Уровень транскрипции генов-онкомаркеров в клетках крови больных гемобластозом Малахо Софья Гарифовна

Содержание к диссертации

Введение

2 Обзор литературы 8

2.1 В-клеточный хронический лимфолейкоз 10

2.2 Организация и перестройка генов вариабельного региона иммуноглобулинов. Формирование В-клеточного репертуара . 17

2.3 Соматическая гипермутация 22і

2.4 Изучение V-генов при лимфатических опухолях 26

2.5 Изучение молекулярных маркеров при В-клеточном хроническом лимфолейкозе 30

2.6 Особенности метода ПЦР в реальном времени 37

3 Экспериментальная часть 52

3.1 Объекты и методы исследования 52

3.1.1 Реактивы 52

3.1.2 Среды 52

3.1.3 Характеристика больных 53

3.1.4 Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (ПМК) и селекция клеток CD 14+, CD4+, CD8+ и CD 19+ 55

3.1.5 Получение препаратов ДНК, РНК и кДНК 55

3.1.6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 56

3.1.7 Подготовка стандартов для абсолютного количественного анализа 57

3.1.7.1 Клонирование в плазмиде 57

3.1.7.2 Отбор рекомбинантных ДНК 57

3.1.7.3 Рестрикция ДНК 58

3.1.8 Секвенирование ДНК 58

3.1.9 Создание олигонуклеотидных систем для детекции методом ПЦР- 5 8 *

РВ

3.1.10 Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ)

3.1.11 Определение мутационного статуса генов иммуноглобулинов 63

3.1.11.1 Амплификация клонально-перестроенных генов вариабельного региона иммуноглобулинов 63 -

3.1.11.2 Очистка ампликонов и определение их нуклеотиднойпоследовательности 64

3.1.12 Компьютерные программы 66

3.1.13 Статистический анализ 66

3.2 Результаты исследований и их обсуждение 68.

3.2.1 Предыстория работы 68

3.2.2 Разработка и тестирование набора реактивов для ПЦР-РВ 68

3.2.3 Анализ мутационного статуса вариабельного региона генов иммуноглобулинов 82

3.2.4 Выбор референтного гена и генов, перспективных онкомаркеров В-ХЛЛ 86

3.2.5 Оценка уровня транскрипции генов ZAP-70, ZBTB20, DMD, MYCN nLPL 89

3.2.6 Анализ уровня транскрипции генов ZAP-70, ZBTB20, DMD, MYCN и LPL в различных субпопуляциях клеток крови 91

3.2.7 Взаимосвязь уровня транскрипции генов ZAP-70, ZBTB20, DMD, MYCNVLLPL С мутационным статусом 95

3.2.8 Анализ «нетипичных» случаев В-ХЛЛ 97

3.2.9 Взаимосвязь уровня транскрипции генов LPL и DMD с выживаемостью и другими прогностическими факторами 99

3.2.10 Обсуждение результатов 102

Заключение 117

• Организация и перестройка генов вариабельного региона иммуноглобулинов. Формирование В-клеточного репертуара
• Изучение молекулярных маркеров при В-клеточном хроническом лимфолейкозе
• Подготовка стандартов для абсолютного количественного анализа
• Определение мутационного статуса генов иммуноглобулинов

Введение к работе

Лимфатические опухоли входят в группу самых распространенных опухолей у человека, а у детей занимают второе место по частоте. По данным статистических исследований в США, в последние десятилетия частота гемобластозов ежегодно возрастает на 4%. Причины этого роста не известны и одним из важных направлений современной науки стало изучение биологии лимфатических опухолей и улучшение их диагностики.

Одной из наиболее распространенных лимфатических опухолей является В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ). Это заболевание характеризуется гетерогенностью течения. Продолжительность жизни больных колеблется от нескольких месяцев до десятков лет. Исследования последних лет позволили выявить несколько маркеров прогноза В-ХЛЛ. В частности, было показано, что прогноз заболевания зависит от уровня созревания клетки-предшественницы В-ХЛЛ, который определяется по состоянию вариабельного региона генов иммуноглобулинов. Исследование мутационного статуса генов иммуноглобулинов - дорогой и трудоемкий метод, мало приемлемый в практической медицине. В связи с этим необходимы другие маркеры, пригодные к использованию в клинической практике.

Альтернативным способом оценки прогноза В-ХЛЛ может быть анализ различий уровня транскрипции генов в вариантах В-ХЛЛ, отличающихся по мутационному статусу генов иммуноглобулинов. Так, было показано, что экспрессия ZAP-70 коррелирует с мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов. Благодаря наличию антител к ZAP-70 довольно быстро были разработаны тесты, позволяющие оценивать экспрессию ZAP-70 с помошыо проточной цитофлуориметрии. Однако, иммуногистохимическое исследование костного мозга антителом к ZAP-70 не надежно, поскольку этот ген сильно экспрессируется в Т-клетках, примесь которых у больных В-ХЛЛ может быть велика. По этой же причипе пе падежна оценка уровня мРНК ZAP-70 методами полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-

ПЦР) или количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ): такая оценка требует предварительной селекции В-лимфоцитов.

В последние годы в результате экспериментов с микрочипами составлен список генов, уровень транскрипции которых существенно различается в подгруппах больных В-ХЛЛ. Показано, что различия в уровне мРНК некоторых из этих генов (DMD, ZBTB20, ZAP-70 и др.) довольно велики и относительно постоянны. Мы предположили, что эти гены могут использоваться в качестве дополнительных маркеров мутационного статуса иммуноглобулинов. Сам по себе анализ с помощью микрочипов вполне решает проблему прогнозирования течения В-ХЛЛ. Однако он еще более трудоемок, чем исследование мутационного статуса, дорог и не всегда надежен. Выборочная оценка наиболее значимых генов методом ПЦР в реальном времени при адекватных контролях представляет собой разумную альтернативу этому важному методу и может стать мощным оружием диагноза и прогноза.

Делью настоящей работы является определение уровня мРНК генов — потенциальных онкомаркеров в представительной группе больных В-ХЛЛ и доноров.

Для достижения цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Создать высокочувствительную и надежную методику ПЦР в реальном

времени (ПЦР-РВ) для точного количественного определения уровня мРНК генов.

1. Определить уровень мРНК генов эндогенного контроля (GAPDH, ТВР, 18S rRNA, HPRT1) в норме и хроническом лимфолейкозе.

2. Изучить и сравнить уровень мРНК генов - потенциальных онкомаркеров (ZAP-70, DMD, ZBTB20, LPL и MYCN) в норме и хроническом лимфолейкозе.

3. Выбрать наиболее значимые генетические маркеры для разработки тест-системы прогноза В-клеточного хронического лимфолейкоза.

2 Обзор литературы

Неходжкинские лимфомы подразделяются на две главные категории: В-клеточные лимфомы, которые развиваются из аномальных В-лимфоцитов и Т-клеточные лимфомы, которые развиваются из аномальных Т-лимфоцитов. Частота неходжкинских лимфом за последние 20 лет удвоилось. Клинические проявления лимфом разнообразны, поскольку они могут расти практически в любом органе. Течение неходжкинских лимфом также бывает разным. Некоторые развиваются длительно, годами и десятилетиями, и даже не требуют лечения. Другие характеризуются более агрессивным течением. По клиническому течению неходжкинские лимфомы подразделяются на три категории: высоко-агрессивные, агрессивные и вялотекущие. Со временем, лимфомы могут приобретать более агрессивное течение. Это называется* трансформацией. В таком случае клетки иначе выглядят под микроскопом и заболевание хуже поддается лечению.

Клетки агрессивных лимфом делятся очень быстро. Лимфоузлы и органы, в которых растут агрессивные лимфомы быстро увеличиваются в размерах, симптомы болезни появляются относительно рано. Некоторые агрессивные лимфомы характеризуются особенно быстрым ростом - по дням и неделям. К ним относятся лимфома Беркитта, Т- и В-лимфобластные лимфомы. Они встречаются преимущественно у детей и молодых людей. У пожилых людей агрессивные лимфомы протекают медленнее. Пик заболеваемости приходится на 50 лет. Как и при болезни Ходжкина, мужчины заболевают чаще женщин.

Клетки вялотекущих лимфом делятся очень медленно. Основная причина их накопления состоит в том, что лимфоциты, выполнившие свою задачу по уничтожению возбудителя, не могут умереть. Вялотекущие лимфомы характеризуются длительным спокойным течением, но существенно менее чувствительны к химиотерапии. Заболевают, в основном, пожилые люди, чаще мужчины. Лимфоузлы и органы увеличиваются очень медленно,

9 симптомы болезни появляются нескоро, иногда через несколько лет от начала болезни. Многие пациенты с вялотекущими лимфомами вообще не требуют лечения до тех пор, пока болезнь не вызывает проблем.

В дебюте далеко не всегда можно прогнозировать течение 'болезни. Слишком раннее начало лечения- приводит к тому, что неоправданно накапливается токсичность химиотерапии, а это крайне нежелательно. У пациентов, с лимфомами часто применяется лечебная тактика, которая называется «выжидательное наблюдение». Такой тактики придерживаются* у больных с вялотекущими лимфомами и хроническим лимфолейкозом- в случаях, когда болезнь не вызывает никаких симптомов и не ухудшает качество жизни. Такое состояние может длиться годами, иногда десятилетиями. Выжидательное наблюдение предполагает, что пациент регулярно проходит обследование. Это продолжается до тех пор,; пока не появится серьезных проблем, связанных с болезнью. Если появляются признаки, свидетельствующие о прогрессии болезни, эту тактику прерывают и назначается какой-то вариант лечения.

Точная дифференциальная диагностика лимфом имеет принципиальное значение. Во-первых, потому, что опухоли, даже очень похожие клинически и; гистологически, могут радикально различаться по прогнозу. Во-вторых, если раньше выбор вариантов лечения, имевшийся в распоряжении докторов, был относительно не велик, то сегодня арсенал способов воздействия значительно расширен. Очень часто требуется дополнительное исследование — иммуногистохимия. При этом тонкий срез обрабатывают мечеными антителами против определенных молекул (CD). CD - кластеры дифференциации (cluster of differentiation) - это маркеры, которые имеются на? поверхности клеток, в том числе лимфоцитов. Определенная комбинация этих маркеров говорит о типе клеток, из которых возникла лимфома и позволяет поставить точный диагноз. Так, В-лимфоциты имеют на своей поверхности CD 19, CD20, CD22 и другие маркеры, а Т-лимфоциты CD3, CD4, CD8, CD5.

10 Соответственно, лимфомы, возникающие из них также несут эти маркеры. Анализ CD на клетках называется иммунофенотипирование, а анализ CD в ткани называется иммуногистохимия. Некоторые CD являются мишенями для< терапевтических антител. Так, CD20 - мишень для антитела ритуксимаб (Мабтера), a CD52 - мишень для антитела Campath-ІН (алемтузумаб).

2.1 В-клеточный хронический лимфолейкоз

Хронический лимфолейкоз (лимфома из малых лейкоцитов, или лимфоцитарная лимфома) — ХЛЛ — опухоль, развивающаяся из неопластических В-лимфоцитов и имеющая характерный иммунофенотип. В-лимфома из малых лимфоцитов определяется как тканевая инфильтрация (лимфоузлов, печени, селезенки) В-лимфоцитами, морфологически и иммунофенотипически соответствующих таковым при В-клеточном хроническом лимфолейкозе. Почти в 98% случаев диагностируется В-клеточный вариант ХЛЛ и крайне редко — Т-клеточный.

В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) является наиболее часто встречающимся лейкозом в западных странах и составляет 20-40% всех форм. ХЛЛ преобладает у лиц среднего и пожилого возраста. Средний возраст больных при диагностике заболевания - 64 года (в России средний возраст ниже). Мужчины заболевают в два раза чаще женщин. Каких-либо этиологических факторов ХЛЛ не установлено. Это один из немногих лейкозов взрослых, происхождение которого не обусловлено воздействием химических веществ, вирусов, ионизирующей радиации или лекарственных препаратов, а также единственная форма, этиологически не связанная с атомными взрывами.

В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) происходит из-за постоянного накопления мелкоклеточных, медленно делящихся моноклональных В-лимфоцитов [1]. Треть пациентов не требует лечения и имеет длительную выживаемость, у другой трети вялотекущая в начале

и болезнь впоследствии прогрессирует, оставшаяся треть пациентов имеет агрессивную болезнь в начале и нуждается в немедленном лечении.

