Содержание к диссертации
Введение
1. Регуляция активности катабожтных оперонов у бактерий escherichia соы 9
1.1. Позитивная и негативная регуляция экспрессии катаболитных оперонов 9
1.2. Факторы, участвующие в позитивной регуляции катаболитных оперонов 12
1.3. Механизм позитивной регуляции катаболитных оперонов 17
1.4. Является ли комплекс цАМФ-САР единственным фактором, необходимым для осуществления позитивной регуляции катаболитных оперонов 21
2. Фосфоенолпируват: углевод фосфотрансферазная система (фтс) у е.сош и s.typhimurium 25
2.1. Биохимическая характеристика цитоплазматических компонентов ФТС 26
2.2. Генетические детерминанты цитоплазматических компонентов ФТС 33
3. Участие фтс в регуляции метаболизма у энтеро-еактерий 37
3.1. ФТС и "глюкозний эффект" 38
3.2. Нарушение экспрессии катаболитных оперонов в результате мутационного повреждения компонентов ФТС 43
4. Регуляция экспрессии катабожтных оперонов, независимая от цамф-сар 51
1. Материалы и методы 55
2. Внутриклеточный уровень цамв и индуцибельный синтез ферментов у мутантов ptsi и ptsh 64
2.1. Штаммы E.coli K-I2, использованные в экспериментах главы 2 66
2.2. Экспрессия лактозного оперона и внутриклеточная концентрация цАШ? у мутантов ptsi и ptsH 67
2.3. Влияние экзогенного цАШ на скорость синтеза р -галактозидазы у мутантов д cyapts і 68
2.4. Экспрессия триптофаназного оперона у мутан та pts і в присутствии мультикопийной плазмиды, несущей ген аденилатциклазы
3. Экспрессия лактозного оперона у мутантов msi ' и ptsh в присутствии температурочувствительной мутаций, затрагивающей '-субъщиницу рнк-полимеразы 77
3.1. Штаммы E.coli K-I2, использованные в экспериментах в главе 3 78
3.2. Скорость синтеза р -галактозидазы у мутантов pts і и ptsH в присутствии мутации rpocl. 79
3.3. Влияние цАШ на синтез & -галактозидазы у му тантов ptsi и ptsH в присутствии мутации rpocl 85
4. Мутационное повреждение сар и экспрессия катабо-лйтных 0пер0н0в у мутанта ptsH 88
4.1. Штаммы E.coli K-I2, использованные в экспериментах в главе 4 88
4.2. Скорость синтеза к -галактозидазы и ь -трип-тофаназы у мутанта ptsH в присутствии мутации 88
5. Экспрессия лактозного оперона в сопряженной транскрипционно-трансляционной системе в экст рактах мутантов pts 92
5.1. Штаммы E.coli K-I2, использованные в экспе риментах в главе 5 92
5.2. Синтез РНК и белка в s 30 экстрактах бактерий pts и pts I Н 92
5.3. Синтез -галактозидазы в s 30 экстрактах бактерий pts и pts і н 96
Обсуждение результатов 102
- Факторы, участвующие в позитивной регуляции катаболитных оперонов
- Генетические детерминанты цитоплазматических компонентов ФТС
- Экспрессия лактозного оперона и внутриклеточная концентрация цАШ? у мутантов ptsi и ptsH
- Скорость синтеза к -галактозидазы и ь -трип-тофаназы у мутанта ptsH в присутствии мутации
Введение к работе
Адаптация бактериальной клетки к условиям внешней среды происходит чрезвычайно быстро. При этом количество отдельных белков у бактерий Escherichia coll сильно колеблется И За висит от состава среды роста. Такой эффект связан с существованием механизмов, обеспечивающих в данный конкретный момент избирательный синтез тех белков, в которых клетка испытывает большую потребность,;
В основе этого явления лежит индуцибельный синтез белков, связанный с резким увеличением скорости синтеза определенного белка при появлении в среде роста специфического субстрата (индуктора). Регуляция индуцибельного синтеза белков согласно современным представлениям может быть негативной или позитивной. При негативной регуляции специальные белки-репрессоры взаимодействуют с регуляторной областью ДНК, вызывая подавление синтеза белков. При позитивной регуляции циклический аденозин-З ,5 -монофосфат (пАШ) в комплексе с белком-рецептором - САР и/или спе-пифические белки-активаторы вызывают стимуляцию синтеза индуци-бельных белков.
Однако, как показано в последнее время, механизм регуляции индуцибельного синтеза белков существенно сложнее, чем предполагалось ранее и может включать факторы, неизвестные до сих пор. В связи с указанными обстоятельствами особое значение приобретают исследования, посвященные регуляции синтеза индуцибельных белков при участии компонентов системы транспорта D -углеводов (фосфоенолпируват: углевод фосфотрансферазная система, ФТС). ФТС многокомпонентна и содержит как питоплазматические (раство-римые), так и мембранные белки.
