Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общие сведения о вирусе гепатита С 10
1.1. Вирус гепатита С - строение, распространенность
и пути передачи 10
1.2. Клиническое течение гепатита С 14
1.3. Патологические изменения в печени при гепатите С 17
Глава 2. Молекулярная организация и иммунологические свойства вируса гепатита С 18
2.1 .Организация вирусного генома 18
2.2. Структура и функции вирусных белков 22
2.3. Гуморальный и клеточный иммунные ответы при ВГС-инфекции 29
Глава 3. Молекулярные основы диагностики гепатита С 34
3.1. Выявление антител к белкам ВГС 34
3.2. Детекция РНК ВГС 36
3.3. Выявление вирусных белков 44
Собственные исследования материалы и методы 47
Глава 4. Материал от больных 47
Глава 5. Детекция РНК вируса гепатита С 48
5.1. Выделение РНК ВГС 48
5.2. Детекция геномной РНК ВГС 49
5.3. Выявление репликативной формы РНК вируса гепатита С .
Глава 6. Получение МКА к рекомбинантному белку NS4 вируса гепатита С 53
6.1. Рекомбинантный белок NS4 вируса гепатита С 53
6.2.Синтетические петиды 53
6.3. Иммунизация 53
6.4. Миеломная клеточная линия 54
6.5. Культивирование клеток 54
6.6. Слияние клеток и выращивание гибридом 54
6.7. Скрининг гибридом 55
6.8. Криоконсервирование гибридом 56 6.9.Получение асцитных жидкостей, содержащих МКА 56
6.10.Выделение МКА из асцитных жидкостей 56
6.11 .Определение концентрации белка 56
6.12. Субтипирование МКА и определение типов легких цепей в составе иммуноглобулинов 57
6.13. Твердофазный ИФА 57
6.14. Иммуноблот 57
6.15. Эпитопное картирование МКА 5 7
6.16. Конкурентный т-ИФА 58 Глава 7. Детекция белка NS4 ВГС in situ
7.1. Приготовление препаратов изолированных клеток 58
7.2. Получение криостатных срезов печени 58
7.3. Выделение лимфоцитов из цельной крови 59
7. 4. Непрямой иммунофлюоресцентный анализ (нИФ) 59
7.5. Непрямой иммуноферментный анализ in situ 59
Глава 8. Статистическая обработка результатов Результаты исследований 61
Глава 9. Выявление РНК ВГС 61
9.1 .Выявление геномной РНК ВГС 61
9.2. Детекция минус-РНК ВГС 63
9.3.Выявление РНК ВГС после интерферонотерапии 69
Глава 10. Получение и характеристика МКА 71
10.1. Слияние и скрининг гибридом 71
10.2. Характеристика МКА к белку NS4 71 10.3 .Эпитопная специфичность МКА 73 10.4. Реципрокный конкурентный анализ МКА 75
Глава 11. Выявление натурального белка NS4 ВГС 77
11.1. Детекция NS4 в изолированных инфицированных гепатоцитах 77
11.2. Изучение экспрессии белка NS4 ВГС на криостатных срезах печени 77
11.3. Выявление белка NS4 в лимфоцитах периферической крови 81
Обсуждение результатов исследований 83
Выводы 103
Список литературы
- Клиническое течение гепатита С
- Структура и функции вирусных белков
- Выявление вирусных белков
- Выявление репликативной формы РНК вируса гепатита С
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.
Гепатит С является актуальной проблемой современной медицины. Это обусловлено несколькими причинами. Во-первых, вирус гепатита С широко распространен в мире, им инфицированы 170 млн человек, что составляет около 3% человеческой популяции. Во-вторых, для данного заболевания характерен высокий уровень хронизации. По данным разных источников, в 50 [17] - 85% [140] случаев острый гепатит С принимает хроническое течение. В 20-30% случаев хронический гепатит С заканчивается циррозом с возможным развитием первичного рака печени [180]. В-третьих, до сих пор не создано специфических средств профилактики и лечения этого опасного заболевания.
На долю гепатита С приходится 20% случаев острого и 70% случаев хронического гепатита [26]. Летальные исходы при остром гепатите С встречаются редко. Однако, по данным Европейского комитета по профилактике вирусных гепатитов, гепатит С по причине смертности среди больных с хроническим поражением печени занимает второе место, уступая только хроническому алкоголизму [1].