Хронический лимфолейкоз вызывает медленное . увеличение численности В лимфоцитов в костном мозге. Морфологическим субстратом В-ХЛЛ являются малые В-лимфоциты, которые экспрессируют большинство-поверхностных маркеров, представленных на зрелых В-лимфоцитах в норме и локализованных в мантийной зоне вторичных лимфоидных фолликулов. Раковые клетки распространяются из костного мозга в кровь, могут также затронуть лимфоузлы и другие органы. ХЛЛ приводит к нарушению функционирования костного мозга и ослаблению иммунной системы. Обычно симптомы развиваются постепенно. Для постановки диагноза В-ХЛЛ необходимо наличие в периферической крови не менее 5.0x10⁹/л малых, морфологически зрелых лимфоцитов, присутствие которых при проведении дифференциальной диагностики не может быть обусловлено другими заболеваниями, протекающими с лимфоцитозом. В аспирате костного мозга инфильтрация лимфоцитами должна быть не менее 30%. Лимфоидные клетки при ХЛЛ в основном являются моноклональными В-лимфоцитами, экспрессирующим CD19, CD20, CD23 и CD5, с одновременным содержанием низкого уровня на поверхности клетки slg. Большинство В-лимфоцитов являются покоящимися. Более 99% циркулирующих клеток при ХЛЛ находится в Go-фазе клеточного цикла [2].

Гетерогенность клинических проявлений ХЛЛ обусловлена многообразием клинических форм заболевания. Разработанная Rai [3] и Binet [4] система стадий позволила разделить пациентов с хроническим лимфолейкозом на три прогностические группы: с. благоприятным, промежуточным и неблагоприятным прогнозом. Также две системы стадийности улучшили идентификацию пациентов, которые нуждаются в немедленном лечении.

12 Наиболее широкое распространение получила классификация K.R. Rai [3], включающая четыре стадии:

Таблица 1. Классификация ХЛЛ (по K.R. Rai, 1975)

Эта система в последующем была упрощена до трех стадий: 0 - низкий риск прогрессирования заболевания, I + II - промежуточный и III + IV -высокий.

Во Франции несколькими годами позже J.L.Binet [4] предложил свою трехстадийную систему:

Таблица 2. Классификация ХЛЛ (по J.L. Binet, 1977)

Классификация по K.R. Rai наиболее часто используется в США, a JJL. Binet — в Европе. Основное различие между двумя системами заключается в» недостатке системы J.L. Binet идентифицировать у больных стадию 0 по K.R. Rai.

Стадия — это термин, который используется для того, чтобы описать распространенность болезни в организме. Определение стадии предоставляет важнейшую информацию, позволяющую предсказывать прогноз и выбирать вариант лечения. С другой стороны, сам по себе вариант лимфомы гораздо важнее, чем стадия, т.е. прогноз больше зависит от диагноза, чем от стадии.

Примерно у 3-10% больных ХЛЛ регистрируется злокачественная^ трансформация (ЗТ). Наиболее частое проявление ЗТ ХЛЛ - это развитие синдрома Рихтера, описанного в 1928 г. М. Richter [5]. Синдром Рихтера, развивается примерно у 5% больных ХЛЛ. Он характеризуется выраженной лимфоаденопатией, гепатоспленомегалией, лихорадкой, болями в брюшной полости, потерей веса, прогрессирующей анемией и тромбоцитопенией, а также резким возрастанием числа лимфоцитов. Редко, хронический лимфолейкоз может также трансформироваться в промиелоцитарный лейкоз, лимфому Ходжкина, множественную миелому и плазмоклеточный лейкоз.

Результаты двух крупных исследований [6; 7] продемонстрировали, что терапия хлорамбуцилом (алкилирующим агентом, стандартно используемым для лечения В-ХЛЛ) для группы пациентов с благоприятным прогнозом могла быть начата позднее. Более чем 25% этих вялотекущих случаев, однако, умирают от причин, связанных с хроническим лимфолейкозом, у 40% болезнь прогрессируете развернутые стадии и 50% в конечном счете требуют лечения [6; 8]. Никакая из систем стадийности, ни по Rai ни по Binet не может предсказать какие пациенты из группы с благоприятным прогнозом переместятся в группу с прогрессией заболевания.

В последние годы тактика ведения. В-ХЛЛ претерпевает значительные изменения. Это связано с появлением новых препаратов, вызывающих полные ремиссии, разработкой высокочувствительных молекулярных и^ иммунофенотипических способов слежения за минимальной остаточной болезнью, внедрением в клиническую практику новых методов анализа молекулярных признаков этой болезни. Соответственно меняются цель и показания к началу терапии хронического лимфолейкоза. У многих пациентов необходимо.добиваться полной ремиссии. На смену традиционной тактике, в соответствии с которой течение В-ХЛЛ подразделялось на начальную стадию, не требующую терапии, и стадию развернутых клинических проявлений, когда терапия показана, приходит адаптированная к риску терапия [9]. При этом подходе в дебюте болезни определяются факторы прогноза В-ХЛЛ (табл. 3). Они позволяют установить, каким пациентам следует начинать лечение вскоре после установления диагноза и какой вариант лечения предпочтителен. На практике адаптированную к риску терапию В-ХЛЛ можно применять, используя генетические или статичные факторы прогноза [10].

В дебюте у большинства больных В-ХЛЛ костный мозг поражен только частично. Со временем костный мозг полностью замещается опухолевыми клетками во всех случаях. Клетки В-ХЛЛ секретируют бета-2-микроглобулин в небольших количествах. Чем больше масса опухоли, тем выше уровень этого

15 белка. Другие показатели, такие как время удвоения лимфоцитов или экспрессия белка Ki-67 характеризуют скорость увеличения опухолевой массы, то есть отражают пролиферирующую фракцию. Время удвоения лимфоцитов, вьиисляемое как отношение произведения абсолютного числа лимфоцитов и числа месяцев между измерениями к разности между вторым и первым уровнем лимфоцитов не носит постоянного характера. Нередко можно наблюдать двухфазный характер прироста лимфоцитов. Таким образом, большинство факторов прогноза В-ХЛЛ зависят от скорости прироста массы опухоли и от того, на каком сроке обнаружилось заболевание.

В 1986 году группа ученых [11] выделила группу больных с длительно протекающей формой ХЛЛ, не имевших признаков прогрессирования заболевания, и группу с развернутой клинической картиной, нуждавшихся в лечении. В 1990-х годах В-ХЛЛ был подразделен на 2 варианта в зависимости от наличия или отсутствия признаков соматической гипермутации в генах вариабельного региона тяжелой цепи иммуноглобулинов (IgVH) [12]. При исследовании мутации этих генов выделяются «примитивные» и более зрелые В-клетки, что позволяет разделить больных ХЛЛ на две различные прогностические группы: с относительно благоприятным прогнозом (при наличии мутаций гена) и с неблагоприятным (при отсутствии мутаций гена). Эти две популяции характеризуются заметным различием в клиническом исходе, так, группа больных с немутировавшим геном имеет более короткую продолжительность жизни. Наиболее частым цитогенетическим отклонением при ХЛЛ является делеция 13q, которая выявляется в 55% случаев и коррелирует, как правило, с доброкачественным течением заболевания. Делеция llq23 выявляется в 18% случаев и ассоциирована с массивной лимфоаденопатией и агрессивным течением заболевания [13]. Трисомия 12 наблюдается в 16% случаев и связана с атипичной морфологией и плохим исходом. Онкоген, непосредственно причастный к патогенезу ХЛЛ, не установлен.

Таблица 3. Наиболее значимые факторы прогноза В-ХЛЛ.

Только цитогенетические аберрации и мутационный статус иммуноглобулинов являются- по-настоящему статичными: они не меняются со временем. Именно эти показатели являются наиболее ценными, потому что они позволяют выявить неблагоприятные категории больных уже в дебюте заболевания. Таким образом можно вычленить пациентов, требующих раннего начала терапии. Это особенно важно в связи с тем, что в последние годы появились несколько новых препаратов, вызывающих полные ремиссии при В-ХЛЛ: флударабин, мабтера, кэмпас, зевалин. Следует отметить, что эти препараты довольно токсичны. Поэтому применение их у всех пациентов не оправданно. Существует категория больных В-ХЛЛ, которым никогда не

17 потребуется лечение (так называемый, «тлеющий» В-ХЛЛ). Предсказать тлеющий характер течения В-ХЛЛ по «классическим» факторам прогноза невозможно.

Таким образом, классические или динамичные маркеры прогноза, такие как тип инфильтрации костного мозга, уровень лейкоцитов и растворимого в сыворотке CD23, коррелируют с массой опухоли и меняются со временем. Напротив, генетические маркеры прогноза не меняются со временем и уже в. дебюте и могут предсказывать неблагоприятное течение В-клеточного хронического лимфолейкоза.

2.2 Организация и перестройка генов вариабельного региона иммуноглобулинов. Формирование В-клеточного репертуара.

Иммуноглобулин состоит из четырех полипептидов: двух идентичных тяжелых и двух идентичных легких цепей, которые соединены между собой дисульфитными связями. Белки тяжелых и легких цепей кодируются независимо. Крайние домены одной легкой цепи и одной тяжелой цепи соединены вместе и формируют антиген-связывающий участок. Поэтому каждая молекула иммуноглобулина (Ig) содержит два антиген-связывающих участка. В каждом антителе N-концевые домены тяжелых и легких цепей устроены по-разному. Поэтому эти участки называются вариабельными. Другие домены молекулы иммуноглобулина консервативны и поэтому названы константными. Вариабельные и константные участки тяжелых и легких цепей кодируются независимо друг от друга.

Гены иммуноглобулинов существуют в нескольких локусах: локус каппа-цепи (2р 11), локус лямбда-цепи (22qll) и локус тяжелой цепи (14q32). Локусы всех генов иммуноглобулинов организованы однотипно. Имеется множество вариабельных генов (V, variable) и всего несколько генов, кодирующих константный регион (С, constant). Между V и С-генами располагается еще небольшое количество соединительных сегментов (J,

18 joining). В локусе тяжелой цепи (Н), помимо V, J и С сегментов имеются еще и D-сегменты, названные так потому, что они вносят дополнительное разнообразие (D, diversity) в участок, кодирующий вариабельную область иммуноглобулина. Перед каждым V-геном имеется короткая лидерная последовательность, отделенная интроном.

Перестройка генов тяжелой цепи иммуноглобулинов проходит в несколько этапов. На первом этапе любой из DH-сегментов соединяется с любым из JH-сегментов (неполная перестройка). Далее новообразованный DH-JH сегмент соединяется с каким-либо VH-сегментом (полная перестройка). Образовавшийся сегмент VH-D-JH кодирует полный вариабельный регион тяжелой цепи. К этому этапу перестроенный участок состоит из короткой лидерной последовательности, короткого интрона, сегмента VH-D-JH, интрона и С-сегментов. Перед С-сегментами могут лежать несколько JH-сегментов. Перед лидерной последовательностью на 5'-конце гена находится последовательность промотора. РНК-полимераза связывается с ней после того, как VH-D-JH-перестройка полностью завершена. Далее вся последовательность, начиная с лидера транскрибируется в матричную РНК. Первичный транскрипт мРНК содержит последовательность лидера, интрон, участок VH-D-JH, интрон, сегменты Сц, С5. Изотип иммуноглобулина (M/D, G, А) определяется в ходе процессинга РНК по механизму альтернативного сплайсинга. На этом же уровне происходит образование мембранной и секретируемой формы иммуноглобулинов. После процессинга мРНК иммуноглобулина содержит последовательность лидер-VH-D-JH-C и транслируется в белок. Модификация белка состоит в удалении лидерной последовательности.

