Содержание к диссертации
Введение
1. Организация рибосомных оперонов и общие принципы их регуляции 8
1.1. "Строгий" контроль транскрипции рибосовшых оперонов 12
1.2. relA система синтеза (P)PPGPP 12
2. ppGpp как регулятор транскрипции генов рРНК и р-белков 20
3. Посттранскрипционная регуляция биосинтеза р-бел ков 26
3.1. Влияние дозы генов р-белков на их биосин тез 26
3.2. Авторегуляция биосинтеза р-белков 27
3.3. Некоординированная экспрессия генов в опе рена 32
3.4. Механизм автогенной регуляции биосинтеза р-белков 37
3.5. Значение автогенной регуляции биосинтеза р-белков 41
4. Влияние дозы гена relA на содержание (p)ppGpp в голодащих клетках E.coli 53
5. Функция гена relA в растущих клетках E.coli 61
5.1. Участие relA системы в поддержании "базального" уровня ppGpp в растущих клетках E.coli 61
5.2. Зависимость скорости роста культуры клето к бак териального штамма от внутриклеточного уровня ppGpp 63
6. Клонирование, локализация и ориентация гена reiA на хромосоме Е.СОІІ 65
7. Роль ppGpp в регуляции транскрипции гена reiA 78
7.1. "Строгий" контроль транскрипции гена reiA в клетках Е.СОІІ в условиях деацилирования тРНК 78
7.2. Регуляция транскрипции гена reiA в растущих клет ках Е.СОІІ 81
Обсуждение 86
- relA система синтеза (P)PPGPP
- Авторегуляция биосинтеза р-белков
- Участие relA системы в поддержании "базального" уровня ppGpp в растущих клетках E.coli
- Регуляция транскрипции гена reiA в растущих клет ках Е.СОІІ
Введение к работе
Актуальность темы. Метаболизм бактериальной клетки осуществляется как совокупность коордшшрованно протекающих энзиматичес» ких реакций и молекулярных процессов. По мере расширения и детализации представлений об отдельных сторонах клеточного метаболизма всё большее значение приобретает изучение тех регуляторних механизмов, которые обеспечивают высокую степень интеграции метаболических процессов. Одним из перспективных подходов следует считать выявление и изучение тех низкомолекулярных метаболитов, которые выполняют роль сигнальных молекул, влияющих на разнообразные клеточные процессы. Одной из таких сигнальных молекул является гуанозин-5 -дифосфат, 3 -дифосфат(ррБрр) . Синтез ppGpp в клетках бактерий представляет собой ответную реакцию на снижение аминоацилирования тРНК. Накопление ppGpp вызывает быструю перестройку клеточного метаболизма, в частности, подавление биосинтеза рибосом, усиление протеолиза, ингибирование дыхания ( Cashal a. Gallant, 1969; Dennis, 1977; Susman a. Gilvarg, 1969).
Известно, что сигналом к синтезу ppGpp служит попадание в А-участок рибосомы деацилированной тРНК, что осуществляется благодаря присутствию в рибосоме белкового продукта гена relA, так называемого фактора "строгого" контроля метаболизма ( strфактор) (На-seltine et al., I972;Howart et al., 1976). Белок, кодируемый геном relA , представляет собой фермент ATPtGTP пирофосфорилтранефе-
разу, образующую из атр и gtp предшественник ppGpp гуанозин-51-
т трифосфат, 3 -дифосфат (pppGpp), который быстро превращается в
ppGpp.
Основные представления о синтезе и роли ppGpp в клетках бактерий получены при анализе их экстремального состояния - острого дефицита необходимых аминокислот или инактивации аминоацил-тРНК синтетаз. Актуальной проблемой в настоящее время является анализ
- О -
синтеза и роли ppGpp при сбалансированном росте клеток, идентификация PpGpp как внутриклеточного регулятора многих метаболических процессов в растущих клетках позволит существенно расширить возможности управления разнообразными процессами микробиологического синтеза.
Дель работы. В условиях дефицита аминокислот синтез (p)ppGpp осуществляется рибосомным аппаратом бактерий, как побочная реакция процесса трансляции. Показано, что скорость синтеза (p)ppGpp возрастает пропорционально увеличению степени деацилирования тРНК. (Reeh et al., 1976). Вместе с тем можно ожидать, что способность популяции рибосом регистрировать степень аминоапилирования тРНК зависит также и от содержания в клетках продукта гена relA, str фактора. Нашей целью было выяснить, обладают ли клетки E.ooii способностью регулировать экспрессию гена relA, кодирующего структуру str фактора. Мы предположили, что транскрипция гена relA подвержена негативному контролю со стороны ppGpp, то есть регулируется подобно транскрипции многих генов, кодирующих структуру ри-босомного аппарата.
Основные задачи. Скорость синтеза геїА-мРНК измеряли методом РНК-ДНК гибридизации, для чего необходимо было клонировать ген relA в составе ограниченного фрагмента хромосомы е.соіі на векторе плазмидной ДНК. Для решения этой задачи была построена рестрик-пионная карта relA-pyrG области хромосомы E.coli, и определено положение промоторного участка и направление транскрипции гена г el А.
