Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Бесклеточные белоксинтезирующие системы 10
1.1.1. История создания 11
1.1.2. Бесклеточные системы транскрипции-трансляции 12
1.1.3. Получение и состав 14
1.1.4. Энергетический обмен 15
1.1.5. Роль катионов 16
1.1.6. Различные типы систем 17
1.1.7. Реакторы для проведения биосинтеза белка 17
1.1.8. Получение "чистой" белоксинтезирующей системы 20
1.2. Технологии получения искусственных генов " " 22
1.2.1. Искусственные гены в современной молекулярной биологии 22
1.2.2. Метод Кораны - история синтез первого гена 24
1.2.3. Получение генов из частично комплементарных олигонуклеотидов 25
1.2.4. Стадии синтеза генов 27
1.2.5. Использование специализированных компьютерных программ 28
1.2.6. Развитие технологии синтеза олигонуклеотидов 29
1.2.7. Микросинтез олигонуклеотидов с использованием пико-чипов 32
1.2.8. Способы объединения олигонуклеотидов 33
1.2.8.1. Ферментативное объединение олигонуклеотидов 33
1.2.8.2. Попарное объединение дуплексов с использованием ДНК-лигазы 33
1.2.8.3. Синтез с помощью "якорных" и "линкерных" олигонуклеотидов 34
1.2.8.4. Множественное объединение олигонуклеотидов 37
1.2.8.4. "Серийное клонирование" 37
1.2.8.5. "Репаративная достройка" 38
1.2.8.6. Объединение олигонуклеотидов с использованием ПЦР 39
1.2.8.7. Получение генов на микрочипах 40
1.2.9. Способы объединения синтетических сегментов 41
1.2.9.1. Объединение с помощью ПЦР 41
1.2.9.2. Объединение с помощью ДНК-лигазы 42
1.2.9.3. Использование эндонуклеаз рестрикции типа IIS 42
1.2.10. Способы коррекции ошибок 43
1.2.10.1. Применение эндонуклеаз, узнающих неспаренности цепей ДНК 43
1.2.10.2. "Фильтрация совпадений" 44
1.2.10.3. "Общее слияние" 44
1.2.10.4. Гибридизация с" селекционными'' олигонуклеотидам 45
1.2.11. Синтез вирусных геномов и мегакластеров генов 45
1.2.12. Синтез генома микроорганизма * 46
1.2.13. Другие проекты по синтезу геномов 47
1.2.14. Этические проблемы получения искусственного организма 50 1.3. Объект исследования - плацентарный ингибитор рибонуклеаз 51
2. Экспериментальная часть 56
2.1. Материалы и оборудование 5 6
2.2. Методы 66
2.2.1. Модификация нуклеотидной последовательности гена ИР 66
2.2.2. Условия ПЦР амплификации ДНК 66
2.2.3. Химико-ферментативный синтез ДНК 67
2.2.4. Скрининг рекомбинантных клонов с помощью ПЦР 68
2.2.5. Удаление мутаций с использованием ПЦР 69
2.2.6. Очистка ДНК с помощью препаративного электрофореза 69
2.2.7. Ферментативные реакции и их детектирование 70
2.2.8. Обработка препаратов Т5 ДНК-нуклеазой 70
2.2.9. Получение генетических конструкций 70
2.2.9.1. Клонирование синтетических сегментов гена ИР 71
2.2.9.2. Получение генетической конструкции pRI 71
2.2.9.3. Получение генетических конструкций pRI-His и pRI-Nus 72
2.2.9.4. Получение генетических конструкций pET-RN и pET-ANG 72
2.2.9.5. Получение генетических конструкций pRI-RN и pRI-ANG 72
2.2.10. Получение компетентных клеток E.coli 73
2.2.11. Трансформация компетентных клеток Е.coli 1Ъ
2.2.12. Выделение плазмидной ДНК из E.coli 74
2.2.13. Получение S30 экстракта Е.coli 75
2.2.14. Транскрипция РНК in vitro 75
2.2.15. Выделение тотальной РНК Е. coli 75
2.2.17. Экспрессия рекомбинантных генов в E.coli 76
2.2.17.1. Аналитическая экспрессия 76
2.2.17.2. Препаративная экспрессия 76
2.2.17.3. Ко-экспрессия гена ИР с генами шаперонов 77
2.2.18. Синтез белков в БСТТ на основе Е. coli 77