Процесс рекомбинации происходит с участием нескольких ферментов, формирующих рекомбиназный комплекс (RAG1, RAG2, TdT, ДНК-лигаза IV, ДНК-зависимая протеинкиназа) и направляется определенными последовательностями ДНК, лежащими между VH, D и JH-генами. Этих

19 последовательностей две: нонамер 5'-АСАААААСС-3' и гептамер 5'-CACAGTG-3'. Гептамер всегда примыкает к кодирующей последовательности VH, D или JH-генов. Нонамер располагается на удалении от гептамера. Расстояние между ними консервативно и приблизительно равно 12 или 23 нуклеотидам, что составляет одну или две петли ДНК. Благодаря этому нонамер и гептамер оказываются в ходе перестроек на одной стороне петли ДНК и формируют последовательность, распознаваемую рекомбиназным комплексом. Процесс рекомбинации подчиняется правилу 12/23: соединение происходит только между сегментами, отделенными разным числом нуклеотидов - 12 и* 23. Сегменты, отделенные участками равной длины (например, 12 и 12 или 23 и 23) не соединяются. В генах тяжелой цепи гептамеры V и J-сегментов отделены от нонамеров 23 нуклеотидами, а в D-сегментах — двенадцатью. Поэтому V-сегмент не может соединиться с J-сегментом. Сначала происходит соединение D-JH, а затем VH-D-JH.

Гены иммуноглобулинов перестраиваются только в лимфоидных клетках. Во всех других соматических и половых клетках они не изменены. Состояние генов иммуноглобулинов в нелимфоидных клетках называется терминальным (germline configuration).

Помимо 14 хромосомы небольшое число VH-сегментов было обнаружено на 15 и 16 хромосомах [14]. Однако только на 14 хромосоме располагаются J-сегменты, необходимые для процесса рекомбинации. Экспрессия VH-сегментов на 15 и 16 хромосомах требует межхромосомной рекомбинации. В настоящее время нет данных, что эти сегменты используются в репертуаре В-лимфоцитов. Локус тяжелой цепи на 14 хромосоме занимает 2.5 — 3 МБ и нуклеотидная последовательность этого региона полностью определена. В локусе тяжелой цепи 25 D-сегментов и 6 JH-сегментов. С-генов, 10: Сц, С5, СуЗ, Cyl, Се\|/, Cotl, Су2, Су4, Cs и Ссс2. Они кодируют, соответственно IgM, IgD, IgG3, IgGl, IgAl, IgG2, IgG4, IgE и IgA2 изотипы

20 тяжелых цепей. Сє\|/ - псевдоген (функционально неактивный участок ДНК, возникший в результате мутаций в родительском гене).

Что касается VH-сегментов, то их число в локусе тяжелой цепи зависит от гаплотипа, но обычно оно равно 95 [14]. Однако работоспособных VH-сегментов, принимающих участие в формировании В-клеточного репертуара всего 51. Это объясняется существованием множества псевдогенов, наличием нескольких копий одних и тех же сегментов. В локусах 15qll.2 и 16qll.2 расположены еще 24 VH-сегмента, однако как уже упоминалось, они . не функциональны. Таким образом, общее число VH-генов в гаплоидном геноме равно 119. Расположение VH-генов на нескольких хромосомах объясняет различие в оценке числа VH-генов, полученное в 1980-х и начале 1990-х годов разными исследовательскими группами при использовании разных методов [15; 16]. Было установлено, что все VH-гены являются потомками одного' общего предшественника. Новые VH-гены образовались в процессе развития благодаря дупликациям, вставкам, мутациям в родительских генах. По гомологии все VH-гены подразделены на 7 семейств [14]. Члены одного семейства могут быть высоко (VH4) или менее (VH3) гомологичны друг другу.

Вариабельные регионы тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов образуют три петли. Вершины петель расположены близко друг к другу и формируют антиген-связывающий участок. Участки петель, образующие антиген-связывающий участок называются районами, определяющими комплементарность (CDR, complementarity determining regions) (рис. 1). Районы, определяющие комплементарность, разделены каркасными районами - FWR, framework regions. Эти участки обеспечивают такую конформацию вариабельного региона, при которой CDR собраны вместе. Таким образом, вариабельный регион как легкой, так и тяжелой цепи содержит три района, определяющих комплементарность и четыре каркасных района FWR. Два района CDR находятся целиком на V-сегменте, в то время как третий, CDR3,

21 формируется при участии 3'-конца V-сегмента, D-сегмента целиком и 5'-конца J-сегмента.

Рисунок 1. Структура вариабельного региона тяжелой цепи иммуноглобулина.

При сравнении герминальных последовательностей всех VH-генов или VH-генов одного семейства можно видеть, что последовательности каркасных районов у всех VH-генов очень похожи, тогда как последовательности CDR отличаются даже среди VH-генов одного семейства. Таким образом, районы FWR более консервативны, а районы CDR обладают большим разнообразием. Сопоставить с каркасным районом можно только CDR1 и CDR2. Район CDR3 формируется при участии VH, D и JH сегментов, и поэтому в не лимфоидных клетках его не существует. CDR3 - самый вариабельный участок и именно он уникален у каждого антитела еще до соматической гипермутации.

Совокупность всех вариантов иммуноглобулинов, экспрессируемых В-клетками, называется репертуаром. Изучение всех вариантов антител, экспрессируемых определенной популяцией В-клеток невозможно, по крайней мере, в обозримом будущем. Но можно изучать представительство в В-клеточном репертуаре VH-, D- и JH-генов. В отсутствие селекционного воздействия на репертуар частота встречаемости семейств и отдельных VH, D и JH-генов должна совпадать с нормой. Селекционное воздействие на данную популяцию В-клеток может приводить к предпочтительному использованию или не использованию семейств или определенных генов. Знание репертуара генов вариабельного региона может послужить предпосылкой к поиску конкретных антигенов или закономерностей развития иммунного ответа. Далее под словом репертуар подразумевается представительство в популяции VH-, D и JH-генов.

22 2.3 Соматическая гипермутация

Перестройка генов антигенных рецепторов происходит на ранних стадиях созревания В-лимфоцитов в костном мозге и прекращается с исчезновением рекомбиназной активности. Однако в ходе иммунного ответа гены вариабельного региона продолжают изменяться по механизму соматической гипермутации. В процессе соматической гипермутации на небольшом по протяженности участке (1500 - 2000 нуклеотидов), где располагается перестроенный VH-D-JH-сегмент, образуется множество мутаций.

Соматическая гипермутация происходит в зародышевых центрах лимфоидных фолликулов, где активированные антигеном лимфоциты пролиферируют и подвергаются клональной селекции. Мобилизация механизма соматической гипермутации в стимулированных антигеном В-клетках происходит под влиянием Т-хелперов. Мутации, сопровождающиеся аминокислотной заменой меняют аффинность антиген-связывающего участка антитела. Под созреванием аффинности понимают то, что аффинность антител, полученных в конце иммунного ответа, существенно превышает аффинность антител, которые впервые связывают антиген. Поэтому в ходе иммунного ответа аффинность «созревает». Поскольку мутации носят случайный характер они, в большинстве случаев, приводят к утрате аффинности к антигену. Тогда В-клетка погибает по механизму апоптоза. В небольшом числе клеток мутации приводят к повышению аффинности В-клеточного рецептора к антигену. Такие В-клетки получают пролиферативные преимущества и дифференцируются либо в плазматические клетки, либо в В-клетки памяти. Таким образом, соматическая гипермутация - механизм созревания аффинности антител. Изменению аминокислотной последовательности вариабельного региона сопутствует селекция клеток, идиотип Ig которых обладает максимальной аффинностью к данному

23 антигену. Сформированный иммунный ответ характеризуется продукцией высоко-аффинных антител.

Степень участия соматической гипермутации в разнообразии специфичности антител очень велика. Терминальные VH-гены обычно кодируют низкоаффинные антитела ограниченной специфичности. Высокая, аффинность антител и необыкновенное разнообразие- специфичности достигается именно за счет соматической гипермутации.

Соматическая гипермутация происходит только в терминальных центрах (ГЦ). Терминальный (зародышевый) центр — непостоянное образование. В ходе иммунного ответа ГЦ появляются уже на первой неделе и существуют в течение 4 недель. Специфическое микроокружение ГЦ совершенно необходимо для индукции процесса соматической гипермутации и селекции В-клеток, основанной на аффинности. В-клетки связывают антиген вне терминальных центров. Таких клеток, по сравнению с потомством, немного. В* англоязычной литературе эти клетки называются founder B-cells (клетки обнаружившие антиген). Эти клетки связывают антиген, активируются и мигрируют в ГЦ, где интенсивно делятся с частотой одно деление за 6 - 7 часов. Делящиеся клетки, именуемые центробластами образуют нижний (направленный в сторону ворот) полюс зародышевого центра, так называемую темную зону [17] (рис. 2). Центробласты имеют морфологию бластов. Далее лимфоциты переходят в прилегающую светлую зону (направленную в сторону капсулы лимфоузла). Здесь они превращаются в центроциты - клетки размером с обычный лимфоцит, часто с расщепленным ядром. Кинетические исследования с использованием радиоактивной метки показали, что центробласты захватывают метку в течение 2 часов после ее введения. В светлой зоне клетки, включившие метку, появляются через 6-8 часов [17]. С учетом этих наблюдений, центроциты не делятся, по крайней мере, с такой же интенсивностью, как центробласты, а дифференцируются из центробластов и приходят в светлую зону из темной. Антигены, по которым происходит отбор

24 клеток, концентрируется в светлой зоне на поверхности фолликулярных дендритных клеток. Это явное анатомическое разделение зон деления и созревания аффинности клеток послужило основой гипотезы одного пассажа [18].

Рисунок 2. Схема движения клеток в терминальном (зародышевом) центре.

В соответствии с этой гипотезой, активированные В-клетки входят в зародышевый центр, делятся в темной зоне, затем перемещаются в светлую зону, подвергаются селекции. Прошедшие отбор клетки становятся клетками памяти и покидают ГЦ через мантийную зону. Клетки памяти активно рециркулируют.

У разных видов соматическая гипермутация может происходить по разным механизмам. У человека она изучена менее всего. Так, например, до сих пор не известно, происходят ли мутации в ходе репликации ДНК или в ходе транскрипции генов иммуноглобулинов. Известно, что соматическая гипермутация характеризуется следующими особенностями [19]:

мутации IgV-генов происходят со средней частотой: одна на 200 нуклеотидов;

мутации представляют собой преимущественно замены одного нуклеотида, существенно реже встречаются делеции и вставки;

мутации могут концентрироваться в «горячих точках» и среди них чаще всего в тринуклеотидных последовательностях AGY.

Соматическая гипермутация начинается с области промотора вариабельного региона и ограничивается районом в 1.5 — 2 т.п.н. в сторону 3'-конца. Экзоны константного региона, отделенные от экзонов вариабельного региона интроном длиной в несколько тысяч пар нуклеотидов не содержат мутаций. Мутации происходят в большей степени на одной цепи, однако какая именно цепь больше мутирует не установлено. Наконец, нуклеотиды А заменяются чаще, чем Т [20]. Изучив характер мутаций у трансгенной мыши, у которой в вариабельный регион был вставлен искусственно созданный фрагмент многократно повторяющихся и чередующихся друг с другом сайтов рестрикции EcoRV и PvuII, группа исследователей [21] предложила следующий механизм соматической гипермутации. Модель предполагает существование фактора мутаций (авторы назвали его мутационным фактором), который соединяется с РНК-полимеразой во время элонгации РНК и вызывает мутации. Общая протяженность района мутаций может определяться вторичными структурами новообразованной цепи РНК и фактор мутаций имеет нуклеотидную специфичность.

Гипотетический мутационный фактор (МФ) связывается с РНК-полимеразой II, которая начинает транскрипцию с промотора иммуноглобулина (Ig). Связывание МФ с РНК-полимеразой происходит только когда определенный (неизвестный) белок, связывающий энхансер, взаимодействует с основными белками-участниками транскрипции. В ходе образования цепи РНК мутационный фактор двигается вместе с РНК-полимеразой. Известно, что РНК-полимераза может останавливаться, если встречает препятствие. Препятствием может быть шпилька образующейся цепи РНК. При этом изменяется конформация полимеразы и это приводит к тому, что МФ отсоединяется от РНК-полимеразы II и переносится на ДНК. Возможно, что МФ связывается с двуцепочечной ДНК непосредственно перед тем местом, где расположена РІЖ-полимераза II и вызывает разрыв нетранскрибируемой цепи ДНК. При этом МФ остается связанным с

26 новообразованным 5' -концом нетранскрибируемой цепи, а также с одним или несколькими нуклеотидами транскрибируемой цепи. Пока МФ связан с ДНК, разорванные концы нетранскрибируемой цепи не могут быть сшиты. Далее экзонуклеаза вырезает нуклеотид с 3'-конца разорванной цепи и ДНК-полимераза заполняет образовавшийся пробел, присоединяя нуклеотид, комплементарный основанию на транскрибируемой, связанному с МФ тем самым создавая мутацию. ДНК полимераза продолжает достраивать, нуклеотиды по транскрибируемой цепи и при этом отсоединяет МФ, связанный с 5'-концом нетранскрибирумой цепи от транскрибируемой. 5'-конец транскрибируемой цепи с прикрепленным к нему МФ образует свободный конец, который затем удаляется эндонуклеазой Fenl (ДНКаза IV). Свободные концы нетранскрибируемой цепи ДНК сшиваются лигазой. Вся схема носит гипотетический характер. Ферменты-участники такого механизма хорошо известны, кроме фактора мутаций и белка связывающегося с Ig промотором. По-видимому, МФ должен экспрессироваться очень короткое время в клеточном цикле.

