Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Вирус гепатита В (НВ V). Общая характеристика 9
1.1.1. Краткая история обнаружения и исследования вируса гепатита В, его таксономическое положение 9
1.1.2. Структура вируса гепатита В 10
1.1.2.1. Белки оболочки вируса гепатита В. 11
1.1.2.2. Главный белок оболочки вируса гепатита В (малый поверхностный антиген HBsAg) 11
1.1.3. Организация генома вируса гепатита В 15
1.1.4. Особенности репродукции вируса гепатита В 18
1.1.5. Регуляция синтеза поверхностных белков НВ V 21
1.1.6. Эпидемиология вируса гепатита В 22
1.2. Трансгенные растения - возможные системы для производства вакцин 24
1.2.1. Предпосылки для использования трансгенных
растений в качестве продуцентов вакцин 24
1.2.2. "Съедобные" ващины и их получение в растениях 27
1.2.2.1. Использование химерных вирусных конструкций
в создании вакцино-продуцирующих растений 30
1.2.2.2. Получение растений-продуцентов вакцин с использованием агробактериальной трансформации 32
1.2.2.3. Экспрессия в трансгенных растениях поверхностного антигена вируса гепатита В 36
1.2.3. Повышение уровня экспрессии трансгенов - одна из
задач генноинженерной биотехнологии растений 40
1.2.4. Увеличение синтеза HBsAg в трансгенных растениях -
одно из требований для разработки "съедобных" вакцин
против гепатита В 41
2. Материалы и методы 45
2.1. Бактериальные штаммы и ллазмиды 45
2.2. Растения 46
2.3. Среды 46
2.3.1. Микробиологические среды 46
2.3.2. Среды для культивирования растений 46
2.4. Растворы 47
2.4.1. Другие растворы и буферы 48
2.5 Ферменты 49
2.6. Другие реактивы и материалы 49
2.7. Выделение, очистка и машшуляции с плазмидной ДНК 49
2.8. Конструирование плазмид для трансформации растений 50
2.9. Введение метки в ДНК 51
2.10. Скрининг рекомбинантных клонов 51
2.11. Перенос ДНК на фильтры по Саузерну 52
2.12. Гибридизация на фильтрах по Саузерну 53
2.13. Трансформация листовых дисков табака 53
2.14. Выделение суммарной растительной ДНК 54
2.15. Определение активности неомицинфосфотрансферазы 11 (NPTII) 54
2.16. Выделение тотальной растительной РНК с использованием горячего фенола 55
2.17. РНК-ДНК гибридизация 56
2.18. ПЦР-анализ трансгенных растений 57
2.19. Определение содержания HBs-антигена в трансгенных растениях 57
2.19.1 Подготовка пробы 58 2.19.2. Процедура 58
2.20. Фракционирование белков из экстракта растений сульфатом аммония разных степеней насыщения (5-80%) 60
2.21. Иммуноблоттинг 60
3. Результаты и их обсуждение 62
3.1. Получение трансгенных растений табака, экспрессирующих ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) 64
3.1.1. Конструирование плазмид для трансформации растений, содержащих ген HBsAg под контролем одинарного и двойного промоторов 35S РНК вируса мозаики цветной капусты 64
3.1.2. Генетическая трансформация растений табака 76
3.1.3 Молекулярно-биохимический анализ растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В 78
3.2. Анализ HBs-антигена в трансгенных растениях табака 84
3.3. Анализ поколения F1 трансгенных растений табака, содержащих ген HBsAg под контролем двойного промотора 35S 89
Заключение 93
Выводы 96
Список литературы 97
- Главный белок оболочки вируса гепатита В (малый поверхностный антиген HBsAg)
- Получение растений-продуцентов вакцин с использованием агробактериальной трансформации
- Выделение тотальной растительной РНК с использованием горячего фенола
- Молекулярно-биохимический анализ растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В
Главный белок оболочки вируса гепатита В (малый поверхностный антиген HBsAg)
Представители семейства Hepadnaviridae, в том числе вирус HBV, являются внуриклеточными паразитами. Они используют механизмы клетки-хозяина для синтеза белков оболочки и вирусных генов, из которых формируются новые вирусные частицы. Эти частицы затем покидают клетку-хозяина и заражают другие клетки.
