). На рисунке 7 представлена генетическая карта пластома риса, на которой черными стрелками обозначены опероиы и моноцистроны, а тонкими серыми стрелками выбранные нами гены. Как видно из рисунка нами были выбраны гены, представляющие крупные опероны и ряд генов [ndhF, rbcL, psbA), организованных моноцистронно. Для psbB-psbH-petB-petD оперона были взяты все гены. Транскрипция выбранных генов осуществляется различными РНК-полимеразами. Так, например, известно, что ген гро В транскрибируется только РНК-полимеразой фагового типа. Эта РНК-полимераза участвует также в транскрипции clpP и гр123 генов (показано для ячменя), и ггпіб, ШрВ и atpl (показано для табака) (Hess, Berner, 1999). Многие гены, кодирующие белки, необходимые для фотосинтеза, транскрибируются РНК-полимеразой бактериального типа, которая кодируется хлоропластной ДНК. Так, например, показано, что с rbcL-генз. и оперопа psaA-psaB считывание мРНК осуществляется только РНК-полимеразой бактериального типа. РНК-полимераза хлоропластного кодирования участвует также в транскрипции psbD-psbC, ШрВ, ггпіб генов. Таким образом, выбраны гены, транскрипция которых осуществляется только РНК-полимеразой бактериального типа, только РНК-полимеразой фагового типа, а так же гены, транскрибируемые обеими РНК-пол имеразами.
Фрагменты 10 хлоропластных генов были любезно предоставлены профессором Р.Г. Херрмашюм (Ботанический институт Мюнхенского университета, Германия). Они переклонированы в плазмидный вектор pUC57. Для остальных генов, руководствуясь данными о нуклеотидный последовательностях хлоропластной ДНК ячменя и риса, были подобраны специфические праймеры и полученные продукты ПЦР проклонировапы в pUC57A/T вектор (Fermentas).
С помощью программы Primer 2 последовательность каждого амплифицируемого фрагмента проверяли на наличие в нем сайтов рестрикции. После проведения полимеразпой цепной реакции фрагменты ДНК рестриктировали подобранными рестриктазами, что служило окончательным доказательством корректности амплификации. Информация о нуклеотидной последовательности праймеров, сайтах рестрикции ампликонов и размерах получаемых после рестрикции фрагментов приведена в таблице 3.
В дальнейшем с помощью ПЦР было получено необходимое для работы количество ДНК. По 1 мкг ДНК каждого из 26 фрагментов было нанесено на мембрану Ну bond ("Amersham", Англия) в каждую точку с помощью прибора для дот-гибридизации ("Bio-Rad", США) в соответствии со схемой на рисунке 8. Для каждого гена на мембрану наносили ДНК в 4 точки. После нанесения ДНК мембрану разрезали на полосы, соответствующие вертикальным рядам точек и получали два комплекта полосок, несущих одинаковые фрагменты ДНК. Такие мембраны использовали в дальнейшем для ДНК/РНК гибридизации с меченными молекулами РНК получаемыми в run on экспериментах. При этом один комплект мембран использовался для гибридизации с опытным вариантом, второй - с контрольным. Кроме фрагментов хлороплатных генов па мембрану наносили так же ДНК плазмиды pUC57. Она являлась контролем на неспецифическое связывание меченых молекул РНК со случайными последовательностями ДПК.
Исследования последних 10-15 лет показали поразительную сложность транскрипционного аппарата хлоропластов, намного более сложного, чем было принято считать до этого. На данный момент показано, что транскрипция в пластидах ведется как минимум двумя РНК-полимеразами, которые относятся к разным классам: полимераза бактериального типа (PEP) и полимераза фагового типа (NEP). При этом нет значительного разделения на гены, транскрибируемые только первым или только вторым ферментом. Показано, что практически все гены пластома условно делятся на две группы транскрибируемых либо только РНК-полимсразой бактериального типа и транскрибируемых обоими РНК-полимеразами. У однодольных растений только один оперон (гроВ-С1-С2) транскрибируется исключительно полимеразой фагового типа. В соответствии с этими данными, а так же с данными, показывающими транскрипционную активность той или иной РНК-полимеразы, была высказана гипотеза, согласно которой разделение «работы» ферментов происходит во времени, а не по группам генов. Согласно этой гипотезе на ранних этапах биогенеза в пластиды поступает из .цитозоля РНК-полимераза фагового типа, кодируемая ядром, которая начинает транскрипцию преимущественно генов «домашнего хозяйства», в том числе и генов, кодирующих субъединицы РНК-полимеразы бактериального типа. По мере развития органелл PEP начинает все более активно транскрибировать гены, кодирующие фотосинтетические белки, а так же гены «домашнего хозяйства». В тоже время вклад NEP в тотальную транскрипцию уменьшается и, вероятно, в зрелых органеллах сводится только к транскрипции гро В оперона. Таким образом, функция NEP заключается в обеспечении транскрипции на ранних этапах развития органелл, в то время как PEP - в транскрипции хлоропластных генов в зрелых органеллах.
Исходя из этих данных, нами была выбрана следующая постановка опыта - листья первого яруса 4-дневных проростков ячменя срезали, раскладывали в кюветы на раствор гормона (БАП, концентрация 2,2х10"5М) и воду на 3 часа. После инкубации их незамедлительно переносили в ледяную воду и затем из листьев выделяли хлоропласты при +4"С. После выравнивания количества хлоропластов для обоих вариантов, проводили run on транскрипцию.