К числу углеводов, транспортируемых при помощи ФТС, относится глюкоза. Известно, что добавление глюкозы или других угле - 7 водов в среду роста вызывает резкое подавление индуцибельного синтеза белков. Этот эффект связан с тем, что в присутствиш глюкозы потребность в углероде и энергии полностью удовлетворяется этим углеводом, что делает ненужным расщепление для этих целей других соединений.
Тем более удивительным является тот факт, что даже в отсутствий глюкозы в среде роста у мутантов, имеющих повреждения цитоплазматических компонентов ФТС (мутации pts ) наблюдается по-давление синтеза индуцибельных белков. К числу таких белков относятся f -галактозидаза, ь -триптофаназа, амиломальтаза и многие другие. Механизм, обеспечивающий снижение синтеза индуцибельных белков у бактерий с повреждением цитоплазматических компонентов ФТС не ясен. По мнению одних авторов, это явление обусловлено снижением концентрации пАМЗ? и/или индуктора в клетке; по мнению других, этот феномен связан с непосредственным влиянием цитоплазматических компонентов ФТС на транскрипцию генов, кодирующих индуцибельные белки.
Целью настоящего исследования явилось изучение механизма действия мутаций pts , повреждающих цитоплазматические компоненты ФТС, на регуляцию синтеза индуцибельных белков.
Перед нами стояли следующие конкретные задачи:
1. Изучить взаимосвязь между снижением синтеза индуцибельных белков и изменением внутриклеточного уровня у мутантов с повреждениями цитоплазматических компонентов, ФТС.
2. Создать удобную модель для исследования эффекта мутаций, затрагивающих цитоплазматические компоненты ФТС, на инду-цибельный синтез белков in vivo ; используя такую модель, провести сравнительное исследование эффективности синтеза индуцибельных белков у мутантов, имеющих повреждения различных пито - 8 плазматических компонентов ФТС.
3. Выявить компонент, участвующий в регуляции индуцибель-ного синтеза белков и подверженный действию мутаций pts.
4. Исследовать влияние транспортных белков ФТС на индуци-бельный синтез in vitro в условиях бесклеточной системы сопряженной транскрипции - трансляции.
В результате исследований впервые получены доказательства, что подавление синтеза белков у мутантов P S , имеющих повреждения цитоплазматических компонентов ФТС, не связано с изменением активности и внутриклеточной концентрации пАМФ. Впервые созданы модельные условия in vivo , позволяющие увеличивать или уменьшать действие мутаций pts при варьировании условий инициации транскрипции генов, кодирующих синтез белков (гены). Эти данные показывают, что действие мутаций pts связано с нарушением процесса инициации транскрипции катаболитных генов. Обнаружено, что наиболее вероятной точкой приложения действия мутаций pts является фактор позитивной регуляции катаболитных генов -белок-рецептор пАМФ (САР).
Результаты, полученные в настоящем исследовании, имеют не только теоретическое, но и практическое значение. Они могут явиться предпосылкой для направленного вмешательства в работу регуляторных механизмов бактериальной клетки, с целью изменения её биосинтетических функций.
Факторы, участвующие в позитивной регуляции катаболитных оперонов
В позитивной регуляции8 участвуют три общих для всех катаболитных оперонов компонента: ДНК-зависимая РЖ полимераза, цАШ и САР. РНК полимераза РНК-полимераза является основным ферментом транскрипции. Структурные и функциональные особенности РНК-полимеразы подробно описаны в ряде обзоров /10,14,53/, поэтому мы рассмотрим самые общие структурные особенности этого фермента. РНК-полимераза является крупным белком с М.М. 500000 дальтон. Известны две ферментативно активные формы РНК-полимеразы: I) полная РНК-полимераза, так называемый холофермент, состоящий из пятис _субъедшщц:20 , р, р и 5 , и 2) минимальная РНК-полимераза или "кор"-фермент, который характеризуется отсутствием -субъединицы. "Кор"-фермент способен осуществлять все основные функции РНК-полимеразы, кроме специфического узнавания промотора, ибо для этого необходима субъединица (Ґ. Следует отметить, что в данном обзоре будут рассматриваться общие для всех катаболитных оперонов факторы положительной регуляции транскрипции, не считая воздействия специфических для каждого оперона белков-активаторов. цАШ представляет собой нуклеотид, осуществляющий в комплексе с САР положительную регуляцию синтеза мРНК, кодируемую катаболитными генами /17,84/. Другие нутслеотиды, такие как АТФ, АДФ, 5 АШ, 3»АШ неэффективны в этом процессе /84/. Однако имидазол и его производные способны заменять пАШ при активации транскрипции ара-бинозного оперона /74/. Известны также нуклеотиды-антагонисты цШ&, приводящие к репрессии синтеза индуцибельных ферментов. К их числу относится цШ , цИМФ /35/. Внутриклеточный уровень цАШ колеблется от 5-10- до 5-10- в зависимости от штамма /84/. Основную роль в регуляции внутриклеточного уровня пАМФ играет аденилатциклаза (АЦ), катализирующая превращение АТФ в цАШ /84/. В клетках бактерий фермент связан с мембраной /84/. Ген, ответственный за синтез аденилатциклазы, расположен на 84 минуте генетической карты E.coli /20/. Мутации, приводящие к инактивации АЦ, имеют фенотип Суа проявляющийся в отсутствии внутриклеточного цАМФ и в неспособ-источника ности бактерий использовать в качестве единственного углерода мальтозу, лактозу, арабинозу и другие углеводы, для утилизации которых требуется работа катаболитных оперонов /84/.