Следующая задача состояла в непосредственном измерении скорости синтеза relA-мИЖ путём измерения содержания фракции импуль-сно меченой РНК, комплементарной клонированному relA участку. Скорость синтеза геїА-мРНК была измерена в штаммах E.coli с различным состоянием гена relA в условиях дефицита аминоацил-тРНК. До-
— О —
полнителъно была поставлена задача выяснить, как изменяется пул UTP в голодавдих клетках ге1А+ и relA." штаммов.
Для выяснения вопроса о роли ppGpp в экспрессии гена relA, этот ген был клонирован в составе плазмид, различащихся числом копий в клетках E.coli. Была измерена эффективность транскрипции генов relA в таких штаммах.
Отдельная задача состояла в изучении роли генагеїА в растущих клетках E.coli. Необходимо было выяснить, зависит ли транскрипция гена relA от скорости роста культуры, как это наблвдается для рибосомных оперонов. Кроме того, был поставлен вопрос о ppGpp , как внутриклеточном факторе, ограничивающем скорость роста культуры. Эту задачу мы решали с использованием штаммов, имеющих различную дозу гена relA.
Новизна результатов. Уточнена рестрикционная карта relA-pyrG области хромосомы E.coli, определены положение промотора гена relA и направление его транскрипции. ГенгеїА клонирован в составе фрагмента хромосомы с молекулярной массой 3,2 Ш, что позволяет использовать его для измерения скорости синтеза relA-мРНК методом РНК-ДНК гибридизации.
Впервые показано, что транскрипция генагеїА координирована с транскрипцией рибосомных оперонов. Установлено, что при дефиците аминоапил-тРНК синтез relA-мРНК подавляется в клетках ге1А+ штамма и продолжается в клетках relA"* мутанта. В растущих клетках E.coli транскрипция гена relA понижается с уменьшением скорости роста культуры.
При увеличении дозы генагеїА возрастает чувствительность рибосомного аппарата к деапилированию тРНК, что выражается в увеличении скорости синтеза и содержания ppGpp в клетках E.coli. Возросший уровень ppGpp ограничивает транскрипцию гена relA. Таким образом, установлено, что транскрипция генагеїА негативно
контролируется его метаболическим продуктом - ppGpp.
Использование плазмид, содержащих ген relA, позволило показать, что ppGpp является тем внутриклеточным компонентом, который ограничивает скорость роста культуры на средах различного состава. Сделан вывод, что при изменении источников питания в клетках изменяется степень аминоацилирования тРНК, которая регистрируется популяцией рибосом, образупцей ppGpp.
Научно-практическое значение работы. Способность бактериальных клеток регулировать уровень ppGpp составляет основу их адаптации к разнообразным источникам питания. Роль ppGpp особенно велика при несбалансированном росте, сопровождающемся дерепрессиеи аминокислотных оперонов. В этих условиях от уровня ppGpp зависит протекание таких жизненно важных процессов, как точность трансляции мРНК, интенсивность транскрипции рибосомных и аминокислотных оперонов, трансмембранный потенциал, уровень дыхания и т.д. Научно-практическое значение данный работы состоит в возможности регуляции уровня ppGpp в растущих клетках нетрадиционным путём увеличения дозы гена relA. Значение работы заключается и в том, что ppGpp идентифицирован, как внутриклеточный метаболит, уровень которого является важным фактором регуляции скорости роста культуры клеток бактериальных штаммов. Благодаря этому открываются дополнительные возможности управления процессами микробиологического синтеза, протекающими при ограничении скорости роста микроорганизмов.
- a -
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ РИБОСОМНЫХ ОПЕРОНОВ В КЛЕТКАХ E.coli
relA система синтеза (P)PPGPP
Ещё в 1952 году Сандз и Роберте (Sands a. Roberts, 1952) сообщили о зависимости синтеза нуклеиновых кислот от биосинтеза белка. Они показали, что после истощения в среде необходимых аминокислот в бактериальной клетке прекращается не только синтез белка, но и резко сокращается синтез РНК. Спустя три года было обнаружено первое исключение из данного правила. В штамме E.coli к 12 W6, ауксотрофе по метионину, синтез РНК продолжается и после истощения в среде метионина Свогек et al., 1955). Стент и Бреннер (stent a, Brenner, 1961) охарактеризовали данный штамм, как имеющий "ослабленный" контроль синтеза РЖ, в противоположность "строгому" контролю, характерному для штаммов дикого типа, или было также показано, что тип контроля синтеза РНК определяется одиночным генетическим локусом, который был назван локусом контроля синтеза РНК, или nRC" локусом. Мутация в штамме W6, приведшая к "ослабленному" (relaxed) контролю синтеза РЖ, была сначала обо- re! значена как RC , а затем rell , в соответствие с правилами обо- значения генотипа, предложенными Демерек и соав. (Demerec et al., 1966). Методом бактериальной конъюгации было определено положение rel локуса между strA и glyA на хромосоме E.coli (AlfOldi et al., 1966). При более точном Р1 транедукционном картировании rel ген был локализован между argA и cysA. Первые опыты по сравнению свойств rel" и ге1+ штаммов проводили на неизогенных парах. Впоследствие были разработаны методики получения изогенных, за исключением rel гена, пар штаммов E.coli (Fill, 1968; И.І1 a. Priesen, 1968). Фил и Фризен (Piil a. Priesen, 1968) описали более 20 неза висимо полученных Rel мутантов. Трансдукционный анализ показал, что во всех случаях мутации, приведшие к "ослабленному" контро лю синтеза РНК, обнаруживали ту же сцепленность с argA, что и rel ген штамма w6. Р» фактор, содержащий rel аллель штамма wб, не приводил к комплементации данных мутаций при введении его в полу ченные Rel мутанты, что свидетельствовало о наличие мутаций в г 1 гене. По способности аккумулировать РНК в условиях аминокислотно го голодания полученные Rel мутанты можно было разделить на две большие группы: мутанты, подобные классическому штамму W6 и мутан ты, у которых аккумуляция РНК в условиях аминокислотного голода ния составляла около 20$ от уровня аккумуляции РНК в штамме W6. Трансдуктанты сохраняли Rel фенотип, характерный для родительско го штамма, что указывало на зависимость его от характера мутации в rel гене. , В опытах с использованием rel"/rel+P и rel+/P :rel" мерози-гот СРІІІ, 1969) было показано, что rel+ аллель доминантен по отношению к rel"" аллелю. В 1969 году было сделано важное для всего последующего развития учения о "строгом" контроле наблюдение.
