Содержание к диссертации
Введение
1. Список сокращений. 5
2. Введение. 7
3. Обзор литературы. 10
1. Репродуктивно-респираторный синдром свиней. 10
2. Биологические характеристики вируса РРСС. 13
2.1. Морфология и физические свойства вируса. 13
2.1.1. Структура вириона вируса РРСС. 13
2.1.2. Структура генома вируса РРСС. 14
2.1.3. Вирусные белки. 15
2.1.4. Устойчивость к воздействию различных факторов. 21
2.1.5. Нуклеокапсидный белок. 21
2.2. Классификация вируса РРСС. 25
2.3. Гуморальный и клеточный иммунный ответ организма при инфекции вирусом РРСС. 25
2.4. Патогенез и патология РРСС. 26
2.5. Культивирование вируса РРСС. 31
2.6. Эпизоотология РРСС. 32
3. Меры борьбы и профилактики РРСС. 34
3.1. Неспецифическая профилактика РРСС. 34
3.2. Вакцинация против вируса РРСС. 36
4. Диагностика РРСС. 40
1 Заключение по обзору литературы. 44
2 Материалы и методы исследования. 46
3 Штаммы вируса РРСС, клеточные линии. 46
4 Моноклональные антитела. 46
5 Сыворотки. 46
6 Маркеры молекулярного веса. 47
7 Наборы.
8Ферменты. 47
9 Праймеры. 47
10 Плазмитдные векторы. 48
11 Выделение РНК из культуры клеток. 49
12 Проведение ОТ-ПЦР. 49
13 Электрофорез ДНК в агарозном геле. 51
14 Очистка фрагментов ДНК в агарозном геле с Nal. 51
15 Рестрикция.
16 Лигирование.
17 Приготовление ростовых сред для Е.coli. 52
18 Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК и лигазными смесями. 52
19 Выделение плазмидной ДНК. 54
20 Определение нуклеотидных последовательностей и их анализ. 54
21 Индукция экспрессии гена ORF7. 54
22 Экспрессия гена ORF7 в культуре клеток насекомых. 55
23 Выделение рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rN) методом металлоаффинной хроматографии. 56
24 ДСН-ПААГ. 58
25 Иммуноблот. 58
26 Непрямой иммуноферментный анализ (ИФA) rN. 59
27 Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА) антител к rN в сыворотках крови свиней. 59
28 Статистические расчеты и графики. 60
29 Результаты исследований. 61
5. Анализ сывороток из хозяйств России и республики Беларусь на присутствие антител к вирусу РРСС. 61
2. Создание генноинженерных конструкций для экспрессии генов нуклеокапсидного белка американского и европейского типов вируса РРСС в клетках насекомых. 61
2.1. Амплификация генов нуклеокапсидного белка (ORF7). 61
2.2. Получение рекомбинантных донорных плазмид для бакуловирусной системы экспрессии, несущих ген ORF7. 64
2.3. Определение нуклеотидной последовательности клонированных генов ORF7, кодирующих нуклеокапсидный белок. 64
2.4. Получение рекомбинантного бакуловирусного генома, несущего ген ORF7. 66
3. Создание генноинженерных конструкций для экспрессии генов нуклеокапсидного белка американского и европейского типов вируса РРСС в системе экспрессии в Е.соИ. 70
3.1. Амплификация генов нуклеокапсидного белка (ORF7). 70
3.2. Получение рекомбинантных экспрессионных плазмидных векторов для системы экспрессии в клетках Е.соИ, несущих гены ORF7. 70
3.3. Определение нуклеотидной последовательности клонированных генов ORF7. 70
3.4. Экспрессия генов нуклеокапсидных белков вируса РРСС американского и европейского типов вЕ.соїі.
4. Очистка и характеристика рекомбинантных нуклеокапсидных белков. 71
4.1. Выделение рекомбинантных нуклеокапсидных белков вируса РРСС из клеток насекомых. 73
4.2. Выделение рекомбинантных нуклеокапсидных белков вируса РРСС из Е.соИ. 74
4.3. Иммунохимический анализ рекомбинантных продуктов. 75
4.4. Определение оптимального количества рекомбинантных нуклеокапсидных белков для их использования в качестве антигенов в неппямом TRermorimwoM ИФА. непрямом твердофазном ИФА. 75
5. Сравнение антигенной активности рекомбинантных белков нуклеокапсида американского и европейского типов вируса РРСС и рекомбинантных белков одного типа, полученных в разных системах экспрессии, в реакциях непрямого ИФА с сыворотками крови иммунных и неиммунных свиней. 77
6. Сравнение результатов применения рекомбинантных нуклеокапсидных белков в качестве антигена в непрямом ИФА с результатами применения коммерческой тест-системы фирмы IDEXX для анализа сывороток крови иммунных и неиммунных свней. 80
1. Сравнение разработанной тест-системы с тест-системой IDEXX в реакциях непрямого ИФА с сыворотками крови иммунных и неиммунных свиней и оценка «отсекающего» значения коэффициента связывания (Ксв). 82
1.1. Определение отсекающего значения коэффициента связывания. 83
2. Сравнение разработанной тест-системы с тест-системой IDEXX в реакциях непрямого ИФА с полевыми сыворотками. 84
7. Сравнение разработанной тест-системы с тест-системой IDEXX в реакциях непрямого ИФА с сыворотками крови иммунных и неиммунных свиней и оценка «отсекающего» значения коэффициента связывания (Ксв). 84
1. Испытание разработанной тест-системы на широкой выборке полевых сывороток. 85
2. Обсуждение. 86
Выводы. 100
- Классификация вируса РРСС.
