Структура и РНК-связывающие свойства бактериального регулятора экспрессии генов-белка Hfq Васильева Юлия Михайловна

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы. Регуляторная роль белка Hfq в жизнедеятельности бактериальных клеток 6

1.1. Образование комплексов белка Hfq с некоторыми мРНК как фактор регуляции трансляции 8

1.2. Участие белка Hfq в регуляции трансляции rpoS мРНК малыми нетранслируемыми РНК Е. coli 13

1.3. Hfq — белок, неспецифически связывающийся с РНК 17

1.4. Роль Hfq в метаболизме поли(А) 18

1.5. Участие Hfq в формировании бактериального нуклеоида 20

1.6. Белок Hfq - Sm-подобный белок бактерий 21

1.7. Пространственные структуры белка Hfq и его гомологов 25

2. Материалы

2.1. Химические реактивы и ферменты 34

2.2. Растворы 35

2.3. Питательные среды 36

2.4. Бактериальные штаммы 36

2.5. Плазмиды 36

3. Методы

3.1. Методы генной инженерии

3.1.1. Выделение хромосомной ДНК Е. coli 38

3.1.2. Выделение плазмидной ДНК Е. coli 38

3.1.3. Очистка плазмидной ДНК равновесным центрифугированием в градиенте CsCl 39

3.1.4. Получение компетентных клеток Е. coli 39

3.1.5. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК 40

3.1.6. Получение штамма-суперпродуцента белка Hfq Е. coli 40

3.1.7. Получение штамма-су пер продуцента белка Hfq P. aeruginosa 41

3.1.8. Получение штаммов, продуцирующих селенометиониновые производные белков EcoHfq и PaeHfq 43

3.1.9. Получение конструкций для транскрипции in vitro OxyS, RprA, RyhB и DsrA РНК 43

3.2. Методы работы с белками

3.2.1. Выделение и очистка рекомбинантного белка EcoHfq 46

3.2.2. Выделение и очистка рекомбинантного белка PaeHfq 47

3.2.3. Гель-электрофорез белков в ПААГ в присутствии SDS 48

3.3. Анализ гомогенности и оценка молекулярных весов полученных препаратов EcoHfq и PaeHfq

3.3.1. Проведение гель-фильтрационной хроматографии препарата белка EcoHfq 48

3.3.2. Проведение аналитического ультрацентрифугирования в шлирен-системе препаратов белков EcoHfq и PaeHfq 49

3.4. Методы работы с РНК и РНК-белковыми комплексами

3.4.1. Т7 транскрипция in vitro OxyS, DsrA, RprA и RyhB РНК 50

3.4.2. Гель-электрофорез РНК в ПААГ в присутствии 8 М мочевины 50

3.4.3. Получение и очистка равномерно Р-мечешнлх DsrA, RprA и RyhB РНК 51

3.4.4. Определение кажущихся констант диссоциации РНК-белковых комплексов 51

3.4.5. Метод гель-шифта 52

3.5. Кристаллизация белка PaeHfq 53

3.6. Сбор дифракционных данных 53

4. Результаты и их обсуждение

4.1. Получение штаммов-суперпродуцентов белков Hfq Е. соІІ и P. aeruginosa 55

4.2. Выделение гомогенных растворимых препаратов белков EcoHfq и PaeHfq из штаммов-суперпродуцентов 57

4.3. Проверка гомогенности полученных белковых препаратов 60

4.4. Получение регуляторных DsrA, RprA, RyhB