Регуляция активности АЦ по современным представлениям связана с состоянием системы транспорта D -углеводов в клетку /25/. Более подробно предполагаемые механизмы действия компонентов транспортной системы углеводов обсуждаются далее в главе 4. В регуляции синтеза аденилатциклазы может принимать участие, по предположению ряда авторов, цАШ с комплексе с САР, осуществляя негативный контроль синтеза фермента /24,94/. Банкайтисом и Бассфордом при изучении гибридной системы (фыоза), в котором структурный ген Iac-оперона, кодирующий fb-галактозидазу, контролировался промоторным участком гена, ответственного за синтез АЦ, показано, что ни цАМФ, ни САР непосредственно не влияют на синтез АЦ /22/, Авторы предполагают, что действие комплекса цАШ-САР связано с посттрансляционной модификацией АЦ /22/. К аналогичному результату пришли исследователи группы Ульман /79/, изучавшие свойства АЦ в штаммах, имеющих резко увеличенное количество САР. Белок - рецептор цАМФ САР представляет собой димер, состоящий из двух идентичных субъединиц, каждая с М.М. 22500 дальтон /18/. САР является основным, растворимым белком, концентрация которого составляет 2,5 10- или 1300 молекул на клетку /28/. В структуре каждой субъединицы САР можно выделить два участка (домена), несущие различные функциональные нагрузки: I) большой ин2 -терминальный фрагмент, содержащий участок связывания цАМФ и место димеризации субъединиц САР; 2) малый С00Н-терминальный фрагмент, обеспечивающий взаимодействие с ДНК /18,58/. В отсутствие цАМФ два домена САР взаимодействуют друг с другом, обусловливая тем самым резистентность к действию протеаз /17/. Связывание цАМФ с САР носит специфический характер и приводит к конформационному изменению структуры САР /17,18,84/. В отсутствие цАМФ САР резистентен к действию химотрипсина, а связывание с нуклеотидом создает условия для протеолитического расщепления терминального СООН-фрагмента с разрывом единственной пептидной связи и образованием двух полипептидов /18/. Связывание САР с ДНК неспецифично. САР связывается с различными типами ДНК, иногда даже не содержащими промоторов катаболитных оперонов /84,126/. Возможно также взаимодействие САР с синтетическими полидезоксирибонуклеотидами /84,126/. Образование комплекса САР с цАМФ предопределяет связывание САР с промоторными участками ДНК /1,17/. При низких концентрациях ДНК и САР цАШ выступает как активатор их связывания /14/. Место специфического связывания комплекса цАШ - САР с ДНК сильно варьирует в зависимости от промотора. Так в случае Іас-промотора САР связывается между -50 и -74 нуклеотидами /114/ промотора галактозного оперона - в области -35 нуклео-тида /122/, промотора арабинозного оперона ( ага ВАД) - в области -85 и -90 /17,126/. Парадокс заключается в том, что общий активатор для всех катаболитных оперонов связывается с различными участками промоторов. Структура ДНК в этих участках также различна.