Исследуя кислоторас-творимую фракцию клеток E.coli методом восходящей хроматографии на полиэтилениминцеллюлозных пластинках, Кейшел (Cashel, 1969) обнаружил, что в штаммах E.coli со "строгим" контролем биосинтеза РНК в условиях аминокислотного голодания накапливаются два необычных компонента, MSi Msn, которые метятся 32Р-ортофосфатом. Мутанты, содержащие xei аллель, то есть характеризующиеся "ослабленным" контролем биосинтеза РНК, не аккумулируют данные нуклео-тиды в аналогичных условиях. "Магические" пятна, или MSI и MSH, как они первоначально были названы, позднее были идентифицированы как гуанозинтетрафосфат и гуанозинпентафосфат, соответственно» На основании корреляции синтеза данных необычных гуаниловых нуклеотидов и изменения уровня аккумуляции РНК было высказано предположение, что данные компоненты, продукция которых была связана с энзиматической активностью продукта генагеї ( Cashel a.Kalbacher , 1969), играют важную роль в "строгом" контроле синтеза РНК. Вскоре рядом авторов были получены данные, свидетельствующие о том, что один из двух необычных гуаниловых нуклеотидов, а именно, MS I, или гуанозинтетрафосфат, является ингибитором синтеза стабильной РНК (Cashel a. Gallant , 1969; Cashel a.Kalbacher , 1970; Travers et al., 1970; Boer et al., 1971). На участие рибосом в синтезе MS I иШД указывает тот факт, что антибиотики хлорамфеникол, спарсомицин, пуромицин, тетрациклин и некоторые другие ингибиторы трансляции, блокирующие работу рибосом, понижают синтез MS I и MS П (Cashel , 1969; Boer et al., 1971; Lund a« Kjeldgaard , 1972). На основании этих наблюдений было высказано предположение, что (p)ppGpp являются продуктами рибосом, работающих "вхолостую" при дефиците аминоацил-тРНК ashei а. Gallant, 1969). С учётом результатов генетического исследования rel локуса (I3.il a.Priesen , 1968; Fiil, 1969) было сделано заключение, что различная способностьГЄІА+ игеІА " -штаммов образовывать (p)ppGpp обусловлена особенностями их рибосом, контролируемыми продуктом гена relA. В 1972 году было обнаружено, что (p)ppGpp могут быть синтезированы in vitro на рибосомах в присутствии АЇР И GIP (ИЛИ GDP ) (Haseltine et al., 1972). Синтез (p)ppGpp был обусловлен белковым фактором, отмываемым от рибосом ге1А+ штаммов 0,5 МШ СІ, который и был назван авторами фактором "строгого" контроля. Рибосомы из ге1А штаммов не способны синтезировать (p)ppGpp in vitro. Однако, при добавлении к ним фракции, отделяемой от рибосом ге1А+ штаммов при их промывке 0,5 МШдсі, способность продуцировать (p)ppGpp восстанавливается. Когда в системе in vitro присутствует GTP, синтезируется pppGpp, когда GDP, синтезируется ppGpp. ATP является обязательным компонентом реакции и служит донором пирофосфо-рильных групп. Блок и Хазелтайн (Block а«Назвіtine , 1973) показали, что str фактор, экстрагированный из нескольких независимо полученных ге1А штаммов (Piil a.Priesen , 1968), проявлял различную термолабильность, которая варьировала от штамма к штамму, более того, степень термолабильности str фактора не коррелировала с его относительной активностью. Всё это свидетельствовало о том, что str фактор является продуктом гена rel, а его изменённые свойства обусловлены различными missense мутациями в гене relA. Окончательные доказательства того, что str фактор является продуктом гена relA (RC, или rel локуса), были получены в результате клонирования гена relA (Priesen et al ., 1976). При исследовании белковых продуктов, синтезированных в клетках штамма E.coli, облучённых УФ светом, а затем инфицированных фагом /((dpyrG-relA), методом полиакриламидного гель-электрофореза обнаруживается полоса, соответствующая очищенному str фактору. При использовании для этих целей электрофореза с последующей радиоавтографией определяется пятно, соответствующее очищенному str фактору.