Для гепатита С в подавляющем большинстве случаев характерно бессимптомное течение. Считается, что на один случай заболевания с желтухой приходится, как минимум, пять-шесть случаев безжелтушного гепатита [1]. В 85% случаев хроническая инфекция также является бессимптомной [26]. Это определяет широкое распространение ВГС-инфекции и делает специфическую диагностику этого заболевания актуальной проблемой здравоохранения во всем мире.
Первичная диагностика ВГС-инфекциии основывается на выявлении антител к вирусным белкам. При обнаружении сывороток, содержащих антитела к ВГС, необходимо проведение подтверждающего теста методом
иммуноблоттинга. Однако для адекватной диагностики определения одних вирусспецифических антител недостаточно. Это обусловлено рядом причин. Во-первых, выявление анти-ВГС антител не позволяет разграничить текущую инфекцию от прошлой, закончившейся элиминацией вируса [60]. Во-вторых, получение отрицательного результата при анализе антител не всегда однозначно свидетельствует об отсутствии инфекционного агента в организме. Это связано с наличием так называемого периода "окна" при образовании антител. Кроме того, часть пациентов (около 10%), особенно при иммунодифицитных состояниях, остается серонегативной [239]. В связи с этим возникает необходимость выявления прямых маркеров вируса - РНК и белков. Выявление РНК ВГС методом ПЦР является в настоящее время единственным применяемым в клинической практике методом прямого определения вируса. Однако определение вирусной РНК проводится, главным образом, в сыворотке крови. В то время как печень остается неизученной. Другим прямым маркером являются вирусные белки, но в настоящее время доступные тест-системы для их выявления отсутствуют. Изучение РНК и белков ВГС непосредственно в печени - органе, в котором происходит активная репликация вируса необходимо как для решения задач практического здравоохранения, так и ряда фундаментальных проблем молекулярной биологии вируса и патогенеза гепатита С. Многие вопросы, связанные с данным заболеванием, остаются нерешенными. В частности, не ясен механизм персистенции вируса и повреждения клеток печени [26]. Активно обсуждается связь между накоплением РНК и белков вируса и активностью патологического процесса. Открытым остается вопрос о внепеченочной репликации ВГС.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Цель настоящей работы состояла в изучении частоты определения геномной и антигеномной форм РНК ВГС в печени и периферической крови (сыворотке и лимфоцитах) больных с различной активностью хронического гепатита С (ХГС) и в разработке метода выявления белка NS4 в организме больных с помощью моноклональных антител (МКА). Для достижения цели планировалось решение следующих задач:
1. Исследовать частоту выявления геномных и антигеномных цепей
РНК ВГС в сыворотках крови, лимфоцитах периферической крови и
печени больных с разными формами и стадиями ХГС.
Провести статистический анализ полученных результатов для оценки связи между частотой выявления РНК ВГС и активностью патологического процесса.
Получить гибридомные клеточные линии, продуцирующие МКА к рекомбинантному белку NS4 ВГС.
4. Исследовать способность полученных МКА взаимодействовать с
натуральным антигеном NS4 в клетках печени больных ХГС.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ.
1. Установлено, что положительные цепи РНК (плюс-РНК) ВГС
достоверно чаще выявляются в печени, чем в периферической крови (в
сыворотке крови и лимфоцитах) больных ХГС. Отрицательные цепи
(минус-РНК) ВГС обнаружены в ткани печени и не обнаружены в
лимфоцитах периферической крови больных ХГС.
2. Показано, что прогрессирование поражения печени
сопровождается уменьшением частоты выявления минус-РНК ВГС, что
может свидетельствовать о подавлении репликации вируса при серьезных
воспалительных процессах в печени.
3. В печени части пациентов после интерферонотерапии обнаружена
РНК ВГС при отсутствии этого маркера в сыворотке, что свидетельствует
о необходимости определения вирусной РНК в печени после лечения.
4. Получена панель моноклональных антител, выявляющих 5
индивидуальных антигенных детерминант неструктурного белка NS4 ВГС.
5. Разработан метод выявления белка NS4 ВГС в криостатных срезах
печени больных ХГС на основе полученных моноклональных антител.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
Установлено, что частота выявления РНК ВГС максимальна в ткани печени и значительно ниже в сыворотке крови больных ХГС.
В лимфоцитах периферической крови антигеномная форма РНК ВГС не выявлена.
Получено 6 гибридом, продуцирующих МКА, направленные к пяти антигенным детерминантам белка NS4 ВГС.