2.4 Изучение V-генов при лимфатических опухолях

Систематический анализ V-генов при лимфатических опухолях позволил разделить все В-клеточные опухоли по происхождению в зависимости от того, прошла клетка-предшественница опухоли терминальный центр или нет. Оказалось, что большая часть лимфом происходит из зрелых клеток, контактировавших с антигеном. Список опухолей [22], в которых IgV содержит мутации следующий: центрофолликулярная лимфома, лимфома Беркитта, Беркитт-подобная лимфома у больных СПИДом, В-крупноклеточная лимфосаркома, группа лимфом из клеток маргинальной зоны, моноцитоидная лимфома, лимфоцитома селезенки (SLVL), пролимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, лимфоплазмацитоидная лимфома, миелома.

Наличие мутаций в последовательности вариабельного региона свидетельствует, что эта опухоль произошла из клетки, достигшей в своей дифференцировке центра фолликула и дальнейших стадий. Характер мутаций позволяет различать постфолликулярные опухоли и опухоли из клеток центра фолликула. В клетках центрофолликулярных лимфом механизм соматической гипермутации не выключен. Поэтому мутации продолжают накапливаться. Этот феномен обнаруживается' при клонировании ПЦР-продукта, соответствующего клонально-перестроенному вариабельному региону В-клеточной опухоли и определении нуклеотидной последовательности' множества клонов. Наличие нескольких повторяющихся субклонов, содержащих разные мутации (внутриклоновая гетерогенность), свидетельствует о том, что механизм соматической гипермутации не выключен, и мутационный процесс продолжается. Внутриклоновая гетерогенность типична для лимфомьь из клеток центра фолликула, диффузных крупноклеточных лимфом, лимфомы Беркитта.

К опухолям из зрелых В-лимфоцитов, в которых V-гены не содержат мутации, относится лимфома из клеток мантийной зоны. Ранее к этой группе относился и хронический лимфолейкоз. В нескольких, опубликованных до 95 года, работах по изучению мутационного статуса IgV при В-ХЛЛ подтверждали это предположение.

По мере того, как совершенствовались данные о локусе генов вариабельного региона тяжелой цепи иммуноглобулинов, появлялось все больше работ, свидетельствующих о гетерогенности ХЛЛ. Примерно в половине случаев гены вариабельного региона содержат мутации, в других случаях мутаций нет [23; 1]. К моменту опубликования полной нуклеотидной последовательности локуса тяжелой цепи [24] не оставалось уже никаких сомнений в том, что существует две группы хронического лимфолейкоза, различающихся по мутационному статусу. Изучался характер накопления мутаций вариабельного региона и особенности репертуара клеток В-ХЛЛ в

28 различных группах [12]. В более поздних работах [25; 26; 27] было показано,, что присутствие или отсутствие мутаций вариабельного гена иммуноглобулина предсказывает естественный ход развития болезни. Было найдено, что присутствие немутированного гена иммуноглобулина ассоциируется с худшим прогнозом, даже внутри группы пациентов на стадии AnoBinet[25;26].

Эти результаты предполагают, что есть два морфологически идентичных типа ХЛЛ: один возникает из относительно менее дифференцированных (иммунологически наивных) В-клеток с немутированным геном тяжелой цепи иммуноглобулинов, имеющий худший прогноз; другой происходит из более дифференцированных В-клеток (В-лимфоцитов- памяти) прошедших соматическую мутацию иммуноглобулина и имеет более благоприятный' прогноз. В пользу этого мнения говорит тот факт, что мутационный профиль генов иммуноглобулина ассоциируется с генетическими аберрациями. Так, делеции llq23 или 17р13 ассоциируются с плохим прогнозом и. немутированным профилем VH-генов, делеция 13ql4 или нормальный* кариотип ассоциируются с мутированным профилем, однако существует разногласие относительно того, ассоциируется ли трисомия 12 с немутированным статусом [13].

Факт прошедшей соматической гипермутации можно оценить. Для этого определяют нуклеотидную последовательность, соответствующую вариабельному региону генов иммуноглобулинов и сравнивают ее . с последовательностями терминальных V-генов, опубликованных в общедоступных базах данных. Если полученная последовательность VH-гена* на 100% совпадает (гомологична) с терминальной, клетка-предшественница этого < варианта В-ХЛЛ не проходила этап соматической гипермутации. В случае прошедшей гипермутации на участке протяженностью 300 п.н. обычно выявляется не менее 5 мутаций, что позволяет утвеждать, что данная клетка проходила стадию терминального центра.

«oj

70 I

&) »

зо:

^M:

10 і

о :

месяцы

Рисунок 3. Кривые выживаемости больных В-ХЛЛ с различным мутационным статусом генов вариабельного региона иммуноглобулинов по данным российского многоцентрового исследования [29]

IgVmut+ вариант с мутациями вариабельного региона,

IgVmut- вариант без мутаций вариабельного региона.

Данные, полученные группой российских ученых [28], свидетельствуют, что хронический лимфолейкоз может происходить из клеток разных стадий дифференциации В-лимфоцитов. Помимо различной клинической картины и прогноза, эти варианты В-ХЛЛ могут существенно отличаться по биологическим признакам. При варианте с положительным мутационным статусом (IgVHmut+) конечное онкогенное событие и опухолевая трансформация происходит на уровне постфолликулярной клетки памяти. В связи с этим, такой вариант хронического лимфолейкоза целесообразно называть постцентрофолликулярным. При варианте лимфолейкоза с отрицательным мутационным статусом (IgVHmut-) мутаций вариабельного региона нет, однако наблюдается существенное сужение репертуара VH-, D- и

JH-генов, причем этот репертуар не совпадает с репертуаром клеток CD5+, которые, скорее всего, являются предшественниками ХЛЛ. Это свидетельствует о том, что клетки ХЛЛ группы IgVHmut- также проходят селекцию- антигеном. Однако их развитие идет по Т-независимому пути, не включающему стадию терминального центра. В связи с этим, такой вариант хронического лимфолейкоза называют экстрафолликулярным. Варианты с разным мутационным статусом радикально различаются по прогнозу. Так, по данным российского многоцентрового исследования (рис. 3) медиана выживаемости больных вариантом В-ХЛЛ без мутаций IgVH составляет 7.6 лет, а с мутациями IgVH 22 года > [29].

Таким образом, мутационный статус генов вариабельного региона иммуноглобулинов в опухолевых клетках имеет огромное прогностическое значение при хроническом лимфолейкозе~ [30]. В случаях с немутированным-вариантом генов тяжелой цепи иммуноглобулинов; часто наблюдалась прогрессирующая стадия заболевания хроническим лимфолейкозом. Больные , с вариантом заболевания IgVHmut+ чаще имели неагрессивную стадию болезни. К сожалению,.из-за сложности проведения такой дифференциальной диагностики, данный способ определения прогноза заболевания является недоступным для большинства пациентов. В связи с этим необходимо было проводить поиск новых молекулярных маркеров заболевания, достоверно коррелирующих с мутационным статусом и клиническими данными.

2.5 Изучение молекулярных маркеров при В-клеточном хроническом

лимфолейкозе

В ранние дни клинической цитогенетики, в 1962 году, была описана хромосомная аномалия при ХЛЛ, затрагивающая маленькую акроцентрическую хромосому, возможно 21, авторы назвали ее как Ch(l) (Christchurch) хромосому [31]. Об этой аномалии сообщалось еще в 6 исследованиях, но она не обнаруживалась в более поздних цитогенетических

31 работах. Прошло почти десятилетие до того времени, когда были описаны методы дифференциальной окраски хромосом [32] и почти два десятилетия до разработки надежных методов гибридизации in situ (FISH). Этот метод стал важной технологией для. определения хромосомных аномалий, отражающих нарушения генов. Хромосомы 11, 12, 13 и 17 представляли особый интерес. Гематологи обращали большое внимание на аберрации 17-ой хромосомы, где расположен ген р53 (влияет на регуляцию апоптоза), так как нормальная функция этого гена важна для ответа на химиотерапию.

В 1984 году [33] была клонирована точка хромосомного разрыва (breakpoint) В-лимфоцитов ХЛЛ несущих t(ll;14)(ql3;q32). Место разрыва* было в JH-гене локуса иммуноглобулина на хромосоме 14. Синтезирован зонд (проба), специфичный для фрагментов хромосом 11 и 14, который располагается в месте разрыва. Проба детектировала реаранжировку гомологичного геномного фрагмента ДНК в клетках ХЛЛ и в ДНК из диффузной крупноклеточной лимфомы с транслокацией t(ll;14). Эта перестроенная область ДНК не присутствовала в клетках Лимфомы Беркитта с транслокацией t(8;14) или неопухолевых человеческих лимфобластных клетках. Этот зонд использовался для идентификации и описания гена,, расположенного на llql3 вовлеченного в малигнизацию В-клеток в транслокацию t(ll;14). В 1984 году японские исследователи [33] упомянули этот ген как ВСЫ. В 2 различных случаях В-ХЛЛ эти же авторы позднее [34] нашли, что место разрыва (breakpoint) 11 и 14 хромосом составляет по 8 нуклеотидов на каждой хромосоме и на хромосоме 14 вовлекается J4 сегмент тяжелой цепи иммуноглобулина. Поскольку они обнаружили последовательность 7mer-9mer с спейсером 12 оснований в длину на нормальной хромосоме 11, близко к месту разрыва^ они решили, что хромосомная транслокация t(ll;14) при ХЛЛ может быть сиквенс-специфична и затрагивает систему рекомбинации для формирования комплекса VH-D-Щ' сегментов гена иммуноглобулина.

Наиболее часто делеция геномной ДНК при ХЛЛ происходит на хромосоме 13ql4. Эта делеция встречается в 50% случаев и ассоциируется с длительным интервалом между постановкой диагноза и началом лечения, так называемом интервале без лечения- [35; 36].

Возникновение ХЛЛ может быть связано с повышенной экспрессией гена BCL2 на хромосоме 18q21.3, который входит, в^ каскад реакций апоптоза В-лимфоцитов. Однако транслокации, связанные с BCL-2 [t(14;18)(q32;q21)] и BCL-3 [t(14;19)(q32;ql3.1)], выявляются лишь в 5-10% случаев. Кроме того, повышенная экспрессия гена BCL-2 представлена в более чем 70% случаев, даже в присутствии хромосомной реаранжировки.

В¹1980 году группа ученых [37] обнаружила увеличение частоты ХЛЛ и аутоиммунных заболеваний в семьях пациентов с ХЛЛ. Они сделали вывод, что существуют какие-то генетические факторы в этих случаях, которые мешают регуляции иммунной системы. Однако позднее была использована Шведская база данных семейного рака (the Swedish Family Cancer Database) для проверки увеличения семейного риска ХЛЛ и других лимф.ом [38]. Показано, что у родственников больных значительно повышен риск ХЛЛ (относительный риск (relative risk, RR) = 7.52), для Неходжкинских лимфом (RR = 1.45), и для лимфомы Ходжкина (RR = 2.35). Риск возникновения ХЛЛ одинаков для всех типов родственников и не зависит от возраста в момент диагноза [38].