ДНК HBV в клетках печени - гепатоцитах может находиться в свободном состоянии либо интегрировать в хромосому. Свободная ДНК вируса гепатита В определяется при острых формах инфекции и на некоторых стадиях хронического гепатита. Интегрированные последовательности главным образом наблюдают при хронической форме гепатита и особенно у больных гепатоцеллюлярной карциномой (ПДК, первичным неметастатическим раком печени). Помимо клеток печени, ДНК HBV встречается и в других тканях (почках, поджелудочной железе, костном мозге, одноядерных клетках крови) (Tiollais et al., 1985). Однако максимальная экспрессия генов HBV происходит только в клетках печени, возможно, под влиянием стероидных гормонов (Балаян, Михайлов, 1999). HBV может взаимодействовать с макрофагами и встраивать свою ДНК в их клеточный геном. При нормальном иммунном ответе находящиеся на мембранах макрофагов вирусные антигены индуцируют синтез антител к HBs-, НВс-, НВе-белкам и, таким образом, формируется напряженный гуморальный иммунитет, который сохраняется в течение многих лет (Борисов и др., 1994).
У большинства ДНК-содержащих вирусов копирование генома осуществляется ДНК-полимеразами. В этом случае исходные цепи ДНК являются матрицами для синтеза комплементарных цепей. У гепадновирусов репликация идет через промежуточное звено - синтез РНК (подобно механизму репродукции ретровирусов). Репликация и транскрипция вирусного генома происходит в ядрах гепатоцитов. ДНК HBV в этот момент представляет собой открытую кольцевую двуцепочечную молекулу, которая подвергается суперспирализации. В ядре гепатоцита "минус"-цепь транскрибируется при помощи клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразы, которая синтезирует множество копий РНК размером около 3500 нуклеотидов (прегеном). Далее прегеном, связанный с 5 -концом ДНК белок и вирусная ревертаза (обратная транскриптаза) упаковываются во вновь сформированный капсид и переносятся в цитоплазму, где происходит обратная транскрипция прегенома - синтез новой "минус"-цепи ДНК. Инициация Обратной транскрипции происходит в области DR1 (рис. 4). Белок, связанный с 5 -концом ДНК, играет роль "затравки" в этом процессе (Bartenschlager а. Schaller, 1988; Bosch et al., 1988; Shlicht et al., 1989).
Одновременно с синтезом "минус"-цепи ДНК происходит деградация прегенома за счет дополнительной РНК-азной активности вирусной ревертазы, специфичной для гибридов ДНК-РНК (подобно РНКазеН). Возможно, оставшийся от 5 -конца прегенома фрагмент РНК в 20 пар оснований служит праймером для синтеза "плюс"-цепи ДНК с участка DR2, при этом матрицей служит "минус"-цепь. Затем капсид и вирусная ДНК заключаются в новую внешнюю оболочку и зрелая вирусная частица покидает клетку. Полный синтез "плюс"-цепи не является необходимым для сборки вирусной частицы и ее выхода из клетки. Рост "плюс"-цепи ДНК немедленно прекращается, как только вирус выходит из клетки, поэтому длина этой цепи варьирует (Summers a. Mason, 1982; Cattaneo et al., 1984; Tiollais et al., 1985).