4. Показана принципиальная возможность выявления вирусного
белка NS4 в клетках печени больных хроническим гепатитом С с помощью
полученных МКА.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Клиническое течение гепатита С
Заражение вирусом гепатита С приводит к развитию инфекции с острым течением. Длительность инкубационного периода ОВГС составляет чаще всего 6-8 недель, однако может колебаться от 2 до 26 недель [1, 65]. Продолжительность инкубационного периода зависит от многих факторов, основными из которых являются концентрация вируса в инфицирующем материале и состояние иммунной системы хозяина.
Острая ВГС инфекция диагностируется редко, протекает преимущественно субклинически, в безжелтушной форме, составляющей до 95% всех случаев ОВГС. Изучение клинической картины посттрансфузионного гепатита С показывает, что классические признаки заболевания выражены умеренно или отсутствуют, желтушная форма в этой группе больных встречается у 25%, повышение уровня аминотрансфераз сыворотки (ACT, АЛТ) колеблется от 10- до 30-кратного уровня с периодами нормализации. В отдельных случаях наблюдаются тяжелые формы заболевания, неотличимые от таковых при ОВГА или В [65].
Выздоровление после острого гепатита происходит у 15-20% переболевших. Наиболее характерным признаком гепатита С является частое развитие хронического гепатита, который регистрируется у 80% перенесших острый гепатит. Развитие хронического гепатита не зависит от тяжести течения острого заболевания [1]. Перстистирование ВГС инфекции дает широкий спектр клинико-морфологических вариантов: от стойких признаков активного заболевания и продолжающегося повреждения печени до состояния клинического выздоровления от острой инфекции с нормализацией уровня АЛТ, очень низким уровнем вирусной репликации и непрогрессирующим характером гистологических изменений. Результаты индикации анти-ВГС антител могут быть разными, периодически они исчезают, затем появляются вновь. Это в значительной мере связано с их малым содержанием, трудностью выявления низких концентраций.
В 20% случаев хроническое течение болезни приводит к циррозу печени, который у 10% развивается в гепатокарциному [4, 9]. Большинство авторов сообщают, что от момента заражения до первых клинических и/или проявлений, выявленных лабораторными методами, хронического гепатита проходит длительный латентный период - 10-18 лет, признаки цирроза печени могут стать очевидными на 20-21 году заболевания, гепатоцеллюлярная карцинома может диагностироваться через 23-29 лет от начала инфекции [65, 213, 214]. Показано, что эволюция ХГС в цирроз в 18 раз быстрее у лиц старше 50 лет по сравнению с молодыми [100]. Наряду с возрастом, в котором произошло заражение ВГС, ряд других факторов коррелирует с частотой прогрессирования в цирроз печени: длительность инфекции, степень выраженности гистологических изменений [200].. Состояние иммунной системы хозяина, уровень виремии, наличие других заболеваний, в первую очередь алкоголизма, коинфекции гепатотропными вирусами, вирусом Эпштейна-Барр, ВИЧ, влияние гепатотоксических лекарств также могут обусловить быстрое прогрессирование в цирроз. Риск развития гепатоцеллюлярной карциномы при ВГС инфекции в три раза выше, чем при инфекции вирусом гепатита В. Факторами риска развития ГЦК является возраст старше 60 лет, мужской пол, lb, 2а, 2Ь генотипы вируса, высокая активность хронического гепатита. Противовирусная терапия увеличивает вероятность предотвращения развития хронического гепатита в ГЦК [146].