- Выделение РНК из культуры клеток.
- Получение рекомбинантных донорных плазмид для бакуловирусной системы экспрессии, несущих ген ORF7.
- Сравнение разработанной тест-системы с тест-системой IDEXX в реакциях непрямого ИФА с полевыми сыворотками.
Введение к работе
Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) - инфекционное вирусное заболевание, которое вспыхнуло в году в Северной Америке (Keffaber, ; Bilodeau et al., ), а затем в Европейских странах (Paton et al., ; Baron et al., ). К настоящему времени репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) широко распространен в большинстве стран с развитым свиноводством, исключение составляют лишь Швейцария и Новая Зеландия (Seuberlich et al., ).
В ряде стран вирус РРСС признан самым экономически значимым для свиноводства патогеном (Meng, ). Так, в США до % экономических потерь свиноводства, связанных с инфекционными заболеваниями, обусловлены вирусом РРСС. Существенный ущерб свиноводству приносят прежде всего мертворождение, аборты, гибель поросят и снижение опоросов. Для РРСС характерна высокая контагиозность, способность к длительной бессимтомной персистенции, что осложняет контроль и борьбу с заболеванием.
Возбудитель принадлежит к роду Arterivirus семейства Arteriviridae. Вирус РРСС представлен двумя типами, имеющими примерно % гомологи по нуклеотидной последовательности, - американским и европейским. Американские изоляты имеют более высокую вирулентность. С года, после применения в Дании живых вакцин против РРСС на основе вируса американского типа, американские изоляты появились на территории западной Европы (Bother et al., ; Madsen et al., ), они встречаются так же в Китае и Японии (Shibata et al., ; Tong et al., ). Описано появление европейских изолятов на территории США. В России циркулирует вирус европейского типа, который присутствует в российских хозяйствах с года. До последнего времени не существовало полных данных по распространенности этого заболевания на территории нашей страны.
В России до недавнего времени отсутствовали средства для диагностики и эпизоотического мониторинга РРСС, разработка которых в условиях экспансии вируса по территории нашей страны представляется крайне актуальной. Серологические методы исследования представляются наиболее удобными для контроля за распространением вируса, так как персистенция вируса может протекать бессимтомно, РНК вируса в сыворотке крови не всегда обнаруживается, но присутствуют антитела к вирусу РРСС. В этих условиях крайне важной задачей была разработка отечественной тест-системы на основе ИФА для определения антител к вирусу РРСС.
Культивирование вируса сопряжено с рядом сложностей. Многие изоляты размножаются только в первичной культуре альвеолярных макрофагов, изоляты европейского типа накапливаются в низких титрах. Не все первичные культуры альвеолярных макрофагов оказываются чувствительными к вирусу. Таким образом, затруднено получение вирусных антигенов, которые можно было бы использовать в качестве специфических компонентов диагностических тест-систем на основе иммуноферментного анализа. В этих условиях актуальной задачей является получение рекомбинантных антигенов для использования в качестве компонентов тест-системы на основе метода иммуноферментного анализа (ИФА). В нашей работе была поставлена задача получения рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса РРСС и разработки на его основе тест-системы для определения антител к вирусу РРСС.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы была разработка технологии получения рекомбинантных нуклеокапсидных антигенов вируса РРСС и создание на их основе иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в сыворотке крови животных.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести предварительные исследования распространенности вируса РРСС на территории России и Белоруссии.
2. Разработать технологию и получить рекомбинантные нуклеокапсидные белки вируса РРСС американского и европейского типов.
3. Методом непрямого твердофазного ИФА сравнить между собой антигенную активность полученных рекомбинантных продуктов с использованием сывороток крови, полученных от иммунных и неиммунных животных.
4. Охарактеризовать рекомбинантные белки при их использовании в ИФА в качестве антигенов и сравнить результаты с результатами, полученными при использовании коммерческого ИФА-набора аналогичной направленности (IDEXX, США).
5. Разработать на основе полученных и охарактеризованных рекомбинантных антигенов иммуноферментную тест-систему для выявления антител к вирусу РРСС.
6. Определить диагностическую ценность разработанной тест-системы с использованием панели референтных положительных и отрицательных сывороток крови.
7. Внедрить разработанную тест-систему в ветеринарную практику.
Классификация вируса РРСС.