В сайте узнавания САР Іас-промотора имеется участок двойной симметрии /114/, отсутствующий в галактоз-ном /122/ и арабинозном промоторах /126/. Однако имеются сходные последовательности ДНК для всех сайтов узнавания САР. При анализе 10 различных катаболитных промоторов выявлена общая для всех регуляторных участков пос ледовательность из 10 нуклеотидных пар 5»АА--ТГТ САР, приводящее к резкому снижению активирующей способности комплекса цАШ?-САР проявляется в виде с Р фенотипа /14/. Такие бактерии, аналогично суа мутантам, не способны использовать в качестве источника углерода субстраты, утилизация которых требует работы катаболитных оперонов (мальтоза, лактоза, глицерин) /84/. Добавление цАШ не изменяет эффекта этой мутации. Однако следует отметить, что как бактерии crp , так и суа остаются кизнеспособвили, то есть ни цАШ, ни САР не являются абсолютно необходимыми для жизнедеятельности клетки /99/. Одной из интересных работ последних лет явилось установление конститутивного синтеза САР, то есть независимого от условий среды /50/. Гизо и Блази /50/ исследовали зависшлость количества САР от углевода, на котором выращивались метки. Было показано: I) что независимо от источника углерода (который используют для роста бактерий), будь то глюкоза, глицерин или сукцинат, количество САР в клетке не меняется, 2) количество белка не зависит и от цАМФ, так как штаті суа содержит такое же количество белка, что и суа+. В настоящее время известны различные мутации, изменяющие активность САР. Так был выделен мутантный САР, способный активировать катаболитные промоторы без цАШ (супрессия фенотипа Суа). Этот белок образуется в результате так называемой мутации crps/99/. Аналогичный мутант сгр был выделен Такебе с соавторами. У этого мутантного САР константа связывания с цШ была в 10 раз меньше, чем у исходного типа /121/. Выделен мутантный САР, у которого способность активировать катаболитные гены резко снижается в присутствие пАШ /73/. Такои мутантный белок способен супрессировать Суа фенотип, так же как аллель сгрх. Очевидно, можно выделить различные типы мутаций, затрагивающие САР, которые будут вызывать изменение любого из трех функциональных участков: сайт взаимодействия САР с цАШ, сайт . взаимодействия отдельных субъединиц белка между собой или сайт взаимодействия САР с ДНК.
Генетические детерминанты цитоплазматических компонентов ФТС
Гены, ответственные за синтез общих компонентов ФТС фі и нрг - ptsi и ptsH располагаются на 52 минуте карты хромосомы E.coli /20/. Гены ptsi и ptsH , по мнению Эпштейна и других авторов, образуют один оперон, хотя достоверных доказательств этому в настоящее время нет./29,38,89/. Последовательность указанных генов и возможное направление их считывания в pts области у E.coli следующие: cys Л pts I pts н sup W38/г Интересно рассмотреть Структуру ОПерОНЭ pts S. typhimurium: расположение генов и направление их считывания у этого микроорганизма хорошо известны /29/. Оперон расположен, на минуте 51 карты хромосомы s. typhimurium /29/. Порядок генов в этой области следующий cys Л cys к PI ptsHptsi P2crr.Регуляция генов pts осуществляется координирование и контролируется промотором PI. Ген err по-видимому, имеет собственный регулятор Р2, так как регуляция его экспрессии отлична от ptsH и ptsl генов /29/. У S.typhimurium мутаЦИИ ptsH ИМЄЮТ полярный эффект, то есть мутационное повреждение гена ptsH приводит к подавлению экспрессии гена ptsl /25/. Таким образом, генетические детерминанты для цитоплазмати-ческих компонентов Б.СОІІ и s,typhimurium в настоящее время локализован на хромосоме. Известно, что мутанты ptsl не способны расти, используя в качестве единственного источника углерода такие субстраты, как мальтоза, мелибиоза (подробнее - см.главу 4) /89,111/. Корнбергом с соавторами был выделен ревертант из мутанта ptsl E.coli , утилизирующий ФТС субстраты при непермиссивной температуре 40 /97/.Индуцибельный синтез белков у этого мутанта оказался резистентным к действию глюкозы /97/. Отметим, что мутант ptsl s при 40 не способен утилизировать как ФТС, так и не ФТС субстраты /89,97/. Эта мутация, супрессирующая рост на не ФТС субстратах и вызывающая резистентность бактерий к глюкозе, была Обозначена err ( carbohydrate repression resistance) /97/. Картирование этой мутации показало, что она котранедуцируется с генами pte E.coli/97/. Частота котрансдукции с маркером cusA составляет 5%, с pts 25% /97/. Корнберг предлагает Следующий ПОРЯДОК ГеНОВ В ОблаСТИ pts у E.coli CLfS А ptsl err ptsH /59/» Ген err был клонирован в плазмиде pBR322 ; фрагмент, несущий этот ген, был встроен между сайтами Psti и EcoRi плазмиды pBR322 /71/.