При бессимптомном течении ХГС анти-ВГС антитела обнаруживаются при случайном обследовании. Отсутствие почти у половины больных ХГС факторов риска заражения в анамнезе, субклиническое течение, длительный латентный период являются причинами поздней диагностики ВГС инфекции (в далеко зашедших стадиях болезни) [3]. Для лечения хронического гепатита С используется интерферон. Однако эффективность такого лечения нельзя признать высокой. Ремиссия наступает у 15-30% больных, получавших 3 млн. единиц интерферона 3 раза в неделю в течение 6 месяцев [88, 215]. Критериями долговременного ответа на лечение считаются отрицательный результат анализа РНК ВГС в сыворотке крови и нормальный уровень аминотрансфераз в течении, как минимум, 6 месяцев после окончания терапии [215]. При длительном ответе наблюдается также улучшение гистологической картины. У второй группы пациентов (около 45%) первоначально возникший положительный ответ сменяется возобновляющейся репликацией вируса, когда он вновь появляется и в сыворотке крови, и в клетках печени. Третью группу (25-40%) составляют пациенты, не отвечающие на интерферонотерапию. По данным Sugano М. и соавт. [227] у ответивших на терапию больных уровень РНК ВГС до лечения не превышал 10 копий/мл в сыворотке, и 10 копий/мг в печени. После лечения вирусная РНК не определялась ни в сыворотке крови, ни в печени этих больных (чувствительность использованного авторами метода количественного определения РНК ВГС составляла 100 копий/мл). У пациентов с рецидивом болезни уровень РНК ВГС хотя и уменьшался, но оставался персистирующим. Таким образом, для долговременного ответа требуется элиминация вируса из сыворотки и печени больных [227]. Существует и другая точка зрения на влияние вирусной "нагрузки" на эффективность лечения интерфероном. В работе Negro F. и соавт. [164] отрицается существование прямой связи между внутрипеченочным уровнем РНК ВГС и ответом на интерферонотерапию.
Структура и функции вирусных белков
Процессинг полипротеина-предшественника происходит на мембранах эндоплазматического ретикулума [206]. В нарезании структурных вирусных белков участвуют хозяйские протеиназы, тогда как в процессинге неструктурных белков - вирусные (Zn-зависимая металлопротеаза и сериновая протеаза) [127]. В результате процессинга полипротеина образуется 10 зрелых белков [52]. Общую схему протеолитического расщепления можно представить следующим образом. Под действием сигнальной пептидазы эндоплазматического ретикулума расщепляется сайт соге-Е1 с образованием так называемого "заякоренного" сердцевинного белка, имеющего гидрофобные сегменты на С-конце, которые впоследствии удаляются вирусспецифической Zn-зависимой металлопротеазой (доменом, состоящим из С-концевой части NS2 и N-концевой NS3) [206]. Следующим этапом после образования core происходит нарезание по сайтам Е1-Е2 и NS2-NS3. Расщепление NS2-NS3 происходит автокаталитически, благодаря Zn-зависимой металлопротеиназной активности [113].
Из образовавшегося предшественника Е1 массой 35 кД удаляется С-концевой участок и образуется зрелый Е1 [73]. Позднее расщепляется сайт p7-NS2 с помощью сигнальной пептидазы. Ранее р7 рассматривали как часть структурного гликопротеина Е2. Но затем появились сообщения, что в N-концевом регионе Е2 имеется дополнительный сайт для сигналазы эндоплазматического ретикулума, поэтому предполагают существование свободного р7 белка [154]. Клеточная пептидаза не до конца разрезает сайт Е2-р7, вследствие этого образуются три продукта: Е2, Е2-р7 и р7 [127]. Для созревания NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B необходима вирусная сериновая протеиназа, локализующаяся в N-концевой трети NS3 белка. Доказано, что NS4A выступает как кофактор NS3, усиливая протеолитическую активность последнего.
Белок С (core) содержит 23,5% основных аминокислот - аргинина и лизина [206]. Предполагается, что он ассоциирован с вирусной геномной РНК, формируя нуклеокапсид. N-концевая область core-белка богата основными аминокислотами, С-концевая - гидрофобными. В центре находится амфипатический регион с двумя предсказываемыми а спиральными сегментами (123-134 и 147-162 а.о.). Эта область включает Leu или гидрофобные остатки в каждой седьмой позиции и, возможно, отвечает за ассоциацию core друг с другом [251]. На модельной системе показано, что при процессинге вирусного полипротеина образуются три различных продукта гена С - белки с молекулярной массой (М.м.) 21 кД (р21), 19 кД (р19) и 16кД (р16). Эти белки имеют одинаковые N- и разные С-концевые аминокислотные последовательности.