В инфицированных гепатоцитах обнаружены три основных типа матричных РНК (мРНК). Меньшая из них (2100 нуклеотидов) кодирует главный и средний белки оболочки. Транскрипт длиной 2400 нуклеотидов кодирует большой поверхностный антиген LHBsAg. Упомянутая выше мРНК (3500 нуклеотидов), или прегеном, кодирует белок капсида и продукты области Р генома HBV (Summers a. Mason, 1982; Adjamian, 1999). Интересно, что в клетках печени и в клеточных линиях гепатомы, трансфецированных клонированной ДНК вируса гепатита В, найдены несколько транскриптов, полученных в результате сплайсинга прегеномной мРНК. В обнаруженных процессированных мРНК есть открытые рамки считывания, кодирующие белки, подобные Р и S белкам (Chen et al., 1989; Su et al., 1989, Terre7 et al., 1991). Было показано, что в клетках печени, инфицированных HBV, происходит экспрессия процессированной мРНК, кодирующей белок весом 10 кДа. Этот белок участвует в процессах апоптоза трансфецированньж клеток HuH-7 (Soussan et al., 2000). Обнаружен белок P-S (43 кДа), кодируемый другой процессируемой РНК и ггоедставлЕяюпшй собой сшитые белок S и часть белка Р. Подобно белку LHBsAg, белок P-S является структурным, входит в состав вирусных частиц и, возможно, играет роль в жизненном цикле вируса (Huang et al., 2000).
В течение жизненного цикла HBV синтез вирусных белков жестко регулируется на уровне транскрипции и трансляции. В геноме HBV обнаружены две области, выполняющие роль энхансеров транскрипции. Энхансер I располагается внутри области Р между открытыми рамками считывания поверхностного антигена и областью гена X. Показано, что энхансер I гораздо более активен в культуре клеток печени по сравнению с другими клетками. Это позволило сделать предположение о его роли в специфической экспрессии генов HBV именно в клетках печени. Для HBV подтипа ayw положение энхансера І в геноме соответствует нуклеотидам 1074-1234 (Shaul et al., 1985; Guo et al., 1991). Энхансер П в геноме HBV находится в области 1636-1741 п.н. (рис. 4). В энхансере II обнаружены два регуляторных элемента П-А и П-В, совместное действие которых необходимо для проявления его усиливающей активности (Yuh a. Ting, 1990).
Решающую роль в морфогенезе частиц HBV в клетках млекопитающих играют два этапа: ко-трансляционная интеграция HBsAg в мембрану шероховатого эндоплазматического ретикулума и установление дисульфидньгх связей между субъеденицами HBsAg. Внедрение в мембрану ЭПР обусловлено наличием в первом гидрофобном домене HBsAg нерасщепляемого сигнального пептида, который взаимодействует с signal recognition particle (Eble et al., 1987). HBsAg имеет 4 домена, пронизывающих мембрану, N- и С-концы белка экспонированы в люмен ЭПР (рис. 1). Вместе с частицами нуклеокапсида они участвуют в формировании зрелых вирионов, которые затем секретируются из клетки. В зараженных клетках печени наблюдают различные количества большого, среднего и основного белков. Большой белок (LHBsAg) обычно синтезируется в незначительном количестве.
Получение растений-продуцентов вакцин с использованием агробактериальной трансформации
В 1993 г. были опубликованы первые данные по разработке "съедобных" вакцин против диарреи, вызываемой холерным вибрионом и патогенными штаммами E.coli. Эти микроорганизмы поражают кишечник и продуцируют соответствующие белки-энтеротоксины (в том числе термолабильный энтеротоксин и холерный токсин), вызывая при этом острую диаррею. Энтеротоксин E.coli LT близок по своим структурно-функциональным и антигенным свойствам холерному токсину. Он состоит из субъединицы A (LT-A) и пентамера субъединиц В (LT-B). Пентамер LT-В сам по себе не токсичен и является эффективным оральным иммуногеном. Он стимулирует образование антител, которые препятствуют связыванию субъединиц В с клетками, блокируя таким образом действие токсинов - это позволяет использовать малые субъединицы обоих токсинов в качестве вакцин. Были получены трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие белок LT-B из термолабилвного энтеротоксина E.coli LT. В работе использовали нативный и рекомбинантный гены белка LT-B. Рекомбинантный ген rLT-B был дополнен сигнальной последовательностью SEKDEL для сохранения белка в эндоплазматическом ретикулуме. Экспрессия обеих кодирующих последовательностей происходила с промотора 35S СаМу. Белок rLT-B-SEKDEL, дополненный пептидом, накапливался в растениях в большем количестве, чем нативный. Количество нативного белка LT-B в листьях табака составляло до 5 мкг, а в микроклубнях картофеля до 30 мкг на грамм общего растворимого белка. Белок rLT-B-SEKDEL накапливался в листьях табака до 15 мкг, а в микроклубнях картофеля до 110 мкг на грамм общего растворимого белка, что составляло 0,01% от общего белка. Полученный в растениях белок rLT-B-SEKDEL собирался в пентамерную структуру. Его иммуногенность определяли, скармливая клубни трансгенного картофеля мышам. При этом в крови, а так же в образцах слизистой животных обнаруживались соответствующие иммуноглобулины IgG и IgA, специфичные для rLT-B-SEKDEL. У контрольных мышей такие антитела не найдены (Haq et al., 1995).