Трансформация плазмиды, несущей ген err в мутанты err E.coli, приводит к восстановлению фенотипа p"ts + /71/. В экстрактах таких штаммов определяется активность Шглюк, не регистрируемая в штаммах err/71/. В настоящее время можно считать доказанным, что I) err-ген, кодирующий синтез Шглюк, 2) ген err располагается в pts области E.coli . Выделена серия мутантов err , отличающихся друг от друга по содержанию прлюк /110,112/. Рассмотрим более подробно свойства этих мутанта /110,112/. У одних (авторы относят их к типу I) остается 20-30 Шглюк-1 (смотреть стр. 32). Однако, Шглюк-1 у таких мутантов осуществляет фосфорилирование МГ сходное с щГлюк_- бактерий pt#. Иначе говоря, в результате мутаций первого типа изменяется количество Шглш-1, но не меняется его удельная активность /110,112/. Шгл10К-1, выделенный из такого мутанта, имел сходную с интактным nF -I молекулярную массу, иммунологические свойства /110,112/. Однако, такой мутантный белок оказался способным образовывать моно-, ди-, три-, тетра-мерные комплексы с молекулярными.массами 20000, 40000, 60000, 120000 дальтон соответственно, не характерные для нормального Шглюк-1 /НО/. Результаты анализа пептидных карт белков llFjnDK-if выделенных из штаммов err npts + , также выявили различия между мутантними и интактными полипептидами /НО/. Другой тип мутаций err (тип П) приводит к полному удалению Шглюк-1 из клетки, но мало изменяет содержание Ilf 1101 -!!. Делеционные мутанты s.typhimurium или мутанты, содержащие в гене err транспозон Тп 10 /НО/, сохраняют способность транспортировать МГ /110,112/. Было показано, что у вышеописанных бактерий сохранен белок IlF -n /110,112/. Подробное обсуждение свойств мутантов необходимо нам для того, чтобы подчеркнуть важное обстоятельство: все известные в настоящее время мутанты err s .typhimurium содержат белок цглюк ДЮДІ2/. ) Выращивание бактерий на минимальной среде, содержащей глюкозу, приводит к резкому снижению экспрессии катаболитных оперонов /77/. При этом снижается скорость синтеза таких инду-цибельных ферментов, как: jb-галактозидаза, ъ - триптофаназа, глицерокиназа и других /89/. Репрессия синтеза индуцибельных ферментов при добавлении к среде роста глюкозы состоит из двух фаз /77/. Первая фаза почти полного прекращения синтеза фермента в течение одного полупериода времени генерации (транзиент-ная репрессия) /64,77,129/.
Вторая фаза - возобновления синтеза белка и протекание ее с постоянной, но меньшей скоростью, чем перед добавлением глюкозы (катаболитная или перманентная репрессия) /77,129/. В основе механизма перманентной и транзиентной репрессии лежит изменение внутриклеточного уровня цАШ? /63,84,129/. Как впервые было показано Макманом и Сазерландом, а затем подтверждено другшли авторами, воздействие глюкозы связано со снижением уровня цАМФ в клетке /63,129/. Сниженный уровень цАМФ, а следовательно, и количество комплекса пАШ-САР вызывает репрессию синтеза катаболитных белков (глава I). Добавление экзогенно-го цАШ? супрессирует эффект перманентной и транзиентной регрессии /85/. Эффективность же синтеза цАШ в клетке определяется активностью ферлшнта АЦ (глава 2). Присутствие глюкозы в среде роста приводит к резкому снижению активности этого фермента /52,110/. Однако, согласно современным данным (глава 2) механизм репрессии глюкозой экспрессии катаболитных оперонов нельзя объяснить одним только снижением внутриклеточного уровня пАМФ. По-видимому существуют дополнительные факторы, контролирующие индуцибельный синтез. Другой путь воздействия глюкозы на активность катаболитных оперонов представляет собой ингибирование поступления индуктора в клетку. Как известно, индуктор необходим для удаления репрессора с операторной области ДНК (глава I). Глюкоза способна ингибировать транспорт многих субстратов, в том числе лактозы, арабинозы, мальтозы, необходимых для индукции соответствующих катаболитных оперонов /16,106/. Этот феномен называется "исключением индуктора" /64/. Таким образом глюкоза способна регулировать активность катаболитных генов либо, сникая уровень пАМФ в клетке, либо репрессируя перенос индуктора, необходимого для экспрессии соответствующего катаболитного оперона. Совокупность этих процессов (катаболитной репрессии и исключения ин-дуктора получила название "глюкозного эффекта" /64/. Основную роль в осуществлении "глюкозного эффнкта" играет система транспорта глюкозы в клетку /106,110/. Следует отметить, что кроме глюкозы катаболитную репрессию и "исключение индуктора" могут вызывать и другие утилизируемые и неутилизируемые субстраты: МГ, маннит, манноза, 2-дезоксиглюкоза, глюкозо-6-фосфат (так называемые катаболитные репрессоры).