Методом непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания вирусный антиген обнаруживается в альвеолярных макрофагах инфицированных животных уже через 2 дня после заражения, сывороточные антитела появляются к 14 дню. Наблюдается быстрый рост количества сывороточных антител, не способных к нейтрализации вируса. Нейтрализующие антитела появляются позднее, обычно не ранее 21 дня после заражения (Ostrowski et al., 2002). Вирус может быть выделен из сыворотки больных животных в промежутке от 2 до 21 дня после инфицирования, а из бронхоальвеолярных смывов вплоть до 7 недели (Shibata et al., 1997). Метаболическая активность лимфоидных клеток крови наблюдается на третий день после инфицирования. К 10 дню обнаруживаются В-клетки, секретирующие антитела, количество этих клеток продолжает расти вплоть до 2 месяцев с момента заражения. Пик содержания специфических антител в крови приходится на 45 день после инфекции (Lamontagne et al., 2001). Все артеривирусы способны вызывать персистентную инфекцию, длительность которой для вируса РРСС составляет обычно 2-3 месяца (Shnider and Meulenberg, 1998). В лимфоузлах и миндалинах РНК вируса обнаруживается методом ПНР до 210 дней после заражения. До сих пор точно неизвестен механизм, благодаря которому артеривирусы ускользают от иммунного ответа хозяина. Известно, что иммунные комплексы вириона и антител могут даже усиливать инфекцию. In vitro вирус-специфические антитела увеличивали накопление вирусных частиц в макрофагах (Yoon et al., 1996, 1997). Механизм персистенции вируса в организме животного непонятен. Гуморальный иммунный ответ организма на инфекцию вируса РРСС неэффективен. Наблюдается поликлональная активация В-лимфоцитов в лимфоидных органах, их количество растет и обнаруживаются вирус-специфические антитела в крови. Однако, это не препятствует персистенции вируса в лимфоидных органах (Lamontagne et al., 2001). 2.4. Патогенез и патология РРСС. Изоляты вируса РРСС различаются между собой по патогенности для свиней (высоко-, слабо- и апатогенные), действию на клетки и ткани (цито- и нецитолитические), степени и возможности их репродукции в разных системах культивирования, по выраженности бляшкообразования (крупно-, средне- и мелкобляшечные), антигенности. Были описаны значительные различия в вирулентности разных штаммов РРСС, проявляющиеся как в тяжести респираторных проявлений, так и репродуктивных нарушений (Halbur et al., 1995; Mengeling et al., 1996). Были описаны апатогенные штаммы РРСС (Oblinger et al, 1992; van Alstine et al., 1992). Этим в определенной мере объясняется различное проявление болезни у свиней разных пород и возрастных групп.
Проявления заболевания варьируют от субклинических форм до острого течения с летальным исходом (Shnijder and Meulenberg, 1998; Goldberg et al., 2000). РРСС считается самым вариабельным по клиническим проявлениям заболеванием свиней. Респираторная форма инфекции поражает животных всех возрастных групп, клинические проявления варьируют от средней до острой интерстициальной пневмонии (Goldberg et al., 2000). Инфекция может быть как субклинической, так и приводить к гибели иммунологически зрелых животных (Mengeling et al., 1998). Различие патогенных свойств различных изолятов вируса РРСС является следствием различий нуклеотидных последовательностей их геномных РІЖ. Высокая изменчивость генома, характерная для вируса РРСС, играет важную роль с точки зрения его патогенных свойств, изменяя их и приводя к появлению большого количества штаммов с различной вирулентностью (Oblinger et al., 1992; van Alstine et al., 1992; Halbur et al., 1995; Mengeling et al., 1996). Интересны наблюдения, показавшие, что при длительной (до 150 дней) персистенции в организме животного в геноме вируса РРСС накапливаются мутации, основная часть которых приходится на область, кодирующую эктодомен GP5, который играет основную роль во взаимодействии вируса с клеткой (Allende et al., 2000). Для вируса РРСС, как и для других артеривирусов, характерна персистенция в организме животного, которая может протекать бессимптомно, при этом животное является носителем инфекции и может заражать здоровых свиней. (Albina et al., 1994; Christopher-Hennings et al., 28 1995; Plagemann, 1996; Wills et al., 1997; Allende et al., 2000; Beyer et al., 2000; Hotter et al., 2002). Персистенция вируса наблюдается в лимфоидных органах и легких животных (Beyer et al., 2000), он может персистентно присутствовать в сперме инфицированных хряков (что обуславливает наличие половой передачи инфекции), вирусную РНК и антигены обнаруживают в фолликулах яичников (Sur et al., 2001). Таким образом, персистентная инфекция РРСС играет важнейшую роль в передаче и выживании вируса в свиной популяции, создавая затруднения для контроля за распространением вируса. Для предотвращения распространения вируса, контроля за ним или его искоренения необходимы дальнейшие исследования, направленные на изучение стадии бессимптомного носительства (Hotter et al., 2002). Механизмы патогенеза вируса РРСС все еще недостаточно ясны, несмотря на большое количество работ, посвященных этой проблеме. Предполагается, что воротами инфекции является эпителий носовой полости, миндалины и легочные макрофаги (Meng, 2000). Вирус РРСС реплицируется в этих клетках, вызывая виремию и, как следствие, пневмонии, миокардиты, энцефалиты, риниты, васкулиты, лимфоаденопатию и прочие проявления в органах-мишенях (Rossow et al., 1995, 1996). Вирус РРСС повышает восприимчивость организма к другим возбудителям, что было показано в экспериментах с заражением свиней Streptococcus suis типа 2, вызывающего менингит. Клинический гнойный менингит, сопровождающийся бурным ростом S. suis, наблюдался только в том случае, если свиньи были предварительно инфицированы вирусом РРСС (Galina et al., 1994).