2.2.18.1. БСТТ в формате "batch" 77
2.2.18.2. Диализная БСТТ открытого типа 78
2.2.19. Выделение ИР из телец включения 78
2.2.19.1. Выделение ИР растворением в 8 М мочевине 78
2.2.19.2. Хроматографическая очистка ИР в денатурирующих условиях 79
2.2.19.3. рН-зависимая ренатурация ИР 79
2.2.20. Выделение ИР из клеточного экстракта E.coli 80
2.2.21. Определение концентрации и чистоты нуклеиновых кислот 81
2.2.22. Определение концентрации общего белка 81
2.2.23. Определение концентрации GFP по интенсивности флюоресценции 81
2.2.24. Электрофоретический анализ белков 82
2.2.25. Точное определение активности ИР 82
2.2.26. Оценка активности ИР с помощью электрофореза 83
2.2.27. Определение количества мРНК GFP с помощью ПЦР-РВ 84
3.1. Оптимизация кодонового состава гена ИР 84
3.2. Разработка стратегии синтеза генов, содержащих высокогомологичные повторы 86
3.3. Анализ мутаций, возникших при синтезе ДНК 90
3.4. Исправление мутаций 97
3.5. Корректирование и клонирование синтетических ДНК 100
3.6. Получение полноразмерного гена ИР 101
3.7. Экспрессия гена ИР в Е. coli 103
3.7.1. Экспрессия гена ИР в составе pRI в Е. coli 103
3.7.2. Ко-экспрессия гена ИР с генами шаперонов 105
3.7.3. Ко-экспрессия гена ИР с генами рибонуклеазы А и ангиогенина 106
3.8. Выделение ИР 107
3.8.1. Выделение ИР из телец включения 107
3.8.2. Разработка схемы очистки ИР из клеточного экстракта 108
3.9. Определение активности ИР 110
ЗЛО. Экспрессия гена ИР в БСТТ на основе Е.coli 112
3.11. Получение БСТТ с использованием гена ИР 114
Заключение 119
Выводы 120
Список публикаций, выполненных по теме диссертации 121
Список литературы
- Бесклеточные системы транскрипции-трансляции
- Объединение олигонуклеотидов с использованием ПЦР
- Условия ПЦР амплификации ДНК
- Определение количества мРНК GFP с помощью ПЦР-РВ
Введение к работе
Экспрессия рекомбинантных генов в бесклеточных системах транскрипции-трансляции (БСТТ) становится все более востребованным способом получения белков. Отсутствие механизмов клеточного контроля и возможность манипулировать составом реакционной смеси (добавление редуцирующих агентов, детергентов, ингибиторов протеаз и рибонуклеаз) делают белоксинтезирующие системы единственным возможным способом получения многих белков. Этот подход позволяет решить проблемы, которые могут возникнуть при экспрессии in vivo: цитотоксичность, агрегация, протеолиз, неправильное образование S-S связей. Бесклеточный синтез универсален в геномных исследованиях для скрининга большого количества белков с неизвестными функциями, белковой инженерии in vitro, для получения белков, содержащих тяжелые и радиоактивные изотопы, неприродные аминокислоты.
Технологии бесклеточного белкового синтеза постоянно совершенствуются, предлагаются новые высокоэффективные системы для препаративного получения белков (до 3 мг/мл) с высокой степенью чистоты (до 80%). Это стало возможно благодаря разработке реакторов (обменных и проточных), в которых происходит пополнение компонентов и удаление интермедиатов; оптимизации реакционной смеси (использование клеточного экстракта различной концентрации, добавление деградирующих аминокислот); поиска более эффективных источников регенерации АТФ и ГТФ (пируват оксидаза/флавинадениндинуклеотид, пируват дегидрогеназа/никотинамидадениндинуклеотид); выделения экстракта из мутантных штаммов Escherichia coli, лишенных активностей протеаз и рибонуклеаз.