При индукции одиночного лизогена штамма E.coli, со- держащего профаг Я (dpyrG-reiA), в клетках резко возрастало количество фактора "строгого" контроля (до 20 раз). В соответствии с этими данными находится работа Атерли (Atherly, 1979), который сообщил о получении мутанта с обширной делецией, равной I минуте хромосомной карты E.coli (Bachmann et al., 1980), включающей ген relA. Данный штамм, как и ожидалось, не способен был аккумулировать (P)PPGPP в условиях аминокислотного голодания. Аналогичные данные были получены при использовании штаммов, несущих nonsense и insertion мутации в генегеїА (ітіеаеп et al ., 1978). После того, как были разработаны методы получения высокоочи-nieHHOrostr фактора (Cochran a. Byrne, 1974; Block a. Haseltine , 1975; Pedersen a. Kjeldgaard , 1977), появилась возможность подробнее изучить свойства этого белка. Фактор "строгого" контроля представляет собой мономерный белок с молекулярной массой 77000. Удельная активность str фактора в полной системе возрастает при увеличении рН с 6,5 до 9,0, при дальнейшем увеличении рН удельная активность str фактора резко падает, (Cochran a. Byrne, 1974). Это может отражать зависимость ассоциации str фактора с рибосомой. Концентрация ионов Mg2+, необходимая для максимальной активности str фактора в полной системе, составляет 12-15 мМ (Cochran a. Byrne, 1974). Для str фактора характерна высокая субстратная специфичность, даже близкие аналоги GTP - GDPCP ИІТР проявляют сниженную акцепторную активность (Cochran a. Byrne, 1974). Сай (Sy, 1975) показал, чторй и PPPPG могут выступать в качестве акцепторов пиро-фосфорильной группы в реакции, катализируемой str фактором, с образованием pGpp и ppppGpp. Однако, акцепторная активность данных нуклеотидов в 10 раз ниже, чем у (p)ppG. Не менее специфичен str фактор и по отношению к донору пиро-фосфорильных групп. Максимальная донорная активность характерна для АТР, тогда как донорная активность dATP составляет около 30$. Донорная активность других нуклеотидов ещё ниже (Cochran a. Byrne, 1974).
Авторегуляция биосинтеза р-белков
В работах по изучению автогенной регуляции синтеза рибосом-ных белков были использованы два основных подхода. В основе первого подхода было конструирование гибридного оперона, состоящего из промотор-операторного участка lac оперона и сшитого с ним одного или нескольких генов р-белков. Подобные гибридные опероны в составе плазмиды вводились в бактериальные клетки. Цри добавлении в среду индуктора lac оперона в клетках отмечался синтез р-белков, гены которых входили в состав гибридного оперона. Это позволяло оценить влияние определённого р-белка на синтез других р-белков (Lindahl a Zengel , 1979). В основе второго подхода была оценка влияния очищенных р-белков на экспрессию рибосомных генов in vitro. Для этого в систему ДНК-зависимого синтеза белка, где матрицей служила ДНК трансдуцирущего фага, содержащая гены р-белков, добавляли один или несколько очищенных р-белков (Pukuda etai., 1978; Yates et al ., 1980; Brot et at , 1980). Самым большим из всех оперонов рибосомных белков является SI0 оперон. В его состав входит II р-белков. Используя гибридную плазмиду, содержащую данный оперон, транскрипция которого инициировалась с lac промотора, авторы показали, что избыточный синтез р-белков Ь4, Ь23 и L2 приводит к сильному ингибированию синтеза других белков данного оперона (bindahi a. Zengei, 1979),без какого-либо влияния на синтез р-белков других оперонов. Эти результанты свидетельствовали о наличии автогенной регуляции синтеза р-белков SI0 оперона. В аналогичных экспериментах было изучено влияние избыточного синтеза девяти р-белков s10 оперона. Оказалось, что перепродукция только одного р-белка L4 приводит к репрессии всего оперона. Избыточный синтез других белков, кодируемых генами данного оперона, не влиял на экспрессию генов SI0 оперона. Регу-ляторное влияние р-белка Ь4 на экспрессию генов SI0 оперона было также продемонстрировано in vitro (Yates a. Nomura, 1980). Добавление очищенного белка Ь4 в систему in vitro приводит к ингибированию экспрессии генов SI0 оперона. Правда, in vivo белок L4 ингибирует синтез всех белков SI0 оперона, в то время как in vitro - только первых 3-4. Наличие автогенной регуляции экспрессии генов р-белков было также продемонстрировано для Ы1 оперона, кодирующего р-белки U и Ы1. Избыточный синтез белка Ы, ген которого находится под контролем лактозного промотора, приводил к специфическому ингибированию синтеза белка LII (Dean а. Пожога, 1980).