Показано, что вирус РРСС участвует в развитии других вирусных инфекций, что особенно хорошо изучено на примере цирковируса свиней типа 2, вызывающего постотъемный мультисистемный синдром истощения у поросят (Segales and Domingo, 2002). Другие исследователи показали, что у свиней, инфицированных вирусом РРСС за четыре дня до заражения гриппом А или респираторным короновирусом, происходит усиление этих заболеваний. Вторичные инфекции значительно увеличивают экономические потери от заболевания РРСС, их присутствие оказывает сильное влияние на смертность новорожденных поросят (Feng et al., 2001; Halbur et al., 2000). Условия содержания свиней до заражения вирусом, организация их содержание и путь, которым вирус проник в стадо, так же оказывают влияние на выраженность клинических проявлений вируса РРСС (Goldberg et al., 2000). По данным некоторых исследователей европейские изоляты вируса РРСС сами по себе вообще не способны вызывать респираторные расстройства у гнотобиотных животных. Тем не менее, его важная роль в качестве одного из этиологических агентов многофакторного респираторного заболевания у свиней не вызывает сомнений (van Gucht et al., 2003). Длительность инкубационного периода составляет от 4-5 до 14-37 дней (с момента контакта с инфекционным агентом до появления первого клинического признака) (Done et al., 1996). Такие широкие пределы изменчивости инкубационного периода являются следствием как различной патогенности штаммов вируса РРСС, так и дозы вируса и пути заражения. Экспериментально зараженные полугодовалые серонегативные поросята заболевали на второй день после контакта с больным животным (Wensvoort et al., 1991). Репродуктивные симптомы обычно проявляются не ранее 25 дня после заражения. В течении 5 и более недель после заражения вирус выделяется из легких, плазмы, сыворотки и цельной крови при совместной циркуляции с антителами (Paton et al., 1992). У хряков, переболевших РРСС, наблюдается импотенция и ухудшение качества спермы. Инфицированные свиньи становятся виремичными в течение 24 часов после заражения. При заражении супоросных свиноматок происходит снижение жизнеспособности новорожденных поросят (Terpstra et al., 1991; Christianson et al., 1992; Dea et al., 1992; Plana Duran et al., 1992). Постнатальное заражение поросят чаще всего вызывает умеренное заболевание, завершающееся полным выздоровлением. Заражение через плаценту возможно на ранней стадии супоросности.
Выделение РНК из культуры клеток.
Реакция проводилась в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5-7 мкл РНК, 10 pmol Random праймера, 0.25 птМ каждого dNTP, 50 ед. М-МЬУ(АМУ)-ревертазы, 50 mM Tris-HCl, 40 тМ КС1, 10 тМ DTT, 7 тМ MgCl2- Объем доводили водой до 25 мкл. Температурные условия проведения реакции обратной транскрипции. Реакция проводилась при 49С в течение 45 минут. Приготовление реакционной смеси для проведения ПЦР. Реакция проводилась в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5-7 мкл ДНК, 10 pmol каждого праймера, 0.25 тМ каждого dNTP, 1.25 ед. Taq-полимеразы, 10 тМ Tris-HCl (рН=9.0), 50 тМ КС1, 0.1% Triton Х-100, 1.5 тМ MgCl2. Объем доводили водой до 25 мкл. Для второго раунда ПЦР использовали 3-5 мкл продукта, полученного после первого раунда. Приготовление реакционной смеси для проведения ОТ-ГШР в одной пробирке. Реакция проводилась в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5-7 мкл ДНК, 10 pmol каждого праймера, 0.25 шМ каждого dNTP, 1.25 ед. Taq-полимеразы, 50 ед. М-МЬУ(АМУ)-ревертазы 10 mM Tris-HCl (р№=9.0), 50 тМ КС1, 0.1% Triton Х-100, 1.5 тМ MgCl2, Объем доводили водой до 25 мкл. Для второго раунда ПЦР использовали 3-5 мкл продукта, полученного после первого раунда. Температурные режимы циклов ПНР. Для пар праймеров F7-R7, EuroF7-EuroR7, AmerF7-AmerR7, EuroBacF-EuroR7 и AmerBacF-AmerR7 использовали следующий температурный режим: 1). Пять затравочных циклов 94С - 45 сек., 50С - 45 сек., 72С - 60 сек.; 2). Двадцать пять основных циклов 94С - 30 сек., 55С - 30 сек., 72С -50 сек.; 3). Один завершающий цикл 72С 60 сек. Для пар праймеров EuroBacF-M13R и AmerBacF-M13R использовали следующий температурный режим: 1). Пять затравочных циклов 94С - 45 сек., 50С - 45 сек., 72С - 90 сек.; 2). Двадцать пять основных циклов 94С -30 сек., 55С - 30 сек., 72С - 60 сек.. Для проведения ОТ-ПЦР в одной пробирке использовались те же температурные режимы, но вводился дополнительный цикл ОТ (49С - 45 минут, 95 С - 5минут) перед затравочными циклами. Электрофорез ДНК в агарозном геле.
Для анализа фрагментов ДНК методом гель-электрофореза наносили по 7 мкл ГЩР продуктов (или по 1-2 мкл очищенной плазмидной ДНК) на 1% (при длине фрагмента более 1000 пн) - 2% (при длине фрагмента менее 1000 пн) агарозный гель и разделяли электрофорезом, используя Трис-ацетатный буфер, содержащий бромистый этидий в концентрации 0.4-0.5 мкг/мл. Электрофорез проводили в режиме 8 В/см в течение 30 минут. Гели анализировали, используя трансиллюминатор с ультрафиолетовым светом с длинной волны 254 нм. Фотографирование гелей осуществлялось на включенном трансиллюминаторе фотокамерой Полароид с оранжевым светофильтром. Очистка фрагментов ДНК в агарозном геле с Nal. Электрофорез проводили при описанных выше условиях. Затем вырезали фрагмент геля, содержащий ДНК, используя трансиллюминатор с ультрафиолетовым светом с длинной волны 254 нм, на который положена стеклянная пластина. Вырезанные фрагменты агарозы с ДНК помещали в микроцентрифужные пробирки, затем к ним добавляли 0.7-1 мл Nal и инкубировали при 37С до полного растворения агарозы. Затем в пробирки добавляли 5-10 мкл сорбента (glassmilk или силика), тщательно размешивали и инкубировали в течение 0.5-16 часов при периодическом помешивании. Затем центрифугировали 30 секунд, 13000 об/мин, удаляли надосадок. Промывали осадок 75% этанолом и, не подсушивая, элюировали ДНК с сорбента буфером ТЕ. Приблизительную концентрацию выделенного фрагмента ДНК определяли методом гель-электрофореза при стандартных условиях. Выделенный фрагмент ДНК можно использовать для секвенирования или для рестрикции. Рестрикция. Для аналитических целей рестрикция проводилась в конечном объеме 20 мкл.