Другой подход к совершенствованию БСТТ направлен на уменьшение содержания компонентов клеточного экстракта в пользу очищенных составляющих: тРНК, РНК-полимераз, ко-факторов транскрипции и трансляции. Это позволяет избежать присутствия нежелательных примесей, более тонко регулировать состав реакционной смеси, изучать функции любого из факторов трансляции. Единственным компонентом, получение которого сегодня невозможно без использования живых клеток — это рибосомы. Работы по созданию искусственной рибосомы начались с попытки получения рекомбинантных рибосомальных белков малой субъединицы рибосомы E.coli, однако это оказалось безуспешным из-за низкого уровня экспрессии генов, что связано с особенностями кодонового состава и наличием устойчивых вторичных структур мРНК. Как ни странно, но кодоновый состав генов таких важных для клетки компонентов, как рибосомальные белки оказался неоптимальным при суперэкспрессии даже в ктетках E.coli, из которых были получены эти гены. Использование БСТТ также не позволило добиться увеличения выхода белков.
Решение этих проблем стало возможно благодаря развитию технологии химико-ферментативного синтеза генов. С его помощью удалось получить оптимизированные гены всех белков 30S субъединицы рибосомы и экспрессировать их в БСТТ с высоким уровнем продукции. Работа по объединению рибосомальных РНК и белков с образованием функциональной рибосомы не окончены. Можно также ожидать, что в ближайшие годы будут синтезированы гены всех белковых компонентов, участвующих в БСТТ, что позволит получать создать систему искусственного происхождения.
Еще одним направлением совершенствования БСТТ может быть использование экспрессируемых генов белков, участвующих в реакции. В этом
случае в процессе транскрипции и трансляции происходит наработка необходимых факторов системы и их последующее участие в биосинтезе белка. Это неизбежно приведет к появлению систем нового поколения: саморегулирующихся, саморегенерирующихся и самовосполняющихся, поскольку при использовании данного подхода возможно постоянное пополнение компонентов реакции, запуск регулирующихся и каскадных процессов.
Ингибитор рибонуклеаз (ИР) - это неотъемлемый компонент БСТТ, функция которого заключается в защите РНК от ферментативного гидролиза. Традиционно ингибитор добавляют в реакционную смесь в виде очищенного белка, однако в процессе длительных реакций происходит его инактивация. Мы предположили, что использование ИР в виде экспрессируемого гена может привести к увеличению эффективности работы системы, поскольку в этом случае пополнение активного белка происходит за счет его постоянной продукции.
Целью данной работы было получение бесклеточной системы транскрипции-трансляции с использованием экспрессируемого синтетического гена ингибитора рибонуклеаз.
Бесклеточные системы транскрипции-трансляции
Любая ББС должна содержать несколько обязательных компонентов: 1) рибосомы и белковые факторы трансляции; 2) матрица в виде ДНК или мРНК; 3) аминоацилированные тРНК; 4) ГТФ в качестве источника энергии; 5) одновалентные (К+ или NH4+) и двухвалентные (Mg2+ или Са2+) катионы, буферные вещества для поддержания рН системы в физиологических пределах, а также РНК-полимеразу и НТФ в случае систем транскрипции-трансляции.
Одним из наиболее важных условий функционирования ББС является нативное состояние рибосом и факторов трансляции. В качестве источников этих компонентов в бактериальных бесклеточньгх системах чаще всего используют экстракты соответствующих клеток. Клетки разрушают и центрифугируют при 30000 g. При этом в супернатанте (так называемом S30 экстракте) остаются рибосомы и остальные белковые факторы трансляции, необходимые для функционирования системы. Кроме того, в нем содержатся клеточные ДНК и мРНК, которые, если от них не освободиться, приводят к неспецифическому синтезу белка в бесклеточной системе.
Более тщательное фракционирование клеточного экстракта возможно центрифугированием S30 экстракта при 100000 g с получением S100 экстракта, из которого при последующей хроматографической очистки удаляются все аминоацилированные и свободные молекулы тРНК [Gold and Schweiger, 1969; Busso and Kim, 2003]. Поэтому при реконструировании ББС к объединенным фракциям рибосом и S100 экстракта добавляют препарат очищенной суммарной тРНК.