Экспрессия лактозного оперона и внутриклеточная концентрация цАШ? у мутантов ptsi и ptsH
Б таблице 2 представлены данные, показывающие, что бактерии с одновременной утратой фі и Нрг имеют сниженный на 80% уровень пАШ? по сравнению с содерЕанием нуклеотида у бактерий pts t« Однако у делеционного мутанта A ptsH , полностью лишенного только белка Нрг количество цАШ? практически не отличается от такового у ptsf бактерий. Иная картина наблюдается при сравнении скоростей синтеза к -галактозидазы у бактерий A ptsH и ptsIH . Синтез фермента снижен у мутантов ptsIH nAptsH в равной степени. Следовательно, на основании полученных данных монно сделать вывод, что количество цАМФ не является основным фактором, определяющим снижение экспрессии катаболитных оперонов у мутанта д ptsH. Итак, у мутанта ptsH снижение скорости синтеза инду-цибельных ферментов не связано с изменением внутриклеточного уровня цАШ?. Однако, этот факт не является доказательством того, что у бактерий, шлеющих измененный в результате мутации ptsi фі, нарушение индуцибельного синтеза также не обусловлено снижением внутриклеточной концентрации цАШ. Содержание цАШ? в клетках бактерий Р" 1 существенно ниже, чем у бактерий pts (таблица 2, /41,87/). Для исследования вопроса о взаимосвязи концентрации пАШ в клетке и снижения , экспрессии катаболитных оперонов у бактерий ptsi было изучено влияние экзогенного цАМФ на синтез J3 -галактозидазы у двойного мутанта cyaptsi. У мутантов А суа (стр. 13 обзора литературы) отсутствует ген суа, что приводит к полному удалению цАМФ из клетки. Ранее в нашей лаборатории мутация А суа была совмещена с температуро-чувствительной мутацией, затрагивающей ген ptsi /I/. При не-пермиссивных условиях у таких мутантов фермент I инактивирует-ся, что приводит к проявлению pts фенотипа. В том шгучае, если действие мутации ptsi связано с изменением внутриклеточного уровня цАМФ, то повышение количества нуклеотида внутри бактерий, лишенных цАМФ и несущих мутацию ptsi, должно приводить к выравниванию скоростей синтеза ин-дуцдбельных ферментов у А суа pts + идсуа ptsi бактерий. Если же снижение индуцибельного синтеза у мутантов ptsi связано с другшл, отличным от цАШ? фактором, участвующем в регуляции транскрипции катаболитных оперонов, то независимо от количества нуклеотида в клетке скорость синтеза индуцибельных ферментов у мутантов л cyaptsi будет нине чем таковая у А суа pts бактерий.
Однако при изучении влияния экзогенного пАМФ, то есть нуклеотида, добавляемого в среду роста, на экспрессию любого оперона, возникает один существенный вопрос: попадает ли цАШ внутрь бактериальной метки? Напомним, что у граммотрицательных бактерий для проникновения любого вещества внутрь клетки необходимо преодолеть три барьера: наружную и внутреннюю клеточные мембраны и периплазма-тическое пространство, разделяющее эти две мембраны /II/. Обычно при изучении действия пАМФ или актиномицина Д на любые внутриклеточные процессы, бактерии предварительно обрабатывают ЭДТА. Это хелатообразующий агент, действие которого вызывает повреждение наружной клеточной мембраны бактерий /II/. После такой обработки, актиномицин Д, например, приобретает способность проникать внутрь бактерий. Мы исследовали влияние пАМФ (в конечной концентрации ОД мМ) на синтез -галактозидазы в присутствии ЭДТА и без него (рис. 6). Данные, представленные на рисунке 6 показывают, что цАШ стимулирует синтез & -галактозидазы у бактеррій л суа ptst в 10 раз за 120 минут индукции, тогда как без пАМФ активность к -галактозидазы в наших экспериментах практически не регистрировалась. При этом ЭДТА мало влиял на дифференциальную скорость синтеза & -галактозидазы в присутствии цАМФ. Таким образом, эти результаты показывает, что у бактерий д cyapts t Ц АШ проникает внутрь клетки как в случае предварительной обработки клеток ЭДТА, так и без него. В дальнейших экспериментах обработку клеток ЭДТА не производили. На рисунке 7 представлены кривые, отражающие зависимость дифференциальной скорости синтеза 1-галактозидазы от концентрации цАШ у cyapts + и cyaptsТ штаммов. Отметим, что выращивание ночных культур бактерий cyapts+ и л cyaptsl проводили в присутствии 0,5 мМ цАЖ . Без предварительного выращивания клеток с цАШ активность J -галактозидазы у описанных бактерий была чрезвычайно низкой, и с трудом поддавалась определению. Из рисунка 7 ясно, что независимо от концентрации цАШ? в среде роста, скорость синтеза j -галактозидазы у мутанта Л cyaptsl существенно ниже, чем у клетокд cyaptst« Таким образом, представленные результаты еще раз показывают, что действие мутаций P"ts на выражение катаболитных оперонов проявляется даже при наличии в цитоплазме бактерий достаточного количества цАШ. Прежде чем подводить окончательный итог, следует рассмотреть вопрос о взаимосвязи концентрации экзогенного цАШ? и количества нуклеотида внутри клетки.