С другой стороны было обнаружено, что добавленный в систему in vitro белок Li приводил к репрессии синтеза как белка ьп, так и своего собственного синтеза (Yates et al., 1980). Таким образом, белок Li является автогенным регулятором оперона ЬП. (j оперон содержит гены 4-х рибосомных белков и cLсубъединицы РНК полимеразы, которые транскрибируются в следующем порядке: SI3, SII, S4, d , ЬІ7. В опытах in vitro было показано, что S4 белок, продукт третьего гена оперона, ингибирует как свой собственный синтез, так и синтез белков SI3 и SII, но не oL субъединицы и белка Ь17 (Yates et al., 1980). Избыточный синтез in vivo белков S4 и SII, но не одного sii, специфически ингибирует синтез р-белков SI3 и, в меньшей степени, ЬІ7 ( Dean а. Ношига, 1980). Хотя синтез d субьединицы не измерялся, вероятно, весь оС оперон находится под автогенной регуляцией белка s 4. Как и в случае оперона sIO, в опытах in vitro удалось показать регуляцию только проксимальных генов (к оперона, в то время как in vivo автогенной регуляции подвержен весь оперон. Необходимо сказать о специфической регуляции синтеза оС субъединицы РНК полимеразы. Ингибирование активности РНК полимеразы рифампшщном приводит к 2-х кратному возрастанию скорости синтеза о(, субъединицы без соответствующего возрастания скорости синтеза рибоеомных белков данного оперона (Peder sen et aL, 1978; Hayward a. Fife , 1978). Следовательно, как и в случае А оперона, регуляция экспрессии о( оперона, вероятно, носит многоступенчатый характер. МЬдифицированный тип автогенной регуляции характерен для эре ошрона, который кодирует 10 рибоеомных белков: Ы4, L 24, L 5, s 14, S 8, L 6, L 18, S 5, L 30 иь 15. Белокs 8 был идентифицирован как автогенный регулятор spc оперона, как in vivo, так и in vitro . In vitro было показано, что белокБ 8 ингибирует синтез белковВ 14 и L 5 (Yates et al., 1980; Dean et al ., I98I).In vivo перепродук-ция белка s8 приводила к ингибированию синтеза белковL 5, sI4,L 6, L 18,S 5,Ь 15.и 130 (Dean et al., 1981). Как и в случае других оперонов, дистальные геныарс оперона подвержены автогенной регуляции in vivo, но не in vitro. Интересно, что ингибирование синтеза рибосомныхбелков spo оперона in vivo, опосредованное автогенной регуляцией, начинается с белкаь 5, ген которого расположен третьим по счёту в эре опероне. Как осуществляется регуляция экспрессии двух первых генов, кодирующих белкиL 14 иL 24, не известно. Аналогичный "модифицированный" тип автогенной регуляции характерен также для str оперона, кодирующего рибосомные белкиБ 12 HS 7, а также факторы трансляции EF-G и EFU. Белок S7 ингибиру-ет in vitro свой собственный синтез, а также, частично, синтез ЕР«Ч5, но не экспрессию первого гена оперона, кодирующего белок SI2 (Пошита et al., 1980). Для данного оперона не было проведено исследований in vivo, поэтому не ясно, подвержен ли синтез фактора трансляции EFu автогенной регуляции или нет. Что касается регуляции экспрессии S 20 оперона, то на этот счёт имеются противоречивые данные. В опытах in vitro было показано, что добавление I6S рРНК в систему, содержащую ДНК гена S20, приводит к специфической стимуляции синтеза белка S20.
Поскольку белок S20 прочно связывается с I6S рРНК, был сделан вывод, что вновь синтезированный белок может осуществлять регуляцию своего собственного синтеза по типу обратной связи (Mfeedoack" regulation), если он не образует комплекса с I6S рРНК (Wirth а. ввек, 1980). Однако, есть экспериментальные данные, противоречащие предположению об автогенной регуляции экспрессии оперонаS20. Во-первых, в меродиплоидных штаммах, содержащих экстра копии гена белка S20, имеет место эффект дозы гена на синтез белка S20 (Geyl a; BSck, 1977). Более того, избирательный синтез белка S20 отмечается в миниклетках, содержащих плазмиду с геном, кодирующим данный белок (Geyl av. B8ck, 1977). В то время как при наличии автогенной регуляции отсутствие I6S рРНК приводило бы к ингибиро-ванию избыточного синтеза белка 8 20. И, наконец, добавление очищенного белка S 20 в систему in vitro приводило лишь к слабому ин-гибированию его синтеза 1е novo (Wirth a. BBck, 1980). Для окон- чательного решения вопроса относительно регуляции оперона s 20 необходимы дополнительные эксперименты. 0 оперон, кодирующий рибосомные белки L10, ь7ДіІ2, а также В ж J, субъединицы РНК полимеразы, подвержен, вероятно, наиболее сложному и интересному виду автогенной регуляции. Фризену и Филу с соавторами удалось сконструировать гибридную высококопийную плазмиду, содержащую весь J оперон ( iEriesen et al, 1980). Производная от неё делеционная плазмида, содержащая только промотор и первый ген, кодирующий белок Ы0, сильно ингибировала рост хозяйских клеток, несмотря на то, что клетки содержали дополнительную плазмиду, в которой кроме промотора и первого гена присутствовали два последующих гена, кодирующих белок L7/k 12 HJ3 субъединицу РЖ полимеразы (Prlesen et al., 1980). Эти результаты согласуются с представлениями о том, что белокL10 является автогенным регулятором J? оперона: избыточный синтез белка Ы0 в клетках, содержащих делеционную плазмиду, приводит к ингибированию экспрессии хромосомного j оперона с последующим истощением пулов свободных рибосомных белков данного оперона. Для подтверждения предположения о роли белка L10 как автогенного регулятора fi оперона Го-ловачук и соавторы ( Holowachuk et al, 1980) использовали лизоген, содержащий профаг с гибридным опероном, состоящим из промотора оперона и сшитого с ним гена -галактозидазы (LacZ ).