Для функционирования ББС, экстракты клеток S30 и S100, кроме всех необходимых факторов трансляции, должны содержать основные компоненты системы транскрипции, включая факторы инициации (CRP-белок) и терминации (белок р).
Экстракты бактериальных клеток содержат многочисленные нуклеазы и протеолитические ферменты, которые понижают эффективность синтеза белков in vitro, разрушая мРНК и образуемые полипептиды. Для преодоления этих затруднений при получении ББС используют экстракты мутантных клеток, дефектных по рибонуклеазам и полинуклеотидфосфорилазе, в состав реакционных сред вводят ингибитор рибонуклеазы из плаценты человека и ингибиторы протеиназ: лейпептин, пепстатин, химостатин и т.п. [Jiang et ah, 2002]
ГТФ относится к обязательным компонентам бесклеточной белоксинтезирующей системы. Он не может быть заменен на любой другой из известных рибонуклеозидтрифосфатов и необходим для мРНК-зависимого связывания аминоацил-тРНК с рибосомами и транслокации. Поскольку при трансляции происходит непрерывное расходование ГТФ, а образующийся при этом ГДФ является ингибитором трансляции, в процессе функционирования ББС необходима постоянная регенерация ГТФ. Для этого применяют АТФ в качестве донора фосфатных групп, который регенерируется путем переноса фосфатной группы вводимого в бесклеточную систему фосфоенолпирувата с помощью пируваткиназы (рис. 2). Энергия макроэргических связей АТФ используется также при аминоацилировании тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами. Для осуществления синтеза РНК в нее вводятся еще два недостающих рибонуклеозидтрифосфата: УТФ и ЦТФ [Calhoun and Swartz, 2007].
Для функционирования ББС необходимо обеспечивать в ней определенные ионные условия, особенно концентрацию ионов Mg2+. Достаточно изменения концентрации Mg2+ в системе на 1-2 мМ, чтобы в ней перестали синтезироваться полипептиды, обладающие ферментативной активностью. Это, по-видимому, объясняется нарушением точности включения аминокислот в белки при неоптимальных концентрациях ионов Mg2+5 хотя суммарное включение аминокислот в синтезируемые полипептидные цепи при этом может не изменяться.
В системах in vitro ионы Mg2+ могут быть заменены на ионы Са2+ и даже Мп2+, а также частично замещены полиаминами: спермидином или спермином, которые положительно влияют на трансляцию и образование нативных белков.
Биосинтез белка в бесклеточных системах происходит также в присутствии ионов К+ или NHt+, оптимальные концентрации которых составляют около 100 мМ. Ионы Na+ ингибируют трансляцию, а ацетат-анионы в используемых солях предпочтительнее анионов СГ. Ионы Mg2+, К+ и NH4+ необходимы для ассоциации субчастиц рибосом и поддержания их в компактной форме [Liu et al., 2005].
В зависимости от источника клеточного экстракта, различают прокариотические и эукариотические ББС. Хотя механизм биосинтеза белка универсален для всех биологических объектов, существуют некоторые отличия в инициации и регуляции трансляции в прокариотических и эукариотических организмах. Для различных целей используют системы, полученные из различных источников. Наиболее распространены прокариотические системы на основе экстракта E.coli, и эукариотические — на основе экстракта ретикулоцитов кролика и проростков пшеницы [Jackson and Hunt, 1983; Roberts and Paterson, 1973].
Системы на основе экстракта E.coli наиболее распространены, поскольку отличаются высокой продуктивностью для экспрессии как про-, так и эукариотических генов. Как правило, образование дисульфидных связей и формирование активных мультимерных комплексов успешно реализуются при использовании этих систем [Fernholz et al., 2003; Kang et al., 2005]. Недостатком прокариотических систем является отсутствие возможности посттрансляционного гликозилирования и других сложных модификаций, свойственных для эукариотических белков. Эти ограничения преодолеваются при использовании эукариотических систем.