Аналогичные результаты были получены, когда в растениях был экспрессирован ген субъединицы В (СТ-В) холерного токсина (Arakawa et al., 1997). Показано, что в клетках растений, как и в бактериях, рекомбинантный белок образует пентамерную структуру, которая по антигенным свойствам не отличается от бактериальной. Кроме того, этот пентамер способен специфически связываться с ганглиозидом GM1, природным рецептором холерного токсина на поверхности слизистой кишечника. Исследования иммунологических свойств рекомбинантного белка показали потенциальную возможность использования его в качестве вакцины (Arakawa et al., 1998). Клубни трансгенного картофеля скармливали мышам четыре раза с недельным интервалом в течение месяца и последующей реиммунизацией через 65 дней, после чего определяли титры специфических иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA в сыворотке крови и продуктах жизнедеятельности. Контрольным мышам давали в пищу обычный картофель. Титры специфических анти-СТ-В IgG и IgA в сыворотке крови немного возрастали с 35-го по 70-й день, тогда как титр IgM немного падал. Однако реиммунизация на 65-й день опять поднимала титр иммуноглобулинов до максимума, который наблюдали на 28-й день. В обоих случаях антитела из сыворотки мышей, употреблявших трансгенный картофель, нейтрализовали действие холерного токсина. Тот факт, что трансгенные клубни картофеля, экспрессирующего рекомбинантный антиген, при употреблении в пищу вызывали иммунный ответ, подтвердил возможность создания "съедобных" вакцин на основе трансгенных растений.
Другими исследователями были созданы трансгенные растения табака и картофеля, которые экспрессировали белок капсида вируса Norwalk (Caliciviridae), вызывающего острый эпидемический гастроэнтерит у людей. Белок капсида вируса Norwalk (rNV) экстрагировали из листьев табака и клубней картофеля в виде вирусоподобных частиц размером около 38 нм. Белок rNV вводили мышам и наблюдали иммунный ответ в виде образования сывороточного IgG, и секреторного IgA, специфичных к rNV (Mason et al., 1996).
Известны эксперименты по экспрессии в растениях томата (Lycopersicon esculentwn Mill, var UC82b) гликопротеина внешней оболочки вируса бешенства - белка G (McGarvey et al., 1995). Рекомбинантный ген белка G вируса бешенства (штамм ERA), включая сигнальный пептид, был клонирован под промотор 35S вируса мозаики цветной капусты в бинарный вектор RG-2 (на основе плазмиды pBinl9). Семядоли и культура ткани растений томата были трансформированы при помощи агробактерий. Присутствие гена белка G в трансгенных растениях авторы подтверждали полимеразной цепной реакцией. При помощи РНК- ДНК гибридизации определяли наличие транскриптов соответствующей РНК в листьях и плодах трансформированных томатов. Белок G был получен из экстрактов листьев и плодов трансгенных растений иммунопреципитацией с использованием поликлональной сыворотки кролика, иммунизированного белком G вируса бешенства. Иммунопреципитаты затем анализировали при помощи иммуноблоттинга. Количество белка G составляло примерно 1-10 нг/мг растворимого белка трансгенных томатов. Кроме того, белок G был визуализирован методом электронной микроскопии с использованием иммуногистохимического анализа в тельцах Гольджи, везикулах, ллазмалемме и в клеточной стенке клеток паренхимы сосудов.