Реакционная смесь содержала 5-10 мкл ДНК, 0.5-1 мкл рестриктаз ВатШ и Hindlll, 2 мкл буфера (Yellow+, Fermentas). Объем доводили водой до 20 мкл. Реакциию инкубировали 1 час при 37С. Для препаративных целей рестрикция проводилась в конечном объеме 100 мкл. Реакционная смесь содержала 30-50 мкл ДНК, 2-4 мкл каждой рестриктазы, 10 мкл буфера (Yellow+, Fermentas). Объем доводили водой до 100 мкл. Реакцию инкубировали 1 час при 37С. Лигирование. Реакция проводилась в конечном объеме 10 мкл. Реакционная смесь содержала 5-7 мкл ДНК вставки, 0.5-1 мкл вектора, 1 мкл лигазы Т4, 1 мкл десятикратного реакционного буфера. Объем доводили водой до 10 мкл. Реакция инкубировалась 10-12 часов (ночь), при 16С или 1 час при температуре 21 С в водном термостате (LKB, Швеция). Приготовление ростовых сред ДЛЯ Е.СОІІ. Приготовление среды SOC, LB и L-arapa проводили в точности согласно методике, описанной в (Sambrook et al., 1989). Среды готовили в стеклянных банках с градуировкой и завинчивающейся крышкой на 250 и 500 мл. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК и лигазными смесями. Получение компетентных клеток. Клонировочные штаммы: Свежую колонию клеток Е. соН (Тор Теп или DH5a) пересевали простерилизованной в пламени вольфрамовой петлей в 10 мл среды "LB", растили в течение ночи. Пересевали 1 мл ночной культуры в 9 мл среды "LB" и инкубировали при 37С с хорошей аэрацией, контролируя величину оптической плотности культуры. Оптическую плотность определяли спектрофотометрически при А,=600 нм, по достижении середины логарифмической фазы роста оптическая плотность составляла 0.4-0.6 ОЕ. Затем культуру переносили в центрифужные пробирки и охлаждали во льду. Клетки осаждали центрифугированием на центрифуге "Sorvall" (США) при 1000 g (-3000 об/мин) в течение 15 мин при +4С. К осадку добавляли 20 мл 0.1 М СаС12. Клетки ресуспендировали и инкубировали во льду 30 минут, затем центрифугировали при 1000 g (-3000 об/мин) в течение 15 мин при +4С. Тщательно удаляли супернатант.
Клетки ресуспендировали в 1 мл 0.1 М СаС12, инкубировали на льду от 2 до 12 часов, затем добавляли к ним стерильный глицерин (99,9%) до концентрации 15%. Клетки расфасовывали по 100 мкл в стерильные полипропиленовые пробирки и хранили при -70С. Экспрессионные штаммы: Компетентные клетки из экспрессионных штаммов Е. Coli (BL-21, BL-21 (DE-3) pLysS, BRL (DE-3) pLysS) готовили, используя ту же самую методику, что и для клонировочных штаммов. Трансформация компетентных клеток. Компетентные клетки помещали в лед, как только они оттаивали, к ним вносили 1-2 мкл плазмидной ДНК или 5-10 мкл Лигазной смеси. После инкубации в течение получаса на льду клетки подвергали тепловому шоку (45 секунд при 42С), затем ставили их на лед на 2-3 минуты. После чего добавляли 600 мкл среды SOC и инкубировали в течение часа (в случае использования клеток DHlOBac - в течение по меньшей мере 4 часов) при 37С. Затем трансформационные смеси высевали на чашки, содержащие соответствующие антибиотики: ампициллин 100 мкг/мл; ампициллин 100 мкг/мл и гентамицин 7 мкг/мл; гентамицин 7 мкг/мл, канамицин 50 мкг/мл и тетрациклин 100 мкг/мл. В дальнейшем производили учет роста колоний и проводили проверку на наличие вставки. Для выделения плазмидной ДНК проводили пересев колоний в жидкую среду (по 10 мл на колонию в пластиковых пробирках, Falcon) LB, содержащую те же антибиотики, что и чашка Петри, с которой пересеяны колонии. Выделение плазмидной ДНК. Для выделения плазмидной ДНК использовали набор фирмы Promega DNA Purification System, WizardPlus, SV Minipreps. Выделение проводили в соответствии с наставлением производителя. Определение первичных нуклеотидных последовательностей и их анализ. Для секвенирования по двум цепям использовали те же праймеры, что и для проведения ПНР. Для определения первичной нуклеотидной последовательности были использованы автоматические машины ABI Prism (ABI, США), принцип действия которых заключался во встраивании флуоресцентно меченных дидезоксинуклеотидов, терминирующих синтез цепи. Для анализа полученных первичных нуклеотидных последовательностей был использован пакет программ ДНК-анализа для платформы Macintosh: Mac Vector, MegAlign, EditSeq. Индукция экспрессии гена ORF7. Компетентные клетки экспрессионного штамма Е. coli BRL (DE-3) pLysS трансформировали рекомбинантной плазмидой, содержащей с ген ORF7 вируса РРСС.
