Введение к работе
Аїсгуальность работы. Исследование молекулярных основ патогенности микрооргшшзмов является одной из фундаментальных задач микробиологии и медицины. Среди многообразия веществ, вырабатываемых бактериями для обеспечения проникновения в макроорганизм, преодоления его защитных систем и развития инфекционного процесса, особое место занимают токспны, которые для многих бактерий являются оиювными факторами патогенности. Известно, что патогенные свойства того или иного микроорганизма в значительной мере определяются как спектром его структурных генов, кодирующих факторы патогенности, так и механизмами, обеспечивающими регуляцию экспрессии этих генов. Выяснение механизмов регуляции сопряжено с изучепием белок-белкового и ДНК-белкового взаимодействий и представляется одним из наиболее актуальных направлений в исследовании молекулярных основ патогенности и вирулентности микроорганизмов.
Для проведения исследований в данном направлении интересными объектами являются представители бацилл цереусной группы. Бактерии этой группы широко распространены в природе и имеют ярко выраженное филогенетическое родство, морфологическое и физиолого-биохимическое сходство на фоне широкого диапазона их патогенных свойств. B.cereus, занимая по патогенному статусу промежуточное положение среди представителей данной группы бацилл и продуцируя широкий спектр гемолизинов, может служить удобной моделью для изучения этих токсинов.
Еще одной причиной, которая побуждает к активному изучению регуляции экспрессии токсинов, вырабатываемых В. cereus и его ближайшими родственниками В. thuringiensis и B.anthracis, является огромная значимость этих микроорганизмов для человека. B.cereus -один из основных бактериальных загрязнителей производимых промьгшленностью продуктов питания, лекарственных и косметических препаратов. В. thuringiensis, широкомасштабно используемый в качестве ігнсектицидньгх препаратов, неконтролируемо выбрасывается в окружающую среду. В. anthracis печально известен как опасный патоген, вызывающий сибирскую язву. Поэтому изучение регуляции отдельных токсинов, продуцируемых данными бактериями, для определения степени их безопасности для животных и человека является актуальной задачей.
Хорошо известно, что В. cereus производит ряд внеклеточных токсинов, обладающих гемолитической активностью и рассматриваемых в качестве потенциальных факторов патогенности (Turnbull, 1986; Drobniewski, 1993). Гемолпзин II принадлежит к семейству р-складчатых пороформирующих токсинов (PFT), имеет высокую степень гомологии (31,2%
идентичности) с а токсином Staphylococcus aureus и вносит значительный вклад в суммарную гемолитическую активность штаммов В. cereus и В. thuringiensis.
Несмотря па то, что гемолитические токсины В. cereus активно изучаются, на сегодняшний день весьма мало известно об их генетической регуляции, также как и о регуляции других факторов вирулентности этого микроорганизма. Подробно описан лишь один плейотропный регулятор, PlcR, который является активатором генов фосфолипаз, негемолитического и гемолитического энтеротоксинов, а также некоторых других генов В. cereus и В. thurlngiensis (Lereclus et al., 1996; Agaisse, 1999, Ivanova et al., 2003). Было показано влияние еще одного гена, JlhA, на продукцию фосфолипаз, гемолизина BL и ряда других внеклеточных факторов вирулентности у штаммов В. cereus и В. thuringiensis (Ghelardi et al., 1999). Но в данном случае это влияние сводится к регуляции экспорта белков из клетки, а не затрагивает их синтез. Сравнительно недавно был описан еще один плейотропный транскрипционный регулятор Fur (ferric uptake repressor), регулирующий как процессы усвоения и накопления железа бактериальной клеткой, так и биосинтез некоторых факторов патогенносги (Harvie et al., 2005). Между тем вопрос о регуляции экспрессии генов токсинов неразрывно связан с вопросом регуляции патогенных свойств и весьма актуален. Такие исследования заслуживают самого серьезного внимания, поскольку их результаты являются необходимым первоначальным этапом, закладывающим основу для дальнейшего выяснения сложных механизмов координированной регуляции генов, обеспечивающих патогенпость микроорганизмов цереусной группы.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось исследование регуляции транскрипции гена гемолизина II В. cereus. Для достижения указанной цели последовательно ставились следующие задачи:
исследовать организацию регуляторной области гена гемолизина И;
исследовать участие белка НІуІШ. в регуляции экспрессии гена hlyll;
изучить особенности узнавания и взаимодействия HlyllR с операторами гена hlyll;
исследовать участие глобального регулятора Fur в транскрипции гена hlyll.
Данная работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина РАН.
Научная новизна работы. Впервые получены данные о регуляции экспрессии потенциального фактора патогенносги В. cereus - гемолизина II. Показано, что в промоторно-операторнон областп гена hlyll расположено два операторных участка - сайты связывания двух регуляторных белков HlyllR и Fur.
Продемонстрировано, что белок HlyllR негативно регулирует транскрипцию гена гемолизина II B.cereus, препятствуя образованию открытого промоторного комплекса. Установлено, что в промоторно-операторной области гена hfyll расположено три потенциальных перекрывающихся сайта связывания HlyllR, с которыми одновременно взаимодействует только два димера регуляторного белка. Показано, что в отличие от ряда ДНК-связывшощих белков HlyllR не способен вносить значительных конформационных изменений в ДНК сайта мишени. Показано негативное влияние на транскршщию гена гемолизина II B.cereus глобального транскрипционного регулятора Fur.
Практическое значение работы. Исследование регуляции экспрессии бактериальпых токсинов не только представляет несомненный научный интерес, но и важно в практическом плане, как создание основы для осуществления направленного контроля процесса патогенеза. Знания о регуляции экспрессии генов, кодирующих токсины, может быть использовано при создании приншшиально новых терапевтических и профилактических подходов, а также новых лекарственных препаратов, что позволит отказаться от традиционной терапии антибиотиками. Полученные данные по исследованию молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов гемолизинов В. cereus могут использоваться в дальнейших исследованиях по разработке методов направленной регуляции патогенеза у В. antkracis, как наиболее близкого микроорганизма к В. cereus. Кроме того, данные исследования важны ц для сельского хозяйства, в котором применяется ряд микроорганизмов, содержащих потенциальные факторы патогенности (В. Ihuringiensis').
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано две статьи. Результаты работы представлены па третьем международном семинаре "The Molecular Biology of Bacillus cereus, B.anthracis and B.thuringiensis" (Nice, France, 2003), на международных конференциях: "lUBMB/SASBMB Special Meeting on The Biochemical & Molecular Basis of Disease" (Cape Town, SAR, 2001), Gordon Research Conference (Andover, USA, 2004), на 6-ой (2002) и 10-ой (2006) Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых. Структура п объем диссертации. Диссертационная работа изложена на Ґ/Ґ страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает^Л/ источников. Работа содержит J?9 рисунков.