Объединение олигонуклеотидов с использованием ПЦР
Использование ДНК-полимеразы, предложенное Итакурой, является наиболее широко используемым методом при синтезе генов и получил название "репаративная достройка". Самым простым его вариантом является метод, известный, как "слияние ДНК" ("DNA shuffling") [Stemmer, 1994]. Его принцип основан на том, что олигонуклеотиды гибридизуются попарно, каждый при этом служит матрицей для синтеза цепи с 3 -конца другого. Образующийся продукт используют на следующей стадии удлинения и т.д.
Объединение олигонуклеотидов с использованием ПЦР
Широкое использование термофильных ДНК-полимераз при синтезе генов обусловлено развитием методов, основанных на ПЦР, благодаря которым можно объединить от 2 до нескольких десятков олигонуклеотидов в одной реакции [Cicarelli et al, 1991; Baedeker and Schulz, 1999; Gao et al, 2003]. По аналогии с ПЦР, метод получил название ПЦС - "полимеразная циклическая сборка" ("polymerase cycling assembly") и был впервые использован для синтеза гена HIV-2 Rev длиной 303 п.н. [Dillon and Rosen, 1990].
Проведению ПЦС может предшествовать лигирование олигонуклеотидов, собранных в дуплексы различной длины [Smith, 2003]. Фланкирующие праймеры могут быть добавлены к смеси олигонуклеотидов с самого начала [Tian et al, 2004], но в концентрации большей, чем внутренние [Young and Dong, 2004], или на последней стадии ПЦР [Prodromonow and Pearl, 1992].
В самой простой из модификаций, когда в реакцию добавляют смесь из взаимокомплементарных олигонуклеотидов и подвергают ПЦС, метод получил название "амплификация перекрывающихся последовательностей" ("overlap extention PCR") [Mehta and Singh, 1999] или "пошаговый ПЦР" ("recursive PCR") [Prodromonow and Pearl, 1992] (рис. 10 A).
Метод объединения олигонуклеотидов в так называемый "успешной ПЦР" ("successive PCR") [Xiong et al, 2004] несколько отличается от распространенных подходов (рис. 10 В). Метод позволил объединить в одной реакции до 59 олигонуклеотидов и получить набор из нескольких генов быстрее по сравнению с другими методами, за что и получил свое название. Однако, широкого распространения метод не получил, поскольку число ошибок при его использовании оказалось в 3 раза выше расчетного.
При синтезе ДНК на микрочипе [Zhou et ah, 2004] каждый полинуклеотид содержит универсальные фланкирующие последовательности, содержащие сайты эндонуклеаз рестрикции типа IIS. После достройки одноцепочечных ДНК с образованием дуплексов и обработки соответствующей эндонуклеазой, универсальные последовательности удаляются, а дуплексы содержат выступающие концы. Поскольку выступающие концы уникальны и взаимокомплементарны, то в одной реакции лигирования можно объединить все полученные сегменты с образованием ДНК гена.
Предполагаемая цена синтеза ДНК при массовом использовании данного метода для получения искусственных генов может составить 1 долл. США за 20000 и.о., что на 3 порядка дешевле нынешней цены -1 долл. США за 9 н.о. [Tian et al, 2004].
Опыт исследователей показал, что объединением олигонуклеотидов невозможно получить синтетическую ДНК, не содержащую мутаций, при ее длине более 500-800 п.н. В ряде публикаций отражены проблемы безрезультатного поиска клонов, не содержащих мутаций, при получении слишком длинных ДНК, в результате чего исследователи были вынуждены приступать к новым попыткам синтеза генов из менее протяженных сегментов и с использованием более качественных олигонуклеотидов [Young and Dong, 2004]. На фоне сложностей синтеза длинных молекул ДНК из олигонуклеотидов, особое развитие получили методы объединения синтетических продуктов.
Условия ПЦР амплификации ДНК
Плазмидой pRI трансформировали клетки E.coli BL21(DE3). Единичную колонию пересевали в 50 мл среды Terrific, содержащей канамицин и выращивали в течение ночи. Полученную затравку пересевали в 10 л среды Terrific, содержащей канамицин и выращивали при 37С и интенсивной аэрации до плотности культуры Абоо=2,0 о.е. Экспрессию рекомбинантного белка индуцировали добавлением 1 мМ ИПТГ. После индукции культуру выращивали 4 ч, клетки осаждали центрифугированием (20 мин, 4С, 4000 g). Около 100 г осажденных клеток ресуспендировали віл буфера Л и разрушали добавлением лизоцима до конечной концентрации 0,5 мг/мл. После разрушения клеточный дебрис осаждали центрифугированием (30 мин, 4С, 30000 g). Осадок замораживали при -70С и использовали для выделения ИР из телец включения, супернатант использовали для выделения ИР из растворимой фракции.