Получение рекомбинантных донорных плазмид для бакуловирусной системы экспрессии, несущих ген ORF7.
Первым шагом на пути создания рекомбинантного бакуловирусного генома является получение донорной плазмиды pFastBacHTa, несущей ген ORF7. Донорная плазмида включает в себя так называемую экспрессионную кассету с сайтом для клонирования чужеродных генов, которая фланкирована последовательностями транспозона Тп7. Методом рестрикции-лигирования амплифицированный фрагмент ДНК встраивали в донорную плазмиду. Лигазной смесью трансформировали E.coli, полученные клоны проверяли методом ПЦР и рестрикционным анализом (рисунок 4). Видно, что вырезавшиеся фрагменты ДНК расположены в геле ниже полосы 564 н.п. маркера молекулярного веса, соответствуя по размеру генам нуклеокапсида европейского (403 н.п.) и американского (388 н.п.) типов вируса РРСС. Схема рекомбинантной плазмиды pFastBacHTa/ORF7 приведена на рисунке 6а. Отобранные по рестрикционному анализу клоны использовали для определения нуклеотидной последовательности гена ORF7. 2.3. Определение нуклеотидной последовательности клонированных генов ORF7, кодирующих нуклеокапсидный белок. Полученные генноинженерные конструкции, несущие последовательности генов нуклеокапсидного белка американского и европейского типов вируса РРСС, были секвенированы. Установлено, что Использованная нами система Baco-Bac отличается от классической бакуловирусной системы экспрессии одной значительной особенностью -получение рекомбинантного бакуловирусного генома происходит в E.coli, где геном бакуловируса находится в виде минихромосомы - бакмиды. Выделенная из E.coli ДНК рекомбинантного бакуловируса инфекционна и непосредственно используется для заражения клеток насекомых и получения в них экспрессии чужеродного гена. Это исключает стадию отбора рекомбинантных бакуловирусов на культуре клеток насекомых и упрощает работу исследователя.
Рекомбинантные донорные плазмиды pFastBacHTa/ORF7 с генами нуклеокапсидного белка американского и европейского типов были использованы для трансформации клеток E.coli DHlOBac, несущих инфекционный геном бакуловируса в виде бакмиды («130 тыс. н.п.). При рекомбинации между донорной плазмидой и бакмидой экспрессионная кассета переносится прямо в ген lacZa-пептида. Рекомбинантные колонии при этом остаются белыми на среде, содержащей X-Gal и IPTG. Через 48 часов после высева трансформированных бактерий на Ввиду невозможности проверки бакмиды на наличие вставки методом рестрикционного анализа, для подтверждения присутствия вставки ORF7 колонии белого цвета анализировали методом ПЦР. Для этого использовали один праймер, специфический для вставки, в нашем случае - EuroBacF или AmerBacF. Второй праймер, антисмысловой M13R, специфичен для бакмиды, место его отжига находится на 603 нуклеотида ниже сайта рекомбинации. На рисунке 5 представлены результаты проверки рекомбинантных колоний штамма E.coli DHlOBac, трансформированных плазмидами pFastBacHTa со вставкой генов ORF7 американского и европейского типов. Видно, что получены фрагменты ДНК нужного размера - около 1006 н.п. для ORF7 европейского и около 991 н.п. для ORF7 американского типа вируса. Рекомбинантные бакмиды, наличие гена ORF7 в которых подтверждено методом ПНР, использовали для трансфекции клеток насекомых. 3. Создание генноинженерных конструкций для экспрессии генов нуклеокапсидного белка американского и европейского типов вируса РРСС в системе экспрессии в E.coli. 3.1. Амплификация генов нуклеокапсидного белка (ORF7). Для проведения ОТ-ПЦР были использованы универсальные для вирусов обоих типов праймеры F7 и R7. Для проведения второй стадии ПЦР использовали: праймеры AmerF7 и AmerRJ для штамма NADC-8; праймеры EuroF7 и EuroR7 для штамма 45+ Воронеж.