Иммунофлюоресцентный анализ внутриклеточной локализации различных core-бел ков ВГС показал, что р21 и р19 находятся в цитоплазме на гладком и шероховатом эндоплазматическом ретикулуме, в то время как р обнаружен в ядре [129]. Yasui К. и соавт. [252] идентифицировали 2 формы core-белка с М.м. 21 кД (р21) и 23 кД (р23). С-конец р23 - это 191 а.о. полипептида, а р21 является результатом расщепления между 174 и 191 а.о. Белок р23 созревает до р21 в цитоплазме. р21 может выявляться как в цитоплазме, так и в ядре, при этом в ядре его структура более упорядочена [252]. Имеются данные, что р16 может регулировать экспрессию клеточных генов [189, 190], в частности, онкогенов [228]. Белки нуклеокапсида образуют в цитоплазме мультимерные комплексы, которые являются предшественниками формирующегося нуклеокапсида [144]. Белок сердцевины ВГС способен связывать вирусную РНК и 60S рибосомальную субъединицу in vitro. Кроме того, он способен взаимодействовать с Е1 в мембране эндоплазматического ретикулума, за эти процесса ответственен С-концевой гидрофобный регион core [130]. Показано, что белок нуклеокапсида ВГС способен ингибировать репликацию ВГВ [216] и ВИЧ [225]. Ингибирующий эффект описан в области N-концевых аминокислот, предположительно 102-122 а.о. [216]. Кроме того, core-белок подавляет програмированную клеточную гибель (апоптоз) и взаимодействует с цитоплазматичекои частью рецептора лимфотоксина-Р, выполняя, по-видимому, иммуномодулирующие функции [41].
В состав оболочки ВГС входят два гликопротеина - gp31 (El) и gp70 (Е2). Эти белки образуются в результате гликозилирования предшественников с молекулярными массами 21 кД и 36 кД. Обнаружен сиквенционный мотив Asn-Xhr-Ser, соответствующий сайтам гликозилирования белков оболочки, встречающийся 5-6 раз в белке Е1 и 9-11 раз в белке Е2 [207]. Оба белка в С-концевых областях содержат гидрофобные домены, которые, вероятно, заякорены в мембране. Имеются данные, что Е1 и Е2 образуют между собой комплекс за счет дисульфидных мостиков или нековалентных ассоциаций [61]. Предполагают, что гетеродимер Е1-Е2 представляет собой
функциональную субъединицу, погруженнную в липидную оболочку вириона. Интересной особенностью Е1, ассоциированного с мембранной структурой, является его способность связываться с субгеномной цепью РНК. Возможно, это часть репликативного комплекса, которая была захвачена при сборке вирусной частицы [218]. Внутри белка Е2 установлено наличие двух гипервариабельных областей - HVR1 (390-410 а.о.) и HVR2 (474-480 а.о.) [91]. Высокая частота мутаций, ассоциированная с областью HVR1, является, вероятно, результатом пресса со строны имммунной системы хозяина. Идентифицирован клеточный белок, связывающийся с Е2-белком ВГС. Это CD81, экспрессирующийся на поверхности некоторых типов клеток, включая лимфоциты и гепатоциты. Предполагают, что этот белок является рецептором или ко-рецептором ВГС [178].
Внутри предшественника белка Е2 имеется сайт нарезания для сигнальной клеточной пептидазы, которая отщепляет от Е2 еще один вирусный пептид - NS1 (р7). Этот пептид содержит в N-концевом регионе гидрофобный участок, который позволяет заякориваться в липидный бислой микросомальной мембраны. Предполагают, что р7 важен для освобождения вирионов из инфицированной клетки [154].
NS2 является гидрофобным мембранным белком массой 23 кД [52]. Он высвобождается из полипротеина-предшественника путем двух протеолитических расщеплений. N-конец этого белка отделяется от Е2/р7 полипептида расщеплением сигнальными клеточными пептидазами [154]. Разрыв между NS2 и NS3 опосредован вирусной NS2-NS3 протеиназой, состоящей из NS2 и домена сериновой протеиназы NS3 [52]. Активность сериновой протеиназы NS3 не требуется для расщепления связи между NS2 и NS3.
Выявление вирусных белков
Наряду с определением РНК, перспективным методом изучения активности вирусной репродукции является выявление вирусных белков. В качестве иммунных реагентов для детекции антигенов ВГС используются как моноклональные антитела [12, 81, 170, 203], так и поликлональные, полученные от экспериментально иммунизированных животных [81, 240] или больных хроническим гепатитом С людей [12, 170]. При этом, согласно данным одних авторов, результаты, полученные при использовании МКА, были подобны результатам, полученным с человеческими ПКА [170]. В других работах показано, что для определения антигенов ВГС в ткани печени больше подходят человеческие иммуноглобулины из анти-ВГС-положительных сывороток, поскольку они направлены к нативным вирусным антигенам [12].