В обзоре по молекулярной диагностике гемобластозов в 2003 году отмечалось, что различия вариантов ХЛЛ на основе мутаций гена иммуноглобулина предполагает существование двух разных заболеваний [39]. Присутствие соматических мутаций в генах иммуноглобулинов в В-клетках определяет группу больных со стабильной или медленно прогрессирующей болезнью, нуждающихся в позднем лечении или его отсутствии. И наоборот, отсутствие мутаций гена иммуноглобулина в клетках ХЛЛ определяет группу пациентов, которые имели прогрессивное клиническое течение, требующее

33 раннего лечения. Эти два типа ХЛЛ могут также отличаться относительно онкогенных механизмов, так как делеция локуса ATM на хромосоме llq ассоциирована с отсутствием мутаций гена иммуноглобулина в клетках ХЛЛ и низкой выживаемостью некоторых пациентов [39].

Тот факт, что приблизительно 50% известных микроРНК человека расположено в районах генома, ассоциированных с раком [40] указывает на роль микроРНК в патогенезе различных опухолей человека. Для идентификации двух членов класса микро-РНК - miR15A и miR16-l, которые локализуются в самом маленьком регионе делеции в 13ql4 и чаще всего делегированы или супрессированы в клетках ХЛЛ, применялось позиционное клонирование [41]. В 2005 году группа ученых [36] обнаружила уникальный профиль экспрессии микроРНК, состоящий из 13 генов которые дифференцировали группы IgVHmut- от случаев IgVHmut+ и случаи ХЛЛ с низким уровнем экспрессии гена ZAP-70 от случаев с высоким уровнем. Этот профиль микроРНК был ассоциирован с присутствием или отсутствием прогрессии болезни. Они также идентифицировали терминальную мутацию в предшественнике miR16-l/miR15A, которая была причиной низкого уровня транскрипции микроРНК in vitro и in vivo и ассоциировалась с делецией нормальной аллели. Терминальные или соматические мутации были найдены в 5 из 42 секвенированных микроРНК у 11 из 75 пациентов с ХЛЛ, но подобные мутации не были найдены в 160 случаях здоровых доноров (р < 0.001). Первые 9 нуклеотидов miR15A и miR16-l комплементарны основаниям центрального региона кДНК гена BCL2 [42]. С помощью микроРНК чипа и Вестерн-анализа CD5+ лимфоцитов 4 здоровых доноров и образцов крови 26 больных В-ХЛЛ показано, что низкий уровень miR15A и miR16-l и высокий уровень белка BCL2, коррелируют с заболеванием. Повышенная экспрессия какой-либо микроРНК не влияет на стабильность мРНК BCL2, но регулирует экспрессию BCL2 на посттранскрипционном уровне [42].

В последние годы в исследовательскую практику интенсивно входят методы одновременной оценки уровня транскрипции большого количества генов с помощью микрочипов. В области онкологии эти методы были впервые применены именно для изучения лимфатических опухолей. Эти эксперименты принесли множество открытий и позволили накопить сведения о довольно большой группе генов, транскрибирующихся по-разному в прогностически разных вариантах гемобластозов.

Так, в 2000 году [30] использован биологический чип для идентификации генов, транскрипция* которых возрастает при воздействии флударабином (основной препарат в лечении В-ХЛЛ). Анализ был выполнен с помощью чипа, содержащего только гены, связанные с апоптозом. В 2001 году [43] исследованы 54 больных В-ХЛЛ с помощью микрочипа содержащего 1024 гена. Тогда удалось идентифицировать несколько генов, уровень мРНК которых ассоциировался* со стадией заболевания. Только один из этих генов исследован альтернативным методом у 2 пациентов. Наконец, в двух исследованиях с микрочипами ' изучена транскрипция генов в близком к геномному масштабе для поиска характера генетического дефекта В-ХЛЛ. Обе группы использовали микрочипы для разделения вариантов болезни и идентификации генов, различающих нормальные лимфоциты и клетки В-ХЛЛ.

Одна группа ученых [44] сделала заключение, что по профилю транскрипции В-ХЛЛ ближе к клеткам памяти, чем к другим клеткам, а другие исследователи [45] что вариант В-ХЛЛ без мутаций вариабельного региона ближе к активированным клеткам, чем к клеткам покоя. В обоих работах идентифицирован ряд перспективных генов, уровень мРНК которых снижен или повышен при разных вариантах В-ХЛЛ. Однако опытов по проверке этих результатов альтернативными методами не проводилось. Кроме того, список генов, полученный разными группами, существенно различается. Это может отражать разный состав генов на микрочипе, или погрешности технологии. Списки генов по которым получены различия в экспериментах с микрочипами

35 пересекаются лишь отчасти. Среди них выделяется повышенная транскрипция ZAP-70 [44; 46; 47], липопротеинлипазы (LPL), BCL-7a, дистрофина и АКАР12 (gravin) наблюдаемая в агрессивных вариантах ХЛЛ с немутированным иммуноглобулином [44;45]; в то время как в вялотекущих случаях IgVHmut+

) наблюдается повышенная транскрипция Wnt-3, CTLA-4, NRIP1, ADAM и

транскрипционного фактора TCF7.

, Одним из генов, транскрипция которых достоверно различается при

вариантах В-ХЛЛ с разным мутационным статусом, оказался ген ZAP-70. При варианте В-ХЛЛ без мутаций вариабельного региона иммуноглобулина уровень мРНК гена ZAP-70 по разным данным в 4.3 [48] - 5.5 [46] раз выше, чем при В-ХЛЛ с мутациями. Все опыты проводились на селектированных В-лимфоцитах. Проводились исследования экспрессии гена ZAP-70 [49], которая могла бы помочь установить мутационный статус генов, вариабельного региона иммуноглобулинов. Показано, что экспрессия этого гена, различает эти два подтипа с точностью 93% [46, 50]. Если ZAP-70 экспрессируется*

і клетками В-ХЛЛ, то прогноз неблагоприятен, если нет, то прогноз?

благоприятен. Таким образом, исследование экспрессии гена протеин тирозин киназы может успешно применяться в клинической практике [47]. Поскольку моноклональное антитело к ZAP-70 существует, довольно быстро были разработаны тесты, позволяющие оценивать экспрессию ZAP-70 с помощью проточной цитофлуориметрии. Однако иммуногистохимическое исследование костного мозга антителом к ZAP-70 не надежно, поскольку ZAP-70 сильно экспрессируется в Т-клетках, а примесь которых в костном мозге больных В-ХЛЛ может быть велика. По этой же причине не надежна оценка уроня мРНК гена ZAP-70, выделенной из мононуклеаров крови* методами полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) или количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ): такая оценка требует предварительной' селекции В-лимфоцитов. В настоящее время, в клинической практике для

36 оценки ZAP-70 и долгосрочного прогноза у больных В-ХЛЛ используется проточная цитофлуориметрия.

Несмотря на клинические и молекулярно-биологические различия двух вариантов В-ХЛЛ, показано, что заболевание характеризуется общим профилем транскрипции генов. Этот профиль не зависит от мутационного статуса генов иммуноглобулинов и отличается от профиля других лимфом и нормальных лимфоидных клеток. То есть все случаи В-ХЛЛ имеют схожий механизм происхождения и/или клетку-предшественницу [44; 45]. Это предположение согласуется с характерной стабильной пониженной экспрессией гена BCR при В-ХЛЛ. Таким образом, вялотекущий вариант IgVHmut+ и агрессивный IgVHmut- являются двумя вариантами одной болезни. Значительные различия клинической картины этих двух вариантов остаются пока еще необъясненными. Все еще неясно, соответствуют ли варианты заболевания стадиям дифференциации в момент злокачественной трансформации или форма IgVHmut- является более активированной, поддерживающей пролиферативный потенциал опухолевого клона. Возможно, варианты В-ХЛЛ возникают из разных субпопуляций В-лимфоцитов -наивных В-клеток и В-клеток памяти. Однако эксперименты с микрочипами показали, что это не так.

В настоящее время большинство онкогематологов принимает решение о начале лечения больных В-ХЛЛ, основываясь на клинической (классической) системе стадий Rai, и частично новых молекулярных прогностических факторах. Наиболее важными прогностическими маркерами являются: стадии по Rai, мутационный статус IgVH, FISH, статус Zap-70 и CD38. Иерархия прогноза, обозначенного каждым фактором следующая:

Стадии по Rai: IV < Ш< П< К О

Мутационный статус IgVH: немутированный, мутированный

FISH: делеция 17р13 или делеция llq22-23 или трисомия 12, делеция 13ql4

37 Статус Zap-70: присутствует, отсутствует Статус CD38: положительный, отрицательный

Деления 17р13 приводит к потере онкосупрессорного гена р53, а делеция llq22-23 - к потере онкосупрессорного гена ATM. Прогноз для случаев IgVHmut- гораздо хуже, чем для случаев IgVHmut+. Определение мутационного статуса для практических онкологов является очень трудоемкой, если не невозможной задачей. Косвенные маркеры мутационного статуса* IgVH; такие как CD38 и ZAP-70, облегчили диагностику и подбор лечения. CD-38 является белковым антигеном расположенным на поверхности лейкемической клетки. Присутствие CD-38 предполагает более быструю прогрессию, но все еще полностью не понятна роль маркера CD-38 при В-ХЛЛ.

Существуют единичные центры в мире, в которых больным В-ХЛЛ выполняется цитогенетический анализ и мутационный статус иммуноглобулинов. Анализ с помощью микрочипов еще более трудоемок, дорог и не всегда надежен для прогнозирования течения В-ХЛЛ1 В связи с этим выборочная оценка наиболее значимых генов методом ПЦР в реальном времени при адекватных контролях актуальна как с теоретической точки-зрения, так и для создания диагностической тест-системы диагноза и прогноза В-ХЛЛ.

2.6 Особенности метода ПЦР в реальном времени

Наряду с классическими цитогенетическими, цитохимическими и. иммунофенотипическими методами, все шире используются новые молекулярно-биологические технологии: амплификация нуклеиновых кислот (ПЦР, ЛЦР), секвенирование ДНК и гибридизация ДНК на микрочипах [51; 52; 53; 54; 55]. Новые подходы позволяют одновременно сравнивать тысячи генов - потенциальных онкомаркеров, отбирать наиболее важные из них с тем, чтобы

38 использовать для диагностики, оценки эффективности проводимой терапии и прогноза развития рецидивов заболевания. В решении этих задач метод ІЩР в реальном-времени (ПЦР-РВ) имеет то преимущество, что позволяет выявить и определить абсолютное количество исследуемых ДНК-мишеней непосредственно в экспериментальных образцах [56; 57]. Компьютерный анализ, отсутствие постамплификационных манипуляций, стандартизация результатов, позволяют исключить субъективизм при их интерпретации, свести к минимуму риск загрязнения и связанных с ней ложноположительных результатов ПЦР, упростить и ускорить процедуру генодиагностики [58]. Чувствительность метода ПЦР-РВ позволяет обнаружить одну измененную' клетку среди 10⁴ - 10⁵ нормальных, что, в среднем, в 10 раз превышает чувствительность используемых в настоящее время других методов-(иммунофенотипирования, ПЦР, ОТ-ПЦР) [59; 60].

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ; количественная ПЦР, Real Time PCR) в настоящее время широко используется для детекции и оценки уровня транскрипции генов. Эта технология явилась прорывом в определении копийности ДНК и мутационного анализа, стала важным методом в генетических исследованиях и диагностике благодаря высокой чувствительности и специфичности.

В настоящее время ПЦР в реальном времени применяется для:

Контроля экспериментов на микрочипах.

Количественного анализа вирусов. Детекции патогенов.

Мониторинга минимальной остаточной болезни.

Определения поврежденности ДНК (микросателлитная нестабильность).

Исследования митохондриальной ДНК.
в Определения дозы гена и зиготности.

о Мониторинга эффективности лекарственной терапии. Пренатальной диагностики, определения пола.

39 Гаплотипирования. Определения трисомий и копийности генов и др.

Система ГЩР-РВ основана на детекции и определении количества флуоресцентного репортерного красителя. Этот сигнал возрастает прямо пропорционально количеству ПЦР-продукта в реакции. Благодаря записи интенсивности флуоресцентного сигнала после каждого цикла возможен мониторинг ПНР во время экспоненциальной фазы, когда первое заметное увеличение количества ПЦР-продукта, коррелирует с исходным содержанием матрицы. Чем больше стартовое количество копий ДНК-матрицы, тем раньше и значительнее наблюдается увеличение флуоресцентного сигнала.