При сравнении двух различных штаммов всегда имеется вероятность того, что мембрана одного мутанта более проницаема для цАШ, чем мембрана другого штамма. Однако, в случае л cyapts n cyaptsi бактерий: а) мы имеем дело с изогенными штаммами, б) как видно из данных, представленных на рис.7, при повышении концентрации цАМФ в среде выше I мМ наблюдается выход кривых, отражающих зависимость скорости синтеза (ь-галактозидазы от концентрации цАМФ, на плато. Эти данные указывают, что дальнейшее повышение количества нуклеотида вне клетки, а следовательно и внутри, не изменяют скорости индукции р -галактозидазы. Однако и в этих насыщающих условиях наблюдается существенное снижение скорости синтеза -галактозидазы у мутанта Л cyaptsl по сравнению с уровнем фермента A cyaptst штамма. Таким образом, в заключение можно сделать вывод, что подавление экспрессии Iac-оперона у мутанта ptsi не связано с изменерием концентрации пАШ? в клетке. 2.4. Экспрессия триптофаиазного оперона у мутанта ptsi в присутствии мультикопийной плазмиды, несущей ген аденилатциклазы Мы исследовали влияние плазмиды P G 10, несущей ген суа и изменяющей количество АЦ в клетке, на скорость синтеза -триптофаназы у мутантов ptsi. Для получения достоверных результатов об изменении скорости синтеза индуцибельных ферментов у мутантов ptsi в присутствии плазмиды pTGIO, необходимо было убедиться в том, что после трансформации у этих бактерий(ptsi) сохранен в составе плазмиды ген суа. Сохранность вставки суа в плазмиде ріюЮ у трансформантов определяли двумя способами: 1) Путем анализа резистентности к антибиотикам.Известно, что плазмида pBR322 несет устойчивость к двум антибиотикам: ампициллину и тетрациклину. Ген суа встроен в тетрациклиновый сайт плазмиды pBR322, что приводит к чувствительности клонов, несущих плазмиду pffilO к тетрациклину /6/. Все трансформированные pTGio плазмидой клоны оказались чувствительными к тетрациклину. 2) Путем измерения активности А Ц у трансформантов, содержащих плазмиды pBR322 и pTGio. Клоны, несущие плазмиду pBR322, имели активность АЦ в 10 раз меньшую по сравнению с уровнем фермента у pTGio трансформантов (47,5 и 452 шлоля пАШ? на мг белка в минуту соответственна). Известно, что у мутантов ptsi резко снижена активность АЦ по сравнению с уровнем фермента у бактерий ptst /4,25,41,52, 81,87/. При введении плазмиды pTGio , несущей ген АЦ,наблюдает- ся выравнивание актішностєй АЦ у бактерий pto+ и ptsi 452- 457 нмоля цАШ? на мг белка в минуту у обоих штаммов. В таблице 3 представлены данные об утилизации глюкозы, фруктозы, маннита, маннозы (ФТС-углеводы) и мальтозы, глицери- на (не ФТС углеводы) клетками дикого типа pts и мутантами ptsi в присутствии плазмид pBR 322 и pTG 10.
Скорость синтеза к -галактозидазы и ь -трип-тофаназы у мутанта ptsH в присутствии мутации
Из результатов главы 3 экспериментальной части следует, что действие мутаций pts связано с процессом инициации транскрипции и опосредуется комплексом цАМФ-САР. Вопрос о взаимосвязи внутриклеточной концентрации цАМФ и снижения л экспрессии катаболитных оперонов у мутантов pts рассмотрен в главе 2. Ясно, что снижение индуцибельного синтеза у разных мутантов pts не связано с изменением внутриклеточного уровня цАШ. Можно предположить, что точкой приложения действия мутаций pts является САР. Если это действительно так, то изменение состояния этого белка в результате мутационного повреждения, должно приводить к повышению или, наоборот, к понижению экспрессии катаболитных оперонов у мутантов pts. В нашей работе была использована хорошо изученная мутация, затрагивающая САР, так называемая сгр /ЭЭ/. В качестве источника мутации pts был взят AptsH мутант с полной утратой Нрг. Мутация, затрагивающая именно Нрг , а не фі, взята нами не случайно, у таких мутантов не снижен уровень цАМФ в клетке (глава 2 экспериментальной части). Была создана серия изогенных штаммов с совмещенными мутациями ptsH и crps (раздел "Материалы и методы"). Исследование утилизации ФТС и не ФТС субстратов бактериями, несущими делецию по гену ptsH , в присутствии мутации сгрж показало, что введение мутационно поврежденного САР не восстанавливает способности мутантовAptsH утилизировать ФТС субстраты.