Оказалось, что молекулярная масса белка G, полученного в растениях томата, на 4-6 кДа меньше, чем у нативного. По мнению авторов, это объясняется различиями в гликозилировании у растений и животных, поскольку сложные полисахариды растений часто гораздо меньшей молекулярной массы, чем у животных, в том числе из-за отсутствия сиаловой кислоты (McGarvey et al., 1995). Подобные результаты были получены и другими исследователями в случае трансформации растений табака поверхностным белком G другого рабдовируса - везикулярного стоматита (VSV). Полученный в растениях белок G вируса VSV имел молекулярную массу на 5 кДа меньше, чем нативный белок (Galbraith et al., 1992). В настоящее время исследования по получению трансгенных растений - продуцентов вакцин активно продолжаются (Arntzen, 1997; Walmsley a. Arntzen, 2000, Yu a. Langridge, 2000).
Выделение тотальной растительной РНК с использованием горячего фенола
Как упомянуто выше, растения обладают необходимыми условиями для правильного синтеза HBsAg и сборки его в вирусоподобные частицы. Кроме того, экспрессия белка в растениях открывает возможность для создания "съедобных вакцин". Однако из-за деградации в пищеварительном тракте оральные вакцины требуют более высокого содержания иммуногена, чем парентеральные. В связи с этим исследования, проводимые в настоящее время, направлены на повышение уровня синтеза HBsAg в растениях. Один из подходов к решению этой задачи - использование органоспецифичных промоторов (Giddings et al., 2000).
Недавно Рихтер с соавторами провели широкие исследования, направленные на оптимизацию условий для повышенного синтеза HBsAg в растениях и изучение его иммуногенности (Richter et al., 2000). Были получены трансгенные растения картофеля, экспрессирующие ген HBsAg под контролем специфичного для клубней промотора пататина. Синтез продукта в данном случае составлял 1,1 мкг/г сырого веса клубневой массы. Однако такой уровень экспрессии оказался недостаточным и была сконструирована серия новых векторов для оптимизации экспрессии HBsAg в растениях. Во всех конструкциях использовали конститутивный прмотор 35S ВМЦК. Кроме того, каждый отдельный вектор был дополнен различными 5 -нетранслируемыми и 3 -фланкирующими последовательностями, а также сигнальным пептидом сои VSP либо транзитным хлоропластным пептидом малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы TPSS. Одна из конструкций содержала последовательность SEKDEL для транспорта белка в ЭПР. Полученные конструкции были использованы для трансформации картофеля. Наиболее высокий уровень экспрессии гена HBsAg в трансгенных растениях наблюдали при использовании плазмид рНВ114 и рНВ104. Плазмида рНВ114 содержала 5 -нетранслируемую область вируса исчерченности табака TEV и З -последовательность терминатора гена ингибитора прстеиназ П картофеля pin2. В плазмиде рНВ104 также содержалась 5 последовательность TEV и 3 -область гена сои vspB. Растения, трансформированные плазмидой рНВ114, накапливали HBsAg до 16 мкг/г сырого веса клубней, что составляло 0,25% от общего растворимого белка. Трансгенные растения, полученные в результате трансформации конструкцией рНВ104, синтезировали HBsAg в количестве 6,5 мкг/г сырого веса клубней. Для растений картофеля, трансформированных остальными конструкциями, синтез HBsAg не превышал 0,05% от общего растворимого белка. Показано, что линии растений, накапливающие HBsAg в наибольшем количестве (трансформированные конструкциями рНВ104 и рНВ114), образовьгеали очень мало клубней. Видимо, HBsAg обладает некоей токсичностью для растении, когда синтезируется на высоком уровне. Интересно, что в случае использования в одной из конструкций (рНВПО) N-концевого хлоропластного транзитного пептида малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы TPSS, сшитого с геном HBsAg белка HBsAg в трансгенных растениях обнаружено не было, несмотря на синтез соответствующей мРНК. Из-за дополнительного транзитного пептида мРНК TPSS-HBsAg была длиннее на 270 п.н,, вследствие этого вероятен ошибочный фолдинг белка и его быстрая деградация. При проведении исследований иммунгенных свойств клубней картофеля, продуцирующего HBsAg, была обнаружена возможность эффективного комбинирования пероральной и парентеральной иммунизации. Сначала животных кормили трансгенным картофелем, содержащим 5,5 мкг HBsAg на одну дозу с добавлением 10 мкг холерного токсина (СТ) в качестве адьюванта. Мыши получали 3 дозы иммуногена с интервалом через неделю, а через три недели после последней дозы у этих животных наблюдали образование антител против HBsAg в количестве 73 мМЕ/мл, уровень которых в последующие три недели снижался до исходного. Еще через три недели животным вводили внутрибрюшшшо коммерческую вакцину, содержащую субиммуногенную дозу HBsAg (0,5 мкг), что вызывало немедленное образование соответствующих антител на высоком уровне (1679,6 мМЕ/мл). У контрольной группы мышей, получавших орально только белок СТ, после парентерального введения коммерческого HBsAg не наблюдали мгновенного образования высокого уровня антител против HBsAg (Richter et al., 2000). Данные исследования открывают новые перспективы для получения трансгенных растений, синтезирующих иммуногеные белки.