Компетентные клетки E.coli BL21(DE3) трансформировали плазмидами pG-KJE8, pKJE7, pTfl6, pGF2. Полученные колонии использовали для приготовления компетентных клеток, которые трансформировали плазмидой pRI. Индукцию экспрессии шаперонов проводили согласно инструкции производителя добавлением 1 мМ L-арабинозы или 20 мг/мл тетрациклина. Индукцию экспрессии ИР проводили добавлением ИПТГ, как было описано ранее.
Аналитическую экспрессию ИР с помощью БСТТ проводили в формате "batch" [Kim and Swartz, 2000]. В пробирку, содержащую реакционную смесь для БСТТ (35 мкл) вносили плазмиды pRI и/или pGFP (суммарная концентрация 50мкг/мл) и инкубировали в твердотельном термостате (1ч, 30С). Количество и скорость синтеза белков оценивали по флюоресценции GFP, активности ИР и появлению полос соответствующего размера на SDS-ПААГ электрофорезе.
Препаративный синтез белков с помощью БСТТ с постоянным обменом проводили в диализном реакторе открытого типа (рис. 3 Б). Плазмиду pRI в различной концентрации (от 3 до 50 мкг/мл) отдельно или вместе с pGFP (50 мкг/мл) вносили в реакционную смесь для БСТТ (150 мкл). Во внешнюю камеру вносили 500 мкл питающего раствора для БСТТ. Камеры разделяли диализной мембраной с размером пор 12-14 кДа. Реакцию проводили 24 ч при 30С с постоянным перемешиванием питающего раствора на магнитной мешалке в термостатируемом боксе. Для оценки эффективности работы системы, через равные промежутки времени (1-4 ч) отбирали пробы по 2-4 мкл, в которых определяли количество GFP по флюоресценции, активность ИР, детектировали появление полос соответствующего размера на SDS-ПААГ электрофорезе и измеряли количество мРНК GFP методом ПЦР-РВ.
Осадок, полученный после лизиса индуцированных клеток, промывали дважды буфером В1, центрифугировали (20 мин, 4С, 6000 g) и ресуспендировали в 50 мл буфера В1. Затем при непрерывном перемешивании добавляли 50 мл 8 М раствора мочевины. После растворения белковых телец включения, нерастворимые частицы осаждали центрифугированием (20 мин, 4С, 12000 g) и отбрасывали. Супернатант использовали для ренатурации ИР различными способами:
1 .Разбавление. Супернатант (по 10 мл) равномерно переносили в стаканы с буферами ВЗ, В4 или В5 (90 мл) при перемешивании на магнитной мешалке. Затем оставляли при комнатной температуре на ночь.
2.Диализ. Супернатант (по 10 мл) переносили в диализные мешки и помещали в стаканы с 200 мл буферов ВЗ, В4 или В5. Диализ осуществляли без перемешивания (4 ч, 20С), после чего буфер в стакане заменяли на новый и оставляли при +4С на ночь.
3.Гель-фильтрация. Супернатант (по 3 мл) наносили на колонки DG10, уравновешенные буферами ВЗ, В4 или В5 и элюировали этими же буферами.
Определение количества мРНК GFP с помощью ПЦР-РВ
Поскольку мы выяснили, что ИР синтезируется в БСТТ в активном виде и может продуцироваться совместно с GFP, следующим этапом нашей работы было изучение влияние гена ИР на эффективность работы системы при его ко-экспрессии с геном GFP. Для этого мы использовали БСТТ диализного типа, в которой возможно пополнение компонентов реакционной смеси за счет питающего раствора, отделенного полупроницаемой мембраной. Синтез белков в таких системах протекает в течение длительного времени (около 24 ч), причем стабильность РНК играет определяющую роль, а добавление ИР является крайне необходимым [Alakhov etal., 1995].