К настоящему времени появилось достаточно большое количество работ, в которых авторы используют моноклональные антитела для изучения внутриклеточной экспрессии и локализации вирусных белков [12, 28, 36, 59, 81, 161, 170, 203, 205, 246]. Кроме диагностического значения, эти исследования представляют несомненный теоретический интерес, так как облегчают изучение характера взаимодействий хозяин-вирус на клеточном уровне, а также позволяют установить связь между вирусной экспрессией и стадией болезни [81].
При изучении внутриклеточного распределения белков ВГС большинство авторов указывают на их цитоплазматическую локализацию [28, 81, 203, 205]. Например, Kim J.E. и соавт. [106], исследовавшие экспрессию белков ВГС на модельной системе (клетки СНО-К1), показали, что core распределен в виде гранул около ядер. NS2 сконцентрирован в перинуклеарном пространстве. NS4A аккумулирован в эндоплазматическом ретикулуме и в аппарате Гольжди. NS3 определялся как в цитоплазме, так и в ядре, в ассоциации с NS4A - только в цитоплазме. NS4B, NS5A, NS5B распределены по цитоплазме инфицированных клеток [106]. Selby M.J. и соавт. [210] выявили core, El, Е2, NS4 в пределах эндоплазматического ретикулума, NS3 и NS5 - по всей цитоплазме. Есть данные, согласно которым укороченные с С-конца формы core могут выявляться в ядре [252].
Большой интерес представляет вопрос о связи экспрессии вирусных белков и активностью патологических процессов в печени. Согласно одним данным, число гепатоцитов, содержащих вирусные антигены, не коррелирует ни со степенью гистологических изменений в печени, ни с показателями биохимической активности [81, 161]. С другой стороны, Hiramatsu N. и соавт. [93] показали, что экспрессия антигенов ВГС в печени возрастала с увеличением степени поражения органа. Sansonno D., Damacco F. [201] обнаружили топографическую связь между очагами воспаления и некроза и гепатоцитами, экспрессирующими антигены ВГС, при остром гепатите, однако эта связь терялась при переходе болезни в хроническое состояние. Таким образом, вопрос о прямом цитопатическом действии ВГС требует дальнейших исследований.
Моноклональные антитела используются для выявления белка нуклеокапсида ВГС в сыворотках крови больных гепатитом С и "здоровых" доноров [99, 143, 175, 229]. Подобные исследования наталкиваются на две основные трудности: низкая концентрация вируса и блокирование антигенов ВГС антителами в составе иммунных комплексов [175, 221, 229]. Тест-системы на основе моноклональных антител, позволяющие определять белок нуклеокапсида не только на качественном, но и на количественном уровне, могли бы служить простой альтернативой дорогостоящему методу ПЦР и существенно обогатить возможности диагностики и контроля за течением гепатита С.
Таким образом, развитие знаний по молекулярной биологии вируса гепатита С, всестороннее исследование структуры вирусного генома, изучение процессинга и функций белковых продуктов и их антигенное картирование создает широкие возможности для разработки эффективных диагностических и профилактических средств, направленных на борьбу с этой опасной инфекцией. Однако, не смотря на значительный прогресс наших знаний, многие вопросы патогенеза, ранней диагностики и специфического лечения гепатита С остаются нерешенными. К открытым вопросам патогенеза гепатита С относятся механизмы хронизации заболевания, повреждения клеток печени и степень вовлеченности в патологический процесс различных органов и тканей, помимо печени. Существенно ограничивает диагностику отсутствие доступных тест-систем для детекции вирусных белков. Все вышеизложенное определило направленность наших исследований во-первых, на изучение закономерностей выявления вирусной РНК при разной степени активности хронического гепатита, а во-вторых, на получение иммунных реагентов (МКА) для детекции белков ВГС в организме больных.
Выявление репликативной формы РНК вируса гепатита С
Срезы нескольких пациентов были дополнительно окрашены моноклональной ПАП-системой ("Sigma", США) в разведении 1:100 на PBScl%BCA.
Срезы докрашивали гематоксилином ("Shandon", США). Срезы печени от ВГС-негативных пациентов, а также МКА, специфичные к белкам других вирусов (МКА 9-4 к поверхностному белку вируса клещевого энцефалита и МКА МАХ 13-3 к полимеразе ВИЧ) были использованы в качестве негативных контролей.
Результаты иммуногистохимического окрашивания оценивали с помощью светового микроскопа "Opton" (Германия). Учитывали количество окрашенных клеток в препарате и относительную интенсивность окрашивания.