Химические процессы в основе количественного анализа

Используется два различных химических процесса (способа генерации репортерной флуоресценции) - это: Применение интеркалируюших красителей, флуоресценция которых

значительно возрастает при связывании с двуцепочечной ДНК. о Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных

проб, комплементарных участку ПЦР-продукта (зонды TaqMan).

Первым из возможных вариантов является использование интеркалирующего красителя SYBR Green. Он связывается с двойной спиралью ДНК, что позволяет детектировать накапливающиеся в процессе ПЦР ампликоны. Анализом с использованием SYBR Green определяются все двухцепочечные ДНК, включая неспецифические продукты реакции. Поэтому для точного количественного анализа исключительно важна оптимизация условий реакции. Преимуществом методики SYBR Green является отсутствие зондов, что уменьшает его стоимость. Использование этого метода оправдано только для широкого предварительного скрининга и детекции патогенов.

В основе флуоресцентного анализа 5' нуклеаз, или анализа TaqMan лежит использование флуоресцентных зондов, позволяющих детектировать определенный продукт ПЦР по мере его накопления в ходе реакции. В реакционную смесь помимо обычных праймеров входит олигонуклеотидный TaqMan-зонд (проба) (Рис. 1). TaqMan-зонды это более длинные чем праймеры олигонуклеотиды с температурой отжига (Тт) 70С. На 5'- конце проба помечена флуоресцентным красителем-репортером (reporter dye), а на 3'- конце - тушителем (quencher dye). Спектр и эмиссия последнего перекрывают спектр и эмиссию репортера, приводя к блокированию флуоресцентного сигнала. По мере накопления продукта ПЦР, проба гибридизуется к нему, однако свечения не происходит из-за близости между репортером и тушителем. По мере копирования последовательности, к которой присоединена проба, ДНК полимеразой, полимераза достигает 5'-конца пробы. 5'-3' экзонуклеазная активность полимеразы отсоединяет флуоресцентную метку с 5'- конца пробы, тем самым, отдаляя флуоресцирующий репортер от тушителя, что и приводит к увеличению флуоресценции. Ее уровень пропорционален количеству специфичного продукта реакции. Гидролиз TaqMan зонда зависит от 5'-3' нуклеазной активности Taq ДНК-полимеразы. ДНК-проба, меченая репортерным

41 красителем и гасителем на противоположных концах гибридизуется с ампликоном. Наиболее часто используемыми репортерным красителем и гасителем являются FAM (6-карбоксифлуоресцин) и TAMRA (6-карбокси-тетраметил-родамин). Основными преимуществами зондов TaqMan являются высокая специфичность и чувствительность.

Рисунок 5. Три фазы ПЦР:

1. Геометрическая фаза. Экспоненциальный рост приводит к удвоению продукта за каждый цикл (эффективность амплификации приближается к 100%). Наиболее точная фаза амплификации.

2. Линейная фаза (высокая вариабельность). Один или более компонентов реакции становятся лимитирующими и продукт накапливается в арифметической прогрессии.

3. Фаза плато (окончание реакции).

При использовании зондов TaqMan, флуоресцентный сигнал увеличивается прямо пропорционально количеству специфического ампликона. Зависимость нормированного сигнала репортерной группы (RJ от номера цикла в процессе ПЦР имеет три участка (Рис. 5). Сначала зависимость представляет собой прямую с нулевым значением, поскольку величина флуоресцентного сигнала меньше предела определения. На втором участке

42 сигнал может быть детектирован по мере его увеличения прямо пропорционально увеличению продукта ПЦР. По мере увеличения количества ампликонов отношение содержания ДНК полимеразы к количеству продукта

ПЦР уменьшается. При достижении концентрации матрицы в ЮМ, экспоненциальное увеличение продукта ПЦР прекращается. В этот момент начинается третий участок изменения величины R^, который является практически линейным и достигает плато при концентрации матрицы

примерно ЮМ.

Способы определения базового уровня флуоресценции (baseline)

Базовый уровень флуоресценции - это тот уровень флуоресценции, который наблюдается в реакционной смеси до появления репортерного сигнала (рис. 6, обозначен красной стрелкой). В общем случае, базовую линию следует выбирать как среднее значение флуоресценции в достаточно широком диапазоне циклов до появления репортерной флуоресценции (т.е. до начала детекции экспоненциальной фазы). При выборе диапазона желательно также избегать и циклы вне экспоненциальной фазы, в которых наблюдаются скачки флуоресценции.

Более осторожно нужно выбирать базовую линию при использовании метода TaqMan, поскольку к началу ПЦР в смеси может наблюдаться довольно высокий уровень флуоресценции от деградированных проб (в которых произошла диссоциация маркера от тушителя). Если деградированные пробы не превалируют, это не представляет большой опасности, и базовая флуоресценция постепенно сходит на нет (обычно к 3-7 циклу). В таком случае начальным циклом диапазона выбирают тот, в котором флуоресценция от деградированных проб уже достигла минимума.

В некоторых случаях флуоресценция от деградированных проб наблюдается и на более поздних стадиях ПЦР, к 20-25 циклу. Такой эффект нежелателен, поскольку он создает трудности при выборе базовой линии.

_Rn

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 19 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 X 31 32 33 34 35 ЗБ 37 36 39 40

Циклы

Рисунок 6. Схема и основные параметры кинетической кривой ПЦР-РВ.

Выбор уровня пороговой флуоресценции (threshold)

За пороговый уровень выбирают минимальный уровень флуоресценции, который во всех проведенных с данной парой праимеров реакциях соответствует началу экспоненциальной фазы (рис. 6). Хотя пороговый уровень должен быть как можно ниже, при его достижении реакция должна быть стабильна - на первом цикле экспоненциальной фазы погрешность определения репортерной флуоресценции обычно достаточно высока (в том числе и из-за того, что выбор базовой линии также имеет определенную погрешность). Обычно оптимальными являются пороговые уровни порядка 0.05-0.1 единиц флуоресценции. Выбор порога по превышению над стандартным отклонением кинетической кривой - это установка порога таким образом, чтобы превышение порогового уровня над базовым было достаточно

44 малым, но уже статистически достоверным. Обычно выбирают значения в диапазоне 8-10 стандартных отклонений. Недостатком такого метода является то, что в каких-то конкретных случаях порог может оказаться слишком низким или, наоборот, слишком высоким, поскольку стандартное отклонение -это усредненная величина по всей кинетической кривой.

Этих недостатков, лишен метод выбора порогового уровня по второй производной кинетической кривой. К сожалению, он реализован далеко не во всех управляющих программах. Из всех скачков флуоресценции за пороговый уровень.выбирается наиболее резкий скачок - абсолютный максимум второй' производной*. Этот способ, наименее чувствителен к способу выбора базовой линии и различиям условий реакции.

Широко используется установка порогового уровня вручную. Она является корректной, при условии, что базовая линия выбрана одинаково и измерения проводятся одновременно. Этим методом можно пользоваться, когда необходимо сравнить данные в одном реакционном планшете (или, в. крайнем случае, нескольких опытов, выполненных с использованием одинаковых реактивов, субстратов, на одном и том же приборе с небольшим промежутком времени) - например, при отладке реакции. При сравнении' более разнородных данных установка порогового уровня вручную будет некорректным.

Оценку качества реакции проводят по следующим параметрам: форме кинетической кривой ГЩР-РВ,

специфичности амплификации, определяемой из кривой плавления (для SYBR Green),

достоверности околичествления,

эффективности амплификации.

45 Вычисление порогового цикла

На начальных циклах количественной полимеразной цепной реакции флуоресценция очень слабая и мало изменяется. Этот уровень свечения называется базовым. Показателем накопления продукта реакции является так называемый* "пороговый цикл" (Ct, threshold¹ cycle), то есть цикл, на котором интенсивность флуоресценции начинает превышать базовый порог (рис. 6). Чем меньше номер цикла, с которого начинается амплификация продукта, тем выше количество искомой матрицы.

Пороговый цикл (Ct) для данной кривой амплификации является циклом, в котором флуоресцентный сигнал возрастает выше уровня заданной величины порогового значения. Величина Ct зависит от двух факторов: исходного количества копий матрицы и эффективности амплификации ДНК в процессе ПЦР.

Экспоненциальная стадия ПЦР описывается уравнением:

Рп = Р0*Еп (1),

где Рп - количество молекул ампликона, коррелирующее с репортерной флуоресценцией к циклу п,

РО - исходное количество молекул матрицы, содержащих амшшфицируемый фрагмент (template),

Е - эффективность амплификации. В идеальных условиях Е = 2, т.е. на каждом цикле цепной реакции происходит удвоение количества продукта.

Прологарифмируем обе части уравнения 1 и преобразуем его к виду:

n = -(l/logE)*logPO + logPr^logE (2)

Назовем пороговым циклом (threshold cycle, C(t)) такой цикл п, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции -пороговая флуоресценция PC(t)=const. Для n=C(t) уравнение 2 принимает вид:

C(t) = - (lflog Е) * log РО + log PC(t)/log Е (3)

Т.е. значение C(t) прямо пропорционально логарифму количества субстрата. Таким образом, ГЩР в реальном времени позволяет сравнивать количества субстрата' при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

Вытекающая из^ уравнения 1 зависимость (3) позволяет сравнивать результаты различных опытов лишь при условии, что PC(t)= const. Таким* образом, уровень пороговой флуоресценции PC(t) должен быть одинаков для всех сравниваемых образцов.

Репортерная флуоресценция наиболее точно отвечает зависимости 3< в самом начале детекции экспоненциальной фазы. На более поздних этапах вклад стохастических эффектов в кинетику реакции становится все более значительным. Поэтому пороговый уровень флуоресценции выбирают в самом начале экспоненциальной фазы, когда стохастические процессы не столь велики.

Определение эффективности амплификации

Эффективность реакции можно рассчитать как

E=10-^I/k-l,

где к берется из уравнения прямой C(t) = к-log РО + Ь, полученного путем линейной аппроксимации экспериментальных данных. При Е = 2 (максимально теоретически возможном значении) k ~ -3.32.

Значения к < -3.32 соответствуют более низкой эффективности реакции.
Желательно добиваться- таких условий реакции, в которых эффективность
амплификации составляет, по меньшей мере, 1.7 - 1.8 (к не меньше -4 4.2).-

С другой стороны, иногда к оказывается больше, чем -3.32, что соответствует теоретически невозможной ситуации Е > 2. Небольшое превышение (-3.32 < к < -2.8) наблюдается относительно часто и может быть отнесено на счет погрешности измерений.

47 На эффективность ПЦР влияет множество факторов: длина ампликона, вторичная структура и качество праймеров и т.д. Для того чтобы наклон* кривой был адекватным индикатором ПЦР (а не дрейфа сигнала), должна быть точка сгиба. Это точка на кривой роста, где начинается линейная фаза; Дрейф> сигнала характеризуется постепенным' увеличением или уменьшением флуоресценции без амплификации продукта. Важный параметр для расчета? количества — пороговый цикл. Чем выше; начальное количество ДНК, тем скорее накапливается продукт, регистрируемый ві процессе ПЦР, и< ниже значение Ct. Порог должен, быть помещен выше любой активности базовош линии в пределах фазы экспоненциального роста (который выглядит линейно* bv логарифмическом преобразовании). Значение Ct = 40^ и более означает отсутствие амплификации, такое значение не может быть включено* вї вычисления.

Принципы обработки данных 11ЦР-РВ.

Существует два основных принципа обработки данных Real-time PCR:

Прямое сравнение данных (Относительный анализ).

Метод калибровочного графика (Абсолютный анализ).

Прямое сравнение данных

Управляющая; программа прибора ABI Prism 7000 Sequence Detection System позволяет получать относительные количества анализируемых образцов на основании числа циклов, необходимых для достижения минимальных регистрируемых величин флуоресцентного сигнала. Этот метод позволяет проводить прямое сравнение данных с референтным контролем! (нормализатором). Динамический диапазон, изменения концентраций целевого и контрольного генов должен быть одинаков. В общем виде, на основании* разницы порогового цикла этих двух генов, программное обеспечение выдает результат в виде превышения или понижения содержания целевого гена

48 относительно контрольного. Метод обладает рядом недостатков, в частности необходимостью тщательной оптимизации реакции.