Наше предположение заключалось в следующем: продукция ИР с использованием плазмиды pRI приводит к синтезу активного ингибитора, который, в свою очередь, способен связывать рибонуклезы, неизменно присутствующие в реакционной смеси, защищая тем самым мРНК GFP и увеличивая в конечном счете выход целевого белка. Для поиска оптимальных условий ко-экспрессии мы изучили влияние различных концентраций pRI на продукцию GFP (рис. 34).
В результате данного исследования был получен экспериментальный материал, который можно сформулировать в нескольких важных для последующей работы промежуточных выводах.
При ко-экспрессии, добавление гена ИР в составе pRI оказывает на БСТТ двойное влияние: положительное и отрицательное. Положительный эффект заключается в том, что при экспрессии гена происходит продукция активного ИР, который связывает примеси рибонуклеаз, уменьшает гиролиз мРНК и увеличивает выход GFP. Увеличение продукции GFP прямопропорционально концентрации pRI в реакционной смеси и достигает в данных условиях максимума при концентрации pRI около 13 мкг/мл. При дальнейшем увеличении концентрации pRI начинается конкуренция двух плазмид, и проявляется отрицательный эффект на синтез GFP, что вызвано оттоком части ресурсов системы предназначенных для продукции GFP (НТФ, аминокислот), на синтез ИР.
Таким образом, для эффективного применения гена ИР в БСТТ необходимо использование такой концентрации плазмиды pRI, которой достаточно для синтеза ИР, но при которой не происходит значительной конкуренции с продукцией целевого белка за ресурсы системы. Согласно полученным данным, при 24-х часовой инкубации добавление экспрессируемого гена ИР в составе pRI с оптимальной концентрацией (13 мкг/мл) увеличивает продукцию GFP более, чем на 40% по сравнению с отрицательным контролем (без добавления ИР).
Для более детального анализа мы провели ко-экспрессию обоих генов в БСТТ с использованием наиболее оптимальных концентраций pRI (7 и 13 мкг/мл), из реакционной смеси отбирали пробы через равные промежутки времени для определения концентрации наработанного GFP и его мРНК (рис. 35). В качестве положительного контроля в БСТТ добавляли белковый ИР, что является традиционным способом защиты РНК от гидролизующего действия рибонуклеаз. В качестве отрицательного контроля использовали препарат без добавления белкового ИР и его экспрессируемого гена.
Несмотря на то, что при измерении продукции GFP в конечной точке (24 ч), при использовании различных концентраций pRJ его максимальная продукция была получена при концентрации 13 мкг/мл, промежуточные значения (до 16 ч инкубации) оказались выше при использовании более низкой концентрации плазмиды (7 мкг/мл). Объяснение различных форм кривых при использовании различных концентраций pRI заключается в двойном влиянии экспрессируемого гена ИР на БСТТ, что было рассмотрено выше. Удивительно, что выход на плато кривой продукции GFP при добавлении pRI (13 мкг/мл) происходит только после 24 ч инкубации (данные не приведены), в то время, как во всех остальных случаях это наблюдается значительно раньше. Этот факт может служить доказательством того, что продукция GFP обычно лимитируется количеством его мРНК, которая гидролизуется под действием рибонуклеаз при иниктивации ИР в процессе реакции. В то время, как использование pRI (13 мкг/мл) позволяет наиболее эффективно защитить мРНК, в результате чего синтез GFP продолжаеся существенно дольше. При довольно продолжительном приросте синтеза GFP в последнем варианте, значения его концентрации ниже, чем в положительном контроле. Это связано с тем, что соотношение матриц PIP и GFP составляет 1:4, а это означает, что примерно 20% ресурсов системы расходуется на синтез ИР. В то же время, как видно на рисунке 35, в конечной точке выход GFP при использовании pRI (13 мкг/мл) только на 10% ниже, чем при использовании белкового ИР, где все ресурсы системы расходутся только на синтез GFP. Это означает, что положительный эффект экспрессируемого гена ИР на БСТТ, примерно в два раза больше отрицательного.