Участие relA системы в поддержании "базального" уровня ppGpp в растущих клетках E.coli
В то время как функция гена relA в обеспечении синтеза (p)ppGpp при остром дефиците аминокислот не вызывает сомнений, вопрос о происхождении ppGpp в растущих клетках всё ещё остаётся открытым. Показано, что при сбалансированном росте клетки E.coli содержат 20-100 пМ ppGpp на единицу оптической плотности культуры. При этом оказалось, что relA и relA" клетки содержат практически равные количества ppGpp. Более того, штамм с обширной делеци-ей relA-содержащего участка хромосомы E.coli не теряет способности поддерживать определённый уровень ppGpp в процессе роста и при углеродной недостаточности, хотя и не образует (p)ppGpp при аминокислотном голоде (Atherly, 1979). В настоящее время мы не видим экспериментальных подходов к выяснению механизма relA- независимого синтеза ppGpp в таких мутантах. Однако, нам представляется возможным поставить вопрос о происхождении ppGppB растущих клетках следувдим образом: при наличии у бактерий неповреждённого гена relA принимает ли он участие в поддержании уровня ppGpp? Как нами было показано выше, скорость relA-зависимого синтеза (p)ppGpp на рибосомах зависит от двух основных условий: от де-ацшшрования тРНК и от обогащения рибосомной популяции продуктом гена relA - str фактором. Чтобы выявить возможную роль гена relA в поддержании "базального" уровня ppGpp, мы использовали штаммы E.coli K-I2, содержащие различное количество копий данного гена на геном-эквивалент. Если str фактор не функционирует в условиях сбалансированного роста, то уровни ppGpp в этих условиях в штаммах с одной и несколькими копиями гена relA должны быть одинаковы и равны уровню ppGpp в relA" штамме. Если же str фактор функционирует и в условиях сбалансированного роста, то повышение "чувствительности" рибосомной популяции к уровню аминоащлирования тРНК приведёт к возрастанию скорости синтеза ppGpp в штаммах с ампли-фицированным геном relA. Для проверки данного предположения были измерены уровни ppGpp в клетках штаммов JF627 (relA" ), BS627 (relA+), JP627 pJC60I, JF627 pBS204, растущих на глюкозо-минималь-ной среде, обогащенной всеми аминокислотами. Результаты эксперимента представлены в таблице 3. Как видно из таблицы 3, внутриклеточное содержание ppGpp в растущих клетках повышается с увеличением дозы гена relA. В клетках штамма JP627 (relA" ), растущих на глюкозо-минимальной среде, обогащенной всеми аминокислотами, уровень ppGpp в условиях сбалансированного роста настолько мал, что измерить его практически невозможно.
Необходимо отметить, что в штаммах с несколькими копиями гена relA в отличие от контрольного relA+ штамма в условиях сбалансированного роста можно обнаружить не только ppGpp, но и Х) В штамме JP627 (relA ") мутация в гене relA приводит к инактивации продукта данного гена - str фактора. pppGpp. Повышение уровня ppGppB штаммах с амплифицированным геном relA в условиях сбалансированного роста, как и появление его предшественника - pppGpp , свидетельствует об увеличении скорости relA-зависимого синтеза (p)ppGpp. Хлорамфеникол (100 мкг/мл), добавленный к кяеткам штамма JP 627 pJC 601, растущим на глюкозо-ми-нимальной среде, уже спустя 2-3 минуты снижает внутриклеточный уровень ppGpp с 60 пМ/А д практически до нуля ( 20 ПМ/A Q) , то есть действует, как и в условиях острого аминокислотного голодания. Из этого следует, что relA-зависимый рибосомный синтез (p)ppGpp в растущих клетках отражает определённый уровень деапилированнос-ти тРНК. 2. Зависимость скорости "роста культуры клеток бактериального штамма от внутриклеточного уровня PPGPP В результате амплификации генагеїА и повышения внутриклеточного содержания ppGpp происходит снижение скорости роста плазмидо-содержащего штамма. Это позволяет рассмотреть ppGpp в качестве внутриклеточного регулятора скорости роста культуры клеток Е»СОІІ В таблице 4 и на рисунке 6 показано, как зависит скорость роста культуры клеток E.coll от дозы гена relA, На рисунке 6 представлена графическая зависимость скорости роста культуры клеток (М ) от внутриклеточного содержания ppGpp . Как видно из рисунка 6, при скоростях роста более 0,7 удв./час наблвдается отчётливое понижение уровня ppGpp в растущих клетках. Поскольку увеличение дозы генагеїА приводит к увеличению уровня ppGpp на любой из сред, можно сделать вывод о негативном влиянии ppGpp на скорость роста культуры клетокE.coli . Более того, обнаружив relA- зависимое ограничение скорости роста, мы можем считать, что в клетках, растущих на средах различного состава, устанавливается различное соотношение между аминоавдл-тРНК и свободной тРНК. Таким образом, сбалансированный рост оказывается таковым лишь в отношении избыточных компонентов сред, но ограничен внутриклеточным регулятором -PPGpp . Полученные нами данные о влиянии гена relA на способность клеток E.coli накапливать (p)ppGpp показали важность изучения регуляции синтеза str фактора. Какие-либо сведения по этому вопросу в литературе отсутствуют, более того, не рассмотрены даже возможные пути регуляции экспрессии гена relA. Продукт гена relA, str фактор, не является компонентом, необходимым для процесса трансляции, а сам ген relA не локализуется вблизи каких-либо рибосомных генов.