Метод калибровочного графика

Целью абсолютного количественного анализа является точное определение абсолютного количества одной мишени-последовательности нуклеиновой кислоты' в неизвестном образце. Этот метод предполагает построение калибровочного графика- в координатах C(t) - log' РО с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (РО) в экспериментальных образцах (рис. 7, 8).

Стандарты и неизвестные образцы разбавляются в несколько десятков раз и помещаются в. оптический реакционный планшет, содержащий реакционную смесь и реагентьгдля методики TaqMan, предназначенные для* определенной мишени-последовательности нуклеиновой кислоты. В процессе опыта прибор регистрирует интенсивность флуоресценции, которая связана с расщеплением зондов TaqMan в присутствии последовательности-мишени. После завершения опыта программное обеспечение обрабатывает полученные данные флуоресценции для вычисления значений порогового цикла (Ct) для каждого образца. Программа рассчитывает калибровочную кривую по величинам ^разбавленных стандартов и определяет абсолютные количества для неизвестных образцов по их величинам Ct и калибровочной кривой (рис. 8).

Рисунок 7. Схема абсолютного анализа с построением калибровочного графика (стандартной кривой) из серии разведений стандарта.

Для количественного выражения уровня транскрипции интересующего гена в пробах, которые были нормализованы по эндогенному контролю, стандартные кривые строятся как для искомого гена, так и для эндогенного контроля.

неизвестный образец

Я -г

к»?

100CG

моко

(logN) начальная концентрация

Рисунок 8. Определение количества неизвестного образца по стандартной кривой.

Точность метода зависит от того, насколько условия ПЦР (и, прежде всего, эффективность амплификации) серии стандартов близки к условиям

50 ПЦР экспериментальных образцов. Поэтому при выборе стандартов необходимо руководствоваться следующими правилами:

Организация и перестройка генов вариабельного региона иммуноглобулинов. Формирование В-клеточного репертуара

Иммуноглобулин состоит из четырех полипептидов: двух идентичных тяжелых и двух идентичных легких цепей, которые соединены между собой дисульфитными связями. Белки тяжелых и легких цепей кодируются независимо. Крайние домены одной легкой цепи и одной тяжелой цепи соединены вместе и формируют антиген-связывающий участок. Поэтому каждая молекула иммуноглобулина (Ig) содержит два антиген-связывающих участка. В каждом антителе N-концевые домены тяжелых и легких цепей устроены по-разному. Поэтому эти участки называются вариабельными. Другие домены молекулы иммуноглобулина консервативны и поэтому названы константными. Вариабельные и константные участки тяжелых и легких цепей кодируются независимо друг от друга.

Гены иммуноглобулинов существуют в нескольких локусах: локус каппа-цепи (2р 11), локус лямбда-цепи (22qll) и локус тяжелой цепи (14q32). Локусы всех генов иммуноглобулинов организованы однотипно. Имеется множество вариабельных генов (V, variable) и всего несколько генов, кодирующих константный регион (С, constant). Между V и С-генами располагается еще небольшое количество соединительных сегментов (J, joining). В локусе тяжелой цепи (Н), помимо V, J и С сегментов имеются еще и D-сегменты, названные так потому, что они вносят дополнительное разнообразие (D, diversity) в участок, кодирующий вариабельную область иммуноглобулина. Перед каждым V-геном имеется короткая лидерная последовательность, отделенная интроном.

Перестройка генов тяжелой цепи иммуноглобулинов проходит в несколько этапов. На первом этапе любой из DH-сегментов соединяется с любым из JH-сегментов (неполная перестройка). Далее новообразованный DH-JH сегмент соединяется с каким-либо VH-сегментом (полная перестройка). Образовавшийся сегмент VH-D-JH кодирует полный вариабельный регион тяжелой цепи. К этому этапу перестроенный участок состоит из короткой лидерной последовательности, короткого интрона, сегмента VH-D-JH, интрона и С-сегментов. Перед С-сегментами могут лежать несколько JH-сегментов. Перед лидерной последовательностью на 5 -конце гена находится последовательность промотора. РНК-полимераза связывается с ней после того, как VH-D-JH-перестройка полностью завершена. Далее вся последовательность, начиная с лидера транскрибируется в матричную РНК. Первичный транскрипт мРНК содержит последовательность лидера, интрон, участок VH-D-JH, интрон, сегменты Сц, С5. Изотип иммуноглобулина (M/D, G, А) определяется в ходе процессинга РНК по механизму альтернативного сплайсинга. На этом же уровне происходит образование мембранной и секретируемой формы иммуноглобулинов. После процессинга мРНК иммуноглобулина содержит последовательность лидер-VH-D-JH-C и транслируется в белок. Модификация белка состоит в удалении лидерной последовательности.

Процесс рекомбинации происходит с участием нескольких ферментов, формирующих рекомбиназный комплекс (RAG1, RAG2, TdT, ДНК-лигаза IV, ДНК-зависимая протеинкиназа) и направляется определенными последовательностями ДНК, лежащими между VH, D и JH-генами. Этих последовательностей две: нонамер 5 -АСАААААСС-3 и гептамер 5 -CACAGTG-3 . Гептамер всегда примыкает к кодирующей последовательности VH, D или JH-генов. Нонамер располагается на удалении от гептамера. Расстояние между ними консервативно и приблизительно равно 12 или 23 нуклеотидам, что составляет одну или две петли ДНК. Благодаря этому нонамер и гептамер оказываются в ходе перестроек на одной стороне петли ДНК и формируют последовательность, распознаваемую рекомбиназным комплексом. Процесс рекомбинации подчиняется правилу 12/23: соединение происходит только между сегментами, отделенными разным числом нуклеотидов - 12 и 23. Сегменты, отделенные участками равной длины (например, 12 и 12 или 23 и 23) не соединяются. В генах тяжелой цепи гептамеры V и J-сегментов отделены от нонамеров 23 нуклеотидами, а в D-сегментах — двенадцатью. Поэтому V-сегмент не может соединиться с J-сегментом. Сначала происходит соединение D-JH, а затем VH-D-JH.

Гены иммуноглобулинов перестраиваются только в лимфоидных клетках. Во всех других соматических и половых клетках они не изменены. Состояние генов иммуноглобулинов в нелимфоидных клетках называется терминальным (germline configuration).

Помимо 14 хромосомы небольшое число VH-сегментов было обнаружено на 15 и 16 хромосомах [14]. Однако только на 14 хромосоме располагаются J-сегменты, необходимые для процесса рекомбинации. Экспрессия VH-сегментов на 15 и 16 хромосомах требует межхромосомной рекомбинации. В настоящее время нет данных, что эти сегменты используются в репертуаре В-лимфоцитов. Локус тяжелой цепи на 14 хромосоме занимает 2.5 — 3 МБ и нуклеотидная последовательность этого региона полностью определена. В локусе тяжелой цепи 25 D-сегментов и 6 JH-сегментов. С-генов, 10: Сц, С5, СуЗ, Cyl, СЕ\/, Cotl, Су2, Су4, Cs и Ссс2.

Изучение молекулярных маркеров при В-клеточном хроническом лимфолейкозе

В ранние дни клинической цитогенетики, в 1962 году, была описана хромосомная аномалия при ХЛЛ, затрагивающая маленькую акроцентрическую хромосому, возможно 21, авторы назвали ее как Ch(l) (Christchurch) хромосому [31]. Об этой аномалии сообщалось еще в 6 исследованиях, но она не обнаруживалась в более поздних цитогенетических работах. Прошло почти десятилетие до того времени, когда были описаны методы дифференциальной окраски хромосом [32] и почти два десятилетия до разработки надежных методов гибридизации in situ (FISH). Этот метод стал важной технологией для. определения хромосомных аномалий, отражающих нарушения генов. Хромосомы 11, 12, 13 и 17 представляли особый интерес. Гематологи обращали большое внимание на аберрации 17-ой хромосомы, где расположен ген р53 (влияет на регуляцию апоптоза), так как нормальная функция этого гена важна для ответа на химиотерапию.

В 1984 году [33] была клонирована точка хромосомного разрыва (breakpoint) В-лимфоцитов ХЛЛ несущих t(ll;14)(ql3;q32). Место разрыва было в JH-гене локуса иммуноглобулина на хромосоме 14. Синтезирован зонд (проба), специфичный для фрагментов хромосом 11 и 14, который располагается в месте разрыва. Проба детектировала реаранжировку гомологичного геномного фрагмента ДНК в клетках ХЛЛ и в ДНК из диффузной крупноклеточной лимфомы с транслокацией t(ll;14). Эта перестроенная область ДНК не присутствовала в клетках Лимфомы Беркитта с транслокацией t(8;14) или неопухолевых человеческих лимфобластных клетках. Этот зонд использовался для идентификации и описания гена,, расположенного на llql3 вовлеченного в малигнизацию В-клеток в транслокацию t(ll;14). В 1984 году японские исследователи [33] упомянули этот ген как ВСЫ. В 2 различных случаях В-ХЛЛ эти же авторы позднее [34] нашли, что место разрыва (breakpoint) 11 и 14 хромосом составляет по 8 нуклеотидов на каждой хромосоме и на хромосоме 14 вовлекается J4 сегмент тяжелой цепи иммуноглобулина. Поскольку они обнаружили последовательность 7mer-9mer с спейсером 12 оснований в длину на нормальной хромосоме 11, близко к месту разрыва они решили, что хромосомная транслокация t(ll;14) при ХЛЛ может быть сиквенс-специфична и затрагивает систему рекомбинации для формирования комплекса VH-D-Щ сегментов гена иммуноглобулина. Наиболее часто делеция геномной ДНК при ХЛЛ происходит на хромосоме 13ql4. Эта делеция встречается в 50% случаев и ассоциируется с длительным интервалом между постановкой диагноза и началом лечения, так называемом интервале без лечения- [35; 36].

Возникновение ХЛЛ может быть связано с повышенной экспрессией гена BCL2 на хромосоме 18q21.3, который входит, в каскад реакций апоптоза В-лимфоцитов. Однако транслокации, связанные с BCL-2 [t(14;18)(q32;q21)] и BCL-3 [t(14;19)(q32;ql3.1)], выявляются лишь в 5-10% случаев. Кроме того, повышенная экспрессия гена BCL-2 представлена в более чем 70% случаев, даже в присутствии хромосомной реаранжировки.

В11980 году группа ученых [37] обнаружила увеличение частоты ХЛЛ и аутоиммунных заболеваний в семьях пациентов с ХЛЛ. Они сделали вывод, что существуют какие-то генетические факторы в этих случаях, которые мешают регуляции иммунной системы. Однако позднее была использована Шведская база данных семейного рака (the Swedish Family Cancer Database) для проверки увеличения семейного риска ХЛЛ и других лимф.ом [38]. Показано, что у родственников больных значительно повышен риск ХЛЛ (относительный риск (relative risk, RR) = 7.52), для Неходжкинских лимфом (RR = 1.45), и для лимфомы Ходжкина (RR = 2.35). Риск возникновения ХЛЛ одинаков для всех типов родственников и не зависит от возраста в момент диагноза [38].

В обзоре по молекулярной диагностике гемобластозов в 2003 году отмечалось, что различия вариантов ХЛЛ на основе мутаций гена иммуноглобулина предполагает существование двух разных заболеваний [39]. Присутствие соматических мутаций в генах иммуноглобулинов в В-клетках определяет группу больных со стабильной или медленно прогрессирующей болезнью, нуждающихся в позднем лечении или его отсутствии. И наоборот, отсутствие мутаций гена иммуноглобулина в клетках ХЛЛ определяет группу пациентов, которые имели прогрессивное клиническое течение, требующее раннего лечения. Эти два типа ХЛЛ могут также отличаться относительно онкогенных механизмов, так как делеция локуса ATM на хромосоме llq ассоциирована с отсутствием мутаций гена иммуноглобулина в клетках ХЛЛ и низкой выживаемостью некоторых пациентов [39].

Подготовка стандартов для абсолютного количественного анализа

На начальных циклах количественной полимеразной цепной реакции флуоресценция очень слабая и мало изменяется. Этот уровень свечения называется базовым. Показателем накопления продукта реакции является так называемый "пороговый цикл" (Ct, threshold1 cycle), то есть цикл, на котором интенсивность флуоресценции начинает превышать базовый порог (рис. 6). Чем меньше номер цикла, с которого начинается амплификация продукта, тем выше количество искомой матрицы.