В результате амплификации полученные фрагменты ожидаемого размера - 388 н.п. для NADC-8 и 403 н.п. для 45+ Воронеж. 3.2. Получение рекомбинантных экспрессионных плазмидных векторов для системы экспрессии в клетках E.coli, несущих гены ORF7. Методом рестрикции-лигирования амплифицированный фрагмент встраивали в экспрессионную плазмиду рЕТ-23Ь(+). Проверенные методом ПЦР клоны были использованы для выделения рекомбинатных плазмид. Получено четыре плазмиды. Выделенные плазмиды pET-23b(+)/ORF7 оказались положительными по рестрикционному анализу. Схема рекомбинантной плазмиды pET-23b(+)/ORF7 приведена на рисунке 6В. 3.3. Определение нуклеотидной последовательности клонированных генов QRF7. Полученные рекомбинантные плазмиды pET-23b(+)/ORF7 были использованы для определения нуклеотидной последовательности ORF7. Показано (рисунок 7), что рекомбинантные плазмиды несут последовательность, полностью идентичную ORF7 исходных штаммов. 3.4. Экспрессия генов нуклеокапсидных белков вируса РРСС американского и европейского типов в E.coli. Принцип экспрессии гена ORF7 в E.coli заключается в следующем. В экспрессионной плазмиде чужеродный ген находится под контролем промотора фага Т7. Хромосома клеток экспрессионного штамма содержит копию гена РНК-полимеразы фага Т7 под контролем промотора lacUV5. Индукция экспрессии гена происходит при добавлению в ростовую среду IPTG, снимающего репрессию гена РНК-полимеразы Т7. Синтез рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rN) контролировали методом ДСН-электрофореза в ПААГ (рисунок 8). Видно, что после индукции происходит накопление белка с молекулярной массой 14 кД, что соответствует нуклеокапсидному белку. Собранную после индукции биомассу E.coli использовали для выделения рекомбинантных белков методом металлоаффинной хроматографии. 4.
Очистка и характеристика рекомбинантных нуклеокапсидных белков. Для дальнейшего использования рекомбинантных продуктов в реакциях непрямого ИФА требовалась их очистка. Как бакуловирусная система экспрессии, так и система экспрессии в E.coli дают рекомбинантный продукт, имеющий на своем конце (N-конец в «Baco-Bac» и С-конец в системе экспрессии рЕТ) шесть гистидиновых остатков. Это позволяет очищать белок из клеточного лизата методом металлоаффинной хроматографии. Очистку рекомбинантных белков проводили на Ni-NTA агарозе (Qiagen, США) по методике фирмы-изготовителя с небольшими изменениями. Результаты первых опытов показали, что уже при отмывке с 50мМ имидазола происходит элюирование очищенного рекомбинантного нуклеокапсидного белка. Поэтому в дальнейшем было решено проводить отмывку буферами, содержащими 10 и 20мМ имидазола, а элюировать продукт буфером, содержащим 250 мМ имидазола. Стадия промывки колонки буфером, содержащим 50 мМ имидазола, была исключена. На рисунке 10 представлены полученные по данной методике профиль элюции и активность фракций при выделении нуклеокапсидного белка европейского типа. Видно, что сначала происходит смыв с колонки общего белка, в том числе выходит и часть не связавшегося с носителем рекомбинантного продукта. Затем следует небольшой пик оптической плотности при 280 нм, не сопровождающийся пиком активности соответствующих фракций в ИФА. Этот пик, видимо, соответствует белкам с относительно высоким содержанием гистидиеновых остатков. Затем, после добавления буфера элюции, происходит выход с колонки небольшого количества белка, имеющего высокую активность в реакции непрямого ИФА с моноклональными антителами. Этот пик соответствует рекомбинантному продукту. Содержание белка во фракциях, полученных в результате элюции, составило 0,822 мг. Исходный клеточный лизат содержал 74 мг белка, выход очищенного продукта относительно общего белка составил, таким образом, 1,1%.
Сравнение разработанной тест-системы с тест-системой IDEXX в реакциях непрямого ИФА с полевыми сыворотками.
Основными характеристиками любой тест-системы, являются ее специфичность и чувствительность. Для определения этих параметров разработанной тест-системы использовали панель референтных сывороток: 435 референтных негативных сывороток из Швеции и 31 положительная в тест-системе IDEXX полевая сыворотка. Работе по созданию средств серодиагностики РРСС предшествовало исследование распространенности возбудителя на территории России и Белорусии, результаты которого показали необходимость разработки диагностического ИФА-набора для выявления антител к вирусу РРСС. Кроме описанных выше серологических исследований полевого материала из различных хозяйств России и Белоруссии в лаборатории молекулярной диагностики НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН были проведены исследования сывороток крови свиней методом РТ-ПЦР (Гребенникова и др. 2003b) с применением разработанной тест-системы (Власова и др. 2003). Полученные в этой серии экспериментов данные свидетельствуют о циркуляции на территории двух стран вируса РРСС только европейского типа. Не удалось обнаружить вирус американского типа в полевых пробах, хотя принципиальная возможность его обнаружения была показана на культуральном материале, содержащим вирус РРСС штамма NADC-8, относящегося к американскому типу. Методом РТ-ПЦР вирус РРСС так же обнаруживается не во всех хозяйствах.
Эти данные свидетельствуют о том, что вирус РРСС широко распространен на территории России и Белоруссии, но большие расстояния между хозяйствами в наших странах и недостаточно развитая инфраструктура привели к тому, что вирус РРСС распространяется не так быстро, как на Западе и есть ряд хозяйств, свободных от него. Исходя из наших данных и данных других исследователей, подавляющее большинство изолятов относится к европейскому типу, что подтверждает предположение о независимой эволюции этих двух групп изолятов (Nelsen et al.,1999). Однако обнаружение американских изолятов вируса РРСС на территории Китая, а также распространенность американских штаммов в Европе после применения американских живых вакцин, дает основание считать целесообразным разработку диагностической тест-системы с потенциальной возможностью выявления как европейского, так и американского типов вируса РРСС. Представляет интерес исследование эпизоотологической ситуации в регионах России, граничащих с европейскими странами и Китаем. Такие исследования тем более необходимы, так как американские изоляты вируса РРСС более вирулентны по сравнению с европейскими (Done et al., 1996; van Gucht et al., 2003). Разработанный в предлагаемой работе ИФА-набор может быть использован для эпизоотологического мониторинга. Для контроля за инфекцией РРСС на территории нашей страны, мониторинга этого заболевания, проверки ввозимых из-за рубежа свиней и для оценки эффективности профилактических мероприятий требуются надежные, простые и воспроизводимые методы диагностики этого заболевания.