Поэтому можно было бы ожидать независимой от рибосомных оперонов транскрипции гена relA, в частности, его конститутивной экспрессии. При значительном изменении числа рибосом в растущих клетках конститутивная экспрессия relA гена могла бы привести к вариациям в доле рибосом, содержащих str фактор, что было бы равносильно изменению чувствительности популяции рибосом к деацилированию тРНК. Однако, не менее вероятным может быть предположение о координированной регуляции биосинтеза рибосом и str фактора. В частности, мы предположили, чторрврр, являющийся метаболическим продуктом генагеїА, может быть негативным регулятором транскрипции не только рибосомных оперонов, но и гена relA. Нашей конкретной задачей стало изучение транскрипции гена relA в тех условиях, при которых транскрипция рибосомных оперонов подвергается негативному контролю со стороны ppGpp. С этой целью методом РНК-ДНК гибридизации была измерена скорость синтеза relA-PHK. К началу этой части работы мы располагали клонированным геном relA в составе хромосомного фрагмента с молекулярной массой около 12 Md на плазмиде pJC60I (Collins, 1976). Учитывая, что молекулярная масса гена relA составляет 1,5-1,6 Md, ясно, что дан- ная гибридная плазмида не пригодна для измерения скорости синтеза reiA-PHK. Поэтому перед нами встала задача получить гибридную плазмиду, которая содержала бы только ген relA или ген relA с небольшим прилегающим к нему фрагментом хромосомы Е.соїі. В своей работе мы исходили из известных данных рестрикционного анализа relA области хромосомы E.coli (Friesen et al., 1978). Сначала мы предприняли попытку пёреклонировать ген relA исходя из того, что он тесно сцеплен с геном pyrG, кодирующим цитидинтрифосфат-синтетазу. Ген pyrG можно было бы использовать как селективный маркер, так как для гена relA нет удобной прямой селекции. В соответствии с данными (Frieeen et al., 1978) клонировать фрагмент хромосомы с генами relA и pyrG можно лишь при ограниченном расщеплении исходной плазмиды pJC60I рестрикпионной эндонуклеазой Pstl. Изменяя количество эндонуклеазы в рестрикпионной смеси или время реакции, мы получали продукты неполной рестрикции плазмиды pJC 601. Неполное расщепление плазмиды pJ060I контролировалось электрофорезом фрагментов ДНК в агарозном геле.
Регуляция транскрипции гена reiA в растущих клет ках Е.СОІІ
Обнаружив, что транскрипция гена relA в условиях деацилиро-вания тРНК регулируется аналогично синтезу рРНК, то есть находится под "строгим" контролем, мы продолжили изучение координации синтеза рРНК ИГЄІА-РНК. С этой целью была измерена зависимость скорости синтеза relA-PHK от скорости роста культуры клеток. В данном эксперименте был использован штамм BS628 (ге1А+), который растили на минимальной среде с различными источниками углерода. Источником углерода служили глюкоза 0,4$, глицерин 0,4$, сукцинат 0,4$, пролин 0,4$. Результаты эксперимента представлены в таблице 10. Как видно из таблицы 10, зависимость скорости синтеза relA-РНК от скорости роста культуры клеток штамма E.coli носит характер зависимости второго порядка, иначе говоря, скорость синтеза relA-PHK также как и рРНК (Miura et al., 1981), пропорциональна, при грубой оценке, квадрату скорости роста культуры клеток. Принимая во внимание "строгий" контроль синтеза relA-PHK при дефиците аминоацил-тРШС, а также корреляцию между скоростью роста культуры клеток и синтезом relA-PHK, можно предполагать, что ppGpp выполняет роль негативного регулятора транскрипции гена relA. Сравнивая регуляцию синтеза relA-PHK и рРНК, интересно было оценить влияние хлорамфеникола на уровень транскрипции гена relA. при различных скоростях роста культуры клеток штамма. Хорошо известно, что стимулирующий эффект хлорамфеникола на скорость синтеза рРНК тем значительнее, чем ниже скорость роста культуры клеток штамма (shen a, Brenner, 1977). С этой целью в клетках штамма BS628 (ге1А+), растущих с различной скоростью, был измерен синтез relA-PHK до и после добавления в среду хлорамфеникола (100 мкг/мл). Результаты эксперимента представлены в таблице II. Как видно из таблицы II, при скорости роста, равной 0,78 удв./час (источник углерода - глюкоза), хлорамфеникол приводит к снижению скорости синтеза relA-PHK, практически, вдвое, в то время как при скорости роста, равной 0,57 удв./час (источник углерода - глицерин), скорость синтеза relA-PHK после добавления хлорамфеникола, практически, не изменяется. Мы предполагаем, что на среде с глицерином полярность, связанная с действием хлорамфеникола, компенсируется стимуляцией скорости синтеза relA-PHK, вызванной снижением уровня ppGpp. Для изучения зависимости уровня транскрипции гена relA от внутриклеточной концентрации ppGpp в условиях сбалансированного роста целесообразно использовать штаммы с различной степенью амплификации гена relA, у которых повышена способность образовывать ppGpp (стр. 55).