Итак, в настоящее время во многих лабораториях мира ведется работа по созданию трансгенных растений - продуцентов вакцин. Во многих исследованиях убедительно показано, что гены антигенных детерминант многих патогенов (бактерий и вирусов) успешно экспрессируются в растительной системе, не теряя при этом своих антигенных свойств, Доклинические испытания некоторых антигенов, полученных в растениях, в том числе и поверхностного антигена вируса гепатита В, продемонстрировали их способность стимулировать образование соответствующих иммуноглобулинов в организме привитого. Подобная стратегия получения вакцин возможно, станет экономически выгодной альтернативой дрожжевым продуцирующим системам. В связи с этим данная работа посвящена созданию плазмидных конструкций для генетической трансформации растений, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В, трансформации ими растений табака, и молекулярно-биологическому и биохимическому анализу полученных трансгенньгх растений.
Молекулярно-биохимический анализ растений табака, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В
Исследования последних лет показали возможность использования трансгенных растений в качестве безопасных и дешевых продуцентов вакцин. Оказалось, что белки различных патогенов - бактерий и вирусов -можно получать в растительных системах, при этом они подвергаются необходимым для сохранения их иммуногенных свойств энзиматическим модификациям. В настоящее время разрабатываются вакцины на основе трансгенных растений против возбудителей различных болезней человека, в том числе против вируса гепатита В. Получены трансгенные растения, зксіфессирующие ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) (Liu et al., 1992; Mason et al., 1992; Ehsani et al., 1997; Kapusta et al., 1999; Richter et al., 2000). Показано, что синтезированный в растениях белок HBsAg по своим физико-химическим и иммунологическим характеристикам соответствует белку HBsAg из дрожжей, и при оральном введении стимулирует образование соответствующих IgG у лабораторных животных и у человека (Kapusta et al., 1999). Недавно были опубликованы результаты эффективного комбинирования пероральной и парентеральной иммунизации на лабораторных животных: требовалась единственная инъекция субиммуногенной дозы коммерческой вакцины против гепатита В, которая была дополнена предварительным употреблением в пищу нескольких доз трансгенного картофеля, синтезирующего HBsAg. В результате наблюдали быстрое образование высокого уровня соответствующих антител (Richter et al., 2000). Дальнейшие эксперименты показали, что HBs-антиген трансгенных растений более эффективен при пероральном употреблении, чем очищенный из дрожжей HBsAg. При помощи электронной микроскопии исследовали клетки листьев трансгенных растений картофеля, синтезирующих аналогичный белок (Kong et al., 2001). Авторы обнаружили в клетках связанные с мембранами необычные везикулярные тельца, заполненные округлыми структурами диаметром примерно 17 нм. Эти структуры специфически взаимодействовали с антителами против HBsAg и были очень схожи с вирусоподобными частицами, содержащимися в сыворотке HBV-инфицированных людей. В контрольных, нетрансформированных растениях, не обнаружено каких-либо субклеточных везикул с подобным содержимым. Авторы исследования сделали заключение, что HBsAg собирается в растительных клетках в мультимерные частицы, которые накапливаются внутри мембранных везикул. Полагают, что такая естественная "биоинкапсуляция" антигена в растительной клетке защищает его от агрессивного воздействия в пищеварительном тракте до тех пор, пока он не вступит в контакт с эффекторами иммунной системы на слизистой поверхности кишечника (Kong et al., 2001). Эти данные демонстрируют основы новой стратегии иммунизации, которая, возможно, получит должное развитие и поможет изменить существующее положение в осуществлении широкомасштабных программ по вакцинации населения. Однако коммерческих "растительных" вакцинных препаратов против гепатита В в настоящее время не получено.