Пороговый цикл (Ct) для данной кривой амплификации является циклом, в котором флуоресцентный сигнал возрастает выше уровня заданной величины порогового значения. Величина Ct зависит от двух факторов: исходного количества копий матрицы и эффективности амплификации ДНК в процессе ПЦР.

Экспоненциальная стадия ПЦР описывается уравнением: Рп = Р0 Еп (1), где Рп - количество молекул ампликона, коррелирующее с репортерной флуоресценцией к циклу п, РО - исходное количество молекул матрицы, содержащих амшшфицируемый фрагмент (template), Е - эффективность амплификации. В идеальных условиях Е = 2, т.е. на каждом цикле цепной реакции происходит удвоение количества продукта. Прологарифмируем обе части уравнения 1 и преобразуем его к виду: n = -(l/logE) logPO + logPr logE (2)

Назовем пороговым циклом (threshold cycle, C(t)) такой цикл п, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции -пороговая флуоресценция PC(t)=const. Для n=C(t) уравнение 2 принимает вид: C(t) = - (lflog Е) log РО + log PC(t)/log Е (3) Т.е. значение C(t) прямо пропорционально логарифму количества субстрата. Таким образом, ГЩР в реальном времени позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

Вытекающая из уравнения 1 зависимость (3) позволяет сравнивать результаты различных опытов лишь при условии, что PC(t)= const. Таким образом, уровень пороговой флуоресценции PC(t) должен быть одинаков для всех сравниваемых образцов.

Репортерная флуоресценция наиболее точно отвечает зависимости 3 в самом начале детекции экспоненциальной фазы. На более поздних этапах вклад стохастических эффектов в кинетику реакции становится все более значительным. Поэтому пороговый уровень флуоресценции выбирают в самом начале экспоненциальной фазы, когда стохастические процессы не столь велики.

Определение эффективности амплификации Эффективность реакции можно рассчитать как E=10-I/k-l, где к берется из уравнения прямой C(t) = к-log РО + Ь, полученного путем линейной аппроксимации экспериментальных данных. При Е = 2 (максимально теоретически возможном значении) k -3.32.

Значения к -3.32 соответствуют более низкой эффективности реакции. Желательно добиваться- таких условий реакции, в которых эффективность амплификации составляет, по меньшей мере, 1.7 - 1.8 (к не меньше -4 4.2). С другой стороны, иногда к оказывается больше, чем -3.32, что соответствует теоретически невозможной ситуации Е 2. Небольшое превышение (-3.32 к -2.8) наблюдается относительно часто и может быть отнесено на счет погрешности измерений. На эффективность ПЦР влияет множество факторов: длина ампликона, вторичная структура и качество праймеров и т.д. Для того чтобы наклон кривой был адекватным индикатором ПЦР (а не дрейфа сигнала), должна быть точка сгиба. Это точка на кривой роста, где начинается линейная фаза; Дрейф сигнала характеризуется постепенным увеличением или уменьшением флуоресценции без амплификации продукта. Важный параметр для расчета? количества — пороговый цикл. Чем выше; начальное количество ДНК, тем скорее накапливается продукт, регистрируемый ві процессе ПЦР, и ниже значение Ct. Порог должен, быть помещен выше любой активности базовош линии в пределах фазы экспоненциального роста (который выглядит линейно BV логарифмическом преобразовании). Значение Ct = 40 и более означает отсутствие амплификации, такое значение не может быть включено ВЇ вычисления.

Принципы обработки данных 11ЦР-РВ. Существует два основных принципа обработки данных Realime PCR: Прямое сравнение данных (Относительный анализ). Метод калибровочного графика (Абсолютный анализ). Прямое сравнение данных Управляющая; программа прибора ABI Prism 7000 Sequence Detection System позволяет получать относительные количества анализируемых образцов на основании числа циклов, необходимых для достижения минимальных регистрируемых величин флуоресцентного сигнала. Этот метод позволяет проводить прямое сравнение данных с референтным контролем! (нормализатором). Динамический диапазон, изменения концентраций целевого и контрольного генов должен быть одинаков. В общем виде, на основании разницы порогового цикла этих двух генов, программное обеспечение выдает результат в виде превышения или понижения содержания целевого гена относительно контрольного. Метод обладает рядом недостатков, в частности необходимостью тщательной оптимизации реакции. Метод калибровочного графика

Целью абсолютного количественного анализа является точное определение абсолютного количества одной мишени-последовательности нуклеиновой кислоты в неизвестном образце. Этот метод предполагает построение калибровочного графика- в координатах C(t) - log РО с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (РО) в экспериментальных образцах (рис. 7, 8).

Стандарты и неизвестные образцы разбавляются в несколько десятков раз и помещаются в. оптический реакционный планшет, содержащий реакционную смесь и реагентьгдля методики TaqMan, предназначенные для определенной мишени-последовательности нуклеиновой кислоты. В процессе опыта прибор регистрирует интенсивность флуоресценции, которая связана с расщеплением зондов TaqMan в присутствии последовательности-мишени. После завершения опыта программное обеспечение обрабатывает полученные данные флуоресценции для вычисления значений порогового цикла (Ct) для каждого образца.

Определение мутационного статуса генов иммуноглобулинов

Для тестирования и разработки нового отечественного набора реактивов проводили лабораторные испытания некоторых коммерческих отечественных и зарубежных реактивов для ПЦР-РВ. В качестве референтных отобрали два набора: TaqMan PCR Core Reagent Kit фирмы "Applied Biosystems" (США) и JumpStart Tag Ready Mix for Quantitative PCR ("Sigma", США). Из отечественных наборов для ПЦР-РВ выбрали "Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ" (ЗАО "Синтол", Россия). В ходе данной работы был создан универсальный набор реактивов для проведения ПЦР-РВ "РиалитиТМ". В-состав этого набора входит 2.5-кратная смесь, состоящая из ПЦР-буфера (167.5 тМ Трис-HCl, рН 8.8; 42.5 тМ (NH SC ; 0.025% Tween 20; 6.25 тМ MgCb), 2.5-кратного стабилизатора-активатора (Россия), 0.5 тМ каждого dNTP (ИБХ СО РАН, Россия), 1.25 пикомоль/мкл 5-ROX (ЗАО "Синтол", Россия) и 0.03 ед./мкл Taq-полимеразы (ООО НПФ "Гентех", Россия).

В 2003 г. в рамках Европейской программы по борьбе с раком был разработан международный протокол по стандартизации лабораторной диагностики.острого промиелоцитарного лейкоза (ОПЛ) методом ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени [59]. Этот протокол содержит рекомендации по использованию приборов АВГ Prism 7700 ("Applied Biosystems", США), а также фирменного универсального набора реактивов с TaqMan-зондом для определения минимальной остаточной болезни (детекции гена PML-RARa).

Испытание всех наборов проводили на панелях контрольных плазмид с добавлением в реакционную смесь "нагрузки" в виде геномной ДНК человека (5 нг./реакцию); Для определения количества копий в образцах использовали метод абсолютного количественного анализа, включающий построение калибровочной кривой. За "неизвестные" образцы и ДНК-стандарты принимали серии 10-ти кратных разведений (30 - 30x104 копий в реакции) плазмидной ДНК pGEM/PML-RARa (L-изоформа). Основными параметрами для сравнения наборов были: форма кинетической кривой; достоверность полученных результатов (коэффициент корреляции R и коэффициент вариации); эффективность амплификации и динамика реакции (угол наклона, калибровочной кривой и ее расположение); величина нормированного сигнала относительно пассивного контроля R0X(ARn); чувствительность (наименьшее количество копий- гена-мишени, детектируемое в .реакции); точность определения копийности "неизвестных" образцов. Таблица 6. Сравнение основных параметров тестированных наборов для ПЦР-РВ Набор, производитель ARn (FAM/Rox)30-300000 копий PML-RARa Наклонстандарти кривой Средняя эффективность амплификации Коэфф.корреляцииR2 РиалитиТМ, Россия 1.2( l)-4 -3.53 95% 0.999 Jump Start Taq Ready Mix for QPCR, Sigma 1(=1)-2.8 -3.40 97% 0.993 TaqMan PCR Core Reagent Kit, Applera 0.3( 1)- 1.6 -3.51 95% 0.996 Набор для ПЦР-РВ,Синтол 0.6( l)-2.4 -3.40 97% 0.995

Полученные результаты приведены, в табл. 6, Из данных таблицы видно, что отечественные универсальные наборы по перечисленным параметрам не уступают зарубежным аналогам. Коэффициент корреляции R («1), отражающий точность расположения калибровочной прямой, при использовании всех наборов для ПЦР-РВ, составляет не менее 0.993. Набор «РиалитиТМ» превосходит другие тестированные наборы по этому показателю (0.999), для набора «TaqManPCR Core Reagent» коэффициент корреляции составляет 0.996.

Эффективность ГШР теоретически равна 2 и вычисляется, исходя из значения, угла наклона калибровочной прямой. Определить количество копий ДНК можно в фазе экспоненциального синтеза продуктов амплификации при котором концентрация- ампликона удваивается после каждого цикла. Однако, на самом деле, этот показатель меньше 2, поэтому при количественном определении методом ГШР необходимо учитывать эти отклонения в расчетах. Уменьшение эффективности ГЩР определяется снижением активности термостабильнот ДНК-полимеразы и ингибированием ее конечным продуктом, а также вследствие уменьшения концентрации праймеров и неполной денатурации матрицы. В наших опытах эффективность амплификации составляет 1.919 и 1.927 при» использовании «РиалитиТМ» и «TaqMan PCR Core Reagent Kit» соответственно. По этому показателю набор для ПЦР-РВ ("Сйнтол", Россия) занимает первое место по результатам лабораторных испытаний (эффективность амплификации 1.96).-..

Угол наклона стандартных калибровочных прямых для- набора «TaqMan PCR Core Reagent Kit» (R2 = 0.996) равен -3.51, для набора «РиалитиТМ» (R = 0.999) - -3.53 (табл. 6). Точность определения? количества мишеней ДНК по методу абсолютного анализа зависит, в первую очередь, от эффективности амплификации экспериментальных "неизвестных" и стандартных образцов и тождественности условий ГЩР. Разное содержание примесей в препаратах ДНК, отклонения при пипетировании, различия в активности некоторых коммерческих термостабильных полимераз, обусловленные компонентами реакции (ROX, обогащение GG и длина матрицы) могут приводить, по данным зарубежных исследователей, к расхождениям подсчета количества копий матрицы более чем в 10 раз [75]. Для вычисления коэффициента вариации значений в диапазоне 30 -300000 копий гена PML-RARa пользовались стандартной калибровочной прямой, сравнивая полученные средние значения и средние отклонения с известным числом копий. Значения порогового цикла (Ct) определяли исходя из величины порогового уровня (threshold), который составил в наших опытах 0.05-0.1 единиц флуоресценции. На рис. 11 представлены результаты измерения, серии разведений- плазмиды, полученные при использовании различных наборов реагентов.

Похожие диссертации на Уровень транскрипции генов-онкомаркеров в клетках крови больных гемобластозом

Jedi и другие гены, участвующие в регуляции дифференцировки и самоподдержания стволовых и прогениторных клеток кровиРозов Федор Николаевич

"Строгий" контроль транскрипции гена rela в клетках E.coli Бочканов С.С.

Регуляция транскрипции гена гемолизина II Bacillus cereusРодикова Екатерина Александровна

Бесклеточная система транскрипции-трансляции с использованием экспрессируемого синтетического гена ингибитора рибонуклеазХаустов Сергей Анатольевич

Регуляция транскрипции генов системы рестрикции-модификации типа II Ecl18kIПроценко Алексей Сергеевич

Регуляция биосинтеза лимфотоксинов и в клетках периферической крови и в перевиваемых культурах Т-лимфоцитов человекаБойченко Вероника Евгеньевна

Роль метил-ДНК-связывающего белка каизо в контроле транскрипции генов позвоночных, регулируемых метилированием ДНКСаложин Сергей Владимирович

Анализ регуляции транскрипции генов дыхания в гамма-протеобактериях методами сравнительной геномикиГерасимова Анна Викторовна

Структурно-функциональная организация регуляторных районов и механизмы транскрипции генов интерлейкина-5 человека и мышиМордвинов, Вячеслав Алексеевич

Исследование тканеспецифичности транскрипции генов KLRB1 и PROM1Плешкан Виктор Викторович