Однако такие мутанты приобретают способность использовать в качестве источника углерода мальтозу, лактозу. Мутанты же ptsH не содержащие мутантный САР, такой способностью не обладают /89,110/. Таким образом, изменение,. САР приводит к частичной супрессии pts фенотипа, выражающееся в способности использовать суб-страты,для утилизации которых необходима работа катаболитных генов. Однако данных по супрессии роста на не ФТС субстратах мутантов ptsHcrp5 недостаточно, чтобы сделать вывод о действии измененного САР на индуцибельный синтез у мутанта д ptsH. Нами была исследована экспрессия лактозного и триптофаназного оперонов у мутанта д ptsH в присутствии мутации сгр и интактного гена ci"P . Таблица II представляет данные, отражающие дифференциальную скорость синтеза к-галактозидазы и ь -триптофаназы у таких мутантов. Таблица II Скорость синтеза jb -галактозидазы и ъ-триптофаназы у мутанта ptsH в присутствии мутации сгр ОЙПЧНЯТТРНИР Скорость синтеза Скорость синтеза ррйтття А-галактозидазы ь-триптофаназы i«Huimid (нмоли о-нитрофенола (пмоли индола мг .мин при 30С) "мг мин при 37С) Температура индукции 42С 30С 37С 30С ptst crpt 1390 2760 47 68 AptsH crpt 1450 1530 56 40 pts+ сгрй 1230 2000 48 47,6 A ptsH crps 2700 3430 48,9 67,2 Очевидно, что при 30 наблюдается снижение скоростей синтеза & -галактозидазы и ь -триптофаназы у мутанта A ptsHcrp по сравнешш с уровнями синтеза ферментов у дикого типа. Введение мутации сгр приводит к полной супрессии синтеза j -галактозидазы и Ь -триптофаназы у л ptsH мутанта. Мы исследовали ДЄЙСТВРІЄ мутаций сгрй и AP SH при 30С, а не при 37, как в случае изучения других штаммов. Этот факт связан с особыми свойствами штамма СНЕ 25, который был взят за основу при создании серии изогенных штаммов (табл.10). Нами было обнаружено, что этот штамм содержит неидентифицированнуи температурочувствительнуїо мутацию, приводящую к восстановлению синтеза индуцибельных ферментов у мутантовдріБН до уровня, характерного для бактерий pts+ при непермиссивной температуре (37С-42С, табл.11). Таким образом на основании данных главы 4 можно сделать вывод о том, что мутационное повреждение САР приводит к полному восстановлению скорости синтеза индуцибельных ферментов у мутанта A ptsH.
Предыдущие исследования in vivo показали, что действие мутаций pts связано с изменением эффективности транскрипции катаболитных оперонов, а именно, с изменением активности комплекса цАМФ-САР. Следующим этапом исследования явилось изучение действия компонентов ФТС на экспрессию катаболитных оперонов in vitro. В качестве источника мутации pts использовали мутант ptsiH (табл.12), у которого нарушен синтез фі и Нрг однов-ременно. Причем в экстрактах этого мутанта активность фі и Нрг практически не обнаруживается (персональное сообщение Эпштей-на). На рисунке 10 представлены кривые, отражающие зависимость синтеза РНК от количества белка в s 30 экстрактах бактерий pts и ptslH . Видно, что прирост включения метки по отношению к приросту белка сходен для обоих экстрактов. Аналогичные результаты получены при исследовании синтеза белка (включение меченого лейцина) в экстрактах из бактерий pts t и ptslH (рисунок II). Следует отметить, что на рис.10,II представлены кривые, отражающие независимый от цАШ синтез РНК и белка. Этот факт связан с тем, что сами s ЗО экстракты лишены цА1#, так как нуклео-тид удаляется из экстрактов в процессе их выделения. Следовательно, представленные результаты указывают, что независимый от пАМФ синтез РНК и бежа в экстрактах бактерий pts4" не отличается от такового в экстрактах мутанта ptslH. В заключении этого раздела необходимо отметить, что результаты, представленные на рис.10 и II, отражают один из типичных опытов по исследованию s 30 экстрактов из pts + и ptslH клеток. При получении экстрактов из бактерий дикого и мутантного типа, выращенных в разное время, можно получить экстракты, обладающие как высокой, так и низкой активностями в синтезе РНК и белка. Поэтому для получения достоверьшх данных потребовалось большое количество экспериментов по выделению и анализу s 30 экстрактов (более 10) (рисунок 10,11). На основании этих данных мы пришли к выводу, что сравнение абсолютных активностей s 30 экстрактов различных мутантов в бесклеточной системе затруднено и требует большого статистического набора данных. Поэтому в дальнейшем мы не сравнивали абсолютные активности экстрактов из различных мутантов.