Для рутинного использования в ветеринарных лабораториях и в хозяйствах подходят как молекулярные методы диагностики, получившие широкое распространение в последнее десятилетие (Belak and Thoren 2001), особенно за рубежом, так и традиционные серологические методы диагностики. В настоящее время как у нас в стране, так и за рубежом, разработан ряд диагностических систем на основе метода ПЦР (Van Woensel et al.,1994; Spagnuolo-Weaver et al.,2000; Egli et al.,2001; Власова и др. 2003). В том числе, в нашей лаборатории была разработана тест-система, позволяющая детектировать РНК вируса РРСС в пробах и дифференцировать американский и европейский типы вирусов (Власова и др. 2003). Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью и возможностью использовать для выделения вирусной РНК широкий спектр органов, тканей и биологических жидкостей. Его недостатками являются прежде высокий риск контаминации (связанный с высокой чувствительностью реакции) и достаточно высокие требования к квалификации персонала диагностической лаборатории. На рекомбинантного нуклеокапсидного белка. По данным эпитопного картирования нуклеокапсидного белка он несет как линейные, так и конформационные антигенные эпитопы. Для нас было интересно то, что по данным ряда авторов разные эпитопы N-белка позволяют проводить универсальную диагностику американских и европейских изолятов вируса РРСС (Yang et al., 1999, 2000). Хотя Seuberlich с соавторами описали возможность создания дифференцирующей ИФА тест-системы на основе рекомбинантных антигенов, выделенных в денатурирующих условиях и получили данные, что белки двух типов после нативнного выделения имеют лишь около 40% кроссреактивности с гетерологичными сыворотками, другими исследователями были получены данные иного рода. Witte с соавторами показали, что на основе rN американского типа можно создать универсальную ИФА тест-систему, результаты использования которой коррелируют с результатами, полученными в тест-системе IDEXX, в состав которой входят антигены американского и европейского типов (Witte et al., 2000).
Сравнение рекомбинантных антигенов из восьми изолятов вируса РРСС в реакциях с гомологичными и гетерологичными сыворотками также показало их сходство, демонстрируя возможность создания универсальной диагностической системы, хотя наблюдались небольшие различия в их активности с разными группами сывороток (Cho et al., 1997). Резюмируя приведенные выше данные разных исследователей, нельзя окончательно сказать, возможно ли создание дифференцирующей американский и европейский типы вируса РРСС тест-системы на основе рекомбинантных нуклеокапсидных белков. Или, напротив, возможно ли создание универсальной тест-системы на основе нуклеокапсидного белка одного типа. Мы пришли к выводу о том, что для создания диагностической тест-системы на основе ИФА с рекомбинантным антигеном будет достаточным использование нуклеокапсидного белка, выделенного в денатурирующих условиях. В пользу этого решения говорили и описанные в литературе Ивановского РАМН диагностической тест-системы на основе ИФА является частью работы по разработке стратегии по контролю и искоренению вируса РРСС на территории России, включающей в себя молекулярно-эпидемиологические исследования (Гребенникова и др. 2003b), разработку ПЦР-диагностики (Власова и др. 2003) и создание нового поколения маркированных вакцин на основе инфекционного клона вируса РРСС (Гребенникова и др. 2003а; Grebennikova et al.,2003). На основании большого количества данных, полученных разными исследователями и изучению ситуации с распространением вируса, было решено приступить к созданию тест-системы на основе ИФА для обнаружения антител к обоим типам вируса. Перед нами встал вопрос о том, что мы будем использовать в нашей тест-системе в качестве антигена. Можно было использовать культуральный антиген - цельный вирус, очищенный из культуры зараженных клеток. Альтернативным вариантом было получение рекомбинантного белка в той или иной системе экспрессии.
Относительно слабое накопление вируса РРСС на культуре клеток, возможность контаминации клеточных культур микоплазмой, к которой у свиней могут присутствовать антитела, невысокая устойчивость вириона и данные о том, что очищенный N-белок более эффективен в ИФА по сравнению с культуральным антигеном (Denac et al.,1997), определили наш выбор. Нуклеокапсидный белок с молекулярной массой 14-15 кД, находящийся в большом количестве в инфицированных клетках, обладает высокой антигенной активностью и индуцирует выработку высоких титров антител, которые обнаруживаются у всех больных животных (Plana-Duran et al., 1997; Wootton et al., 1998; Dea et al., 2000a; Witte et al., 2000). Белок высококонсервативен внутри каждого из типов, а также несет. общие для двух типов вируса РРСС эпитопы (Dea et al.,2000а; Yang et al.,2000). Существующие на Западе иммуноферментные диагностические наборы основаны на определении титра антител к этому белку (Plana-Duran et al., белков из разных типов вируса создали ИФА тест-систему. Тест-системы на основе рекомбинантных нуклеокапсидных белков вирусов американского и европейского типов доступны коммерчески, в частности, Chekit-PRRS производит швейцарская компания Dr. Bommeli AG, тест-система HerdChek PRRS ELISA выпускается компанией IDEXX. Эти тест-системы позволяют детектировать антитела к вирусам обоих типов, но не позволяют дискриминировать их.