В НПО "Комбиотех" (Москва) была создана улучшенная экспрессирующая система для производства белка HBsAg в дрожжах в промышленных масштабах, с использованием синтетического гена полипептида HBsAg/mayw, составленного с учетом кодонов аминокислот, наиболее часто используемых в интенсивно экспрессируемых генах Saccharomyces cerevisiae (Друца и др., 1997). Этот ген был предоставлен нам авторами для работы над созданием трансгенных растений -продуцентов HBs-антигена. По данным компьютерного анализа с помощью программы "Generunner", кодоны аминокислот дрожжевого гена HBsAg/ mayw в значительной степени соответствуют кодонам, предпочтительным для растений. Аминокислотная последовательность продукта гена HBsAg/mayw была нами исследована с помощью компьютерных программ для предсказания вероятных сайтов локализации белков В клетке "iPPSORT" И "PSORT" (http://psort.mbb cJP/fom tml). Результаты показали, что полипептид HBsAg, предположительно синтезированный в растительной клетке в результате экспрессии дрожжевого гена HBsAg, имеет N-концевой сигнальный пептид (подчеркнут черной линией) и четыре трансмембранные области (выделены желтым цветом): MEMTSAFLGPIXVLQAGFITXIMLTIPOSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQ NSQSPTSl SPTSCPPTCPGYRWMCLRRFnFLFILLLCLIFLLVLLDYQGM LPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSS WAFGK WEWASARFSWLSLLWFVQWFVGLSFTVWLSVIWMIVIWYW GPSLYSILSPFLPLLPIFFCLWVYI. Наиболее вероятные компартменты его локализации в растительной клетке - плазматическая мембрана, тельца Гольджи, мембрана ЭПР. Эти данные позволили предположить, что ген, предназначенный для экспрессии в S. cerevisiae, при клонировании его под контроль растительного промотора, будет успешно работать в растениях, а его продукт стабильно сохраняться в растительных клетках.
В качестве источника гена использовали рекомбинантную плазмиду pDES20, содержащую синтетический ген полипептида HBsAg/mayw, используемый в клетках дрожжей для получения рекомбинантной вакцины против гепатита В (Друца и др., 1997). Ген HBsAg был заново синтезирован при помощи ПЦР с целью получения на концах гена удобных сайтов для клонирования в векторы для трансформации растений. Анализ нуклеотидной последовательности полученного гена показал, что она не отличалась от исходной. Схема клонирования гена HBsAg в плазмиды для трансформации растений под контроль одинарного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты показана на рис. 6. Вначале ген HBsAg (ДЦР-продукт I) был встроен по сайтам рестрикции Kpril и ВатШ в іфомежуточньш вектор pRT103. Пролученными плазмидами трансформировали клетки Е. coli TG-2. Вектор pRT103 (Topfer et al., 1987) содержит промотор CaMV 35S и сайт полиаденилирования, между которыми находится полилинкер с несколькими сайтами для клонирования генов. Отбор клонов со вставкой роизводили как описано (Sekar, 1987). Наличие гена HBsAg в плазмиде pRT103#2fo4g подтверждали рестрикционным анализом (рис. 7).
Похожие диссертации на Получение и анализ трансгенных растений Nicotiana tabacum, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В