Подсчет значений среднего арифметического (М), его среднеквадратичного отклонения (SEM), а также коэффициента корреляции (г) проводили с использованием компьютерной программы "GraphPAD InStat v. 1.12а" (Univ. of Washington), США. При этом считали, что при значениях г 0,3 корреляция между исследуемыми признаками отсутствует, при значениях 0,3 г 0,69 существует средняя степень корреляции, при г 0,7 -высокая степень корреляции [2]. Достоверность различий между изучаемыми параметрами оценивали по t-критерию Стьюдента (для параметрических значений) и U-тесту Манн-Витнея (для непараметрических значений). Критерием достоверности различий принималась вероятность р 0,05.
Для выявления РНК вируса гепатита С были использованы образцы ткани печени, сывороток и лимфоцитов периферической крови от 87 пациентов с диагнозом хронический гепатит С. Присутствие геномной РНК вируса установлено в 71 (81,6%) из 87 исследованных образцов пункционной биопсии печени. При исследовании лимфоцитов периферической крови пациентов позитивную РНК вируса выявили в 47 (66,2%) из 71 исследованного образца. В сыворотках РНК ВГС выявлена в 47 из исследованных 87 случаев, что составляет 54%. Таким образом, уровень детекции РНК ВГС в печени достоверно выше этого показателя для сыворотки крови (р 0,01) и периферических лимфоцитов (р 0,05). Одновременно в трех субстратах геномная РНК выявлена у 27 пациентов (38%), в печени и лимфоцитах - у 17 (24%), только в печени - у 14 (20%). Не обнаружена ни в одном из образцов - у 9 (0,1%).
Для исследования вопроса, насколько присутствие вируса в печени связано с детекцией позитивной РНК в периферической крови, а именно -в сыворотке и лимфоцитах, был проведен корреляционный анализ и вычислен коэффициент линейной регрессии (г). Корреляционный анализ показал наличие средней степени корреляции между частотой выявления +РНК в печени и лимфоцитах периферической крови (г=0,38, р=0,001) (Табл. 3). Между присутствием +РНК в печени и детекцией ее в сыворотке крови корреляция отсутствовала (г=0,25, р 0,05). Средняя степень корреляции (г=0,47, р 0,0001) была обнаружена между выявлением геномной РНК в сыворотке и лимфоцитах периферической крови.
С целью изучения роли ВГС в развитии заболевания исследовали связь между частотой выявления РНК ВГС и активностью патологического процесса, оцениваемому по значению ИГА, ГИС и уровню АЛТ на момент пункции печени и взятия крови. Из представленных на таблице 3 данных следует, что между частотой детекции геномной РНК вируса как в печени, так и в периферической крови и значениями ИГА и ГИС, прямая связь отсутствует (р 0,05). С другой стороны, обнаружена средняя степень корреляции между выявлением РНК ВГС в печени и уровнем АЛТ. Связи между частотой обнаружения геномной РНК ВГС в лимфоцитах и сыворотке крови и уровнем АЛТ не выявлено.
Нужно отметить, что хотя уровень АЛТ отражает активность воспалительно-некротических (ИГА) и процессов замещения гепатоцитов соединительной тканью (ГИС) (р 0,05), значения коэффициента корреляции между этими показателями были невелики. Между величиной ИГА и уровнем АЛТ г=0,29, между значением ГИС и АЛТ - г=0,32 (Таблица 3).
С целью более подробного изучения частоты выявления +РНК ВГС при разной активности патологического процесса пациенты были разделены на группы в зависимости от значения ИГА, ГИС и уровня АЛТ. На рисунке 4 представлены результаты выявления РНК ВГС в организме больных с разной активностью хронического гепатита (Рис.4а) и склеротических изменений в печени (Рис.4б).
Как видно из рисунка, во всех группах вирусная РНК в сыворотке, лимфоцитах периферической крови и в печени выявлялась приблизительно с одинаковой частотой (различия между группами статистически недостоверны, р 0,05).
При изучении двух групп пациентов - с нормальным и повышенным уровнем АЛТ оказалось, что у больных с повышенным уровнем фермента РНК ВГС в печени выявлялась достоверно чаще (р 0,01) (Рис.5). Чаще вирусная РНК выявлялась и в лимфоцитах периферической крови этих больных, однако различия статистически недостоверны (р 0,05). Не выявлено также достоверных различий в частоте выявления +РНК ВГС в сыворотке крови.