В клетках штаммов СР79, СР78, СР79 pJC60I::Tn5 и СР79 PBS204, растущих на глюкозо-минимальной среде, обогащенной всеми аминокислотами, были измерены дифференциальные скорости синтеза relA-PHK и pyrG-PHK в пересчёте на одну копию генов relA и pyrG, соответственно. Результаты эксперимента представлены в таблице 12. Как видно из таблицы 12, при увеличении внутриклеточного уровня ppGpp эффективность транскрипции гена relA падает. Так, в штамме CF79 pBS204 скорость синтеза relA-PHK в пересчёте на одну копию гена relA. почти в 9 раз ниже, чем в штамме СР79. В то же время абсолютная скорость синтеза relA-PHK с увеличением числа копий гена relA заметно возрастает. Контролем на специфичность зависимости синтеза rel-PHK от ppGpp может служить измерение скорости синтеза pyrG-PHK. Даже при увеличении внутриклеточного содержания ppGpp до 55 пм/А зд скорость синтеза pyrG-PHK остаётся на том же уровне, что и в штамме CF79, имеющем на данной среде в условиях сбалансированного роста очень низкий уровень ppGpp. Лишь при увеличении внутриклеточного уровня ppGpp более, чем в 4 раза, скорость синтеза relA-PHK заметно снижается, что вероятно, является следствием неспецифического действия високого уровня ppGpp на транскрипционную активность клеток Е.coll. Таким образом, используя штаммы с различной степенью амплификации гена relA, мы показали, что транскрипция генов relA и pyrG имеет различную чувствительность к изменению внутриклеточного уровня PPGPP : незначительное повышение уровня ppGpp приводит к снижению скорости синтеза relA-PHK, в то время как скорость синтеза pyrG-РНК остаётся неизменной. Полученные данные свидетельствуют о том, что транскрипция гена relA регулируется в соответствии с уровнем ppGpp. По-видимому, ppGpp обеспечивает координированную регуляцию транскрипции рибосомных оперонов и гена relA, в результате чего при изменении численности рибосомной популяции может сохраняться доля рибосом, содержащих віт фактор. Благодаря этому в растущих клетках поддерживается определённый уровень чувствительности трансляционного аппарата к степени апилирования тРНК, что является важным условием "строгого" контроля метаболизма бактерий. Клонирование гена relA на мультикопийных плазмидах в клетках E.coli позволило выявить новые стороны "строгого" контроля клеточного метаболизма. Прежде всего, сопоставляя уровень (p)ppGpp в клетках, различащихся дозой генагеїА, мы выяснили, что способность синтезировать (p)ppGpp может зависеть не только от степени дефицита аминокислот, но и от экспрессии генагеїА. Возросший уровень (p)ppGpp и, соответственно, сниженный уровень 6ТР в клетках с высокой дозой гена relA интерпретированы нами, как следствие обогащения популяции рибосом продуктом гена relA - str фактором. Повышенная способность рибосом регистрировать степень амино-ацилирования тРНК при амплификации гена relA позволило исследовать роль этого гена в синтезе (p)ppGpp не только в условиях острого дефицита аминоацил-тРНК, но и в условиях так называемого сбалансированного роста. Клетки, содержащие несколько копий гена relA, содержат больше (P)PPGPP и растут медленнее, чем обычный relA штамм.
Это наблюдение интересно с двух точек зрения: во-первых, xelA-зависимый синтез (p)ppGpp в растущих клетках опосредован рибосомной реакцией, то есть повышение дозы генагеїА в растущих клетках позволяет обнаружить определённую степень деацилирования тРНК; во-вторых, наблвдая обратную зависимость между содержанием (p)ppGpp и скоростью роста культуры клеток бактериального штамма, мы можем предполагать, что при замене источников углерода изменяется и степень аминоацилирования тРНК. Если скорость синтеза (p)ppGpp может регулироваться не только в соответствии с деацилированием тРНК, но зависит и от экспрессии генагеїА , то вполне уместен вопрос о регуляции этой экспрессии. Располагая клонированным геном relA , мы могли измерить скорость синтеза relA-рнк методом РНК-ДНК гибридизации. Мы обнаружили, что транскрипция гена relA регулируется по тому же принципу, что и транскрипция рибосомных оперонов. При дефиците аминоацил-тРНК синтез relA-РНК зависит от способности клеток накапливать ppGpp: синтез relA-PHK ингибируется в ге1А+ клетках, но не в клетках гв1А""мутантов, причём хлорамфе-никол способен стимулировать синтез relA-PHK в голодавших ге1А+ клетках. Общность регуляции транскрипции relA гена и рибосомных оперонов наблвдается и при измерении скорости синтеза relA-PHK в клетках, растущих на различных средах. Нами обнаружено возрастание скорости синтеза relA-PHK при увеличении скорости роста культуры клеток бактериального штамма E«coii. В целом, эти данные позволяют считать, что ppGpp является негативным регулятором транскрипции гена relA. В таком случае следует ожидать, что при увеличении дозы генагеІА и возрастании уровня ppGpp эффективность транскрипции каждой из relA копий будет понижаться. Действительно, такое ограничение эффекта дозы гена relA наблвдается при сопоставлении штаммов, с резко различакщимся числом копий relA гена. Таким образом, нами впервые показано, что транскрипция гена relA негативно регулируется его метаболическим продуктом - ppGpp. Интересно отметить, что скорость синтеза relA-PHK прямо пропорциональна квадрату скорости роста культуры клеток. Подобным образом зависит от скорости роста синтез рРНК, но не матриц для р-белков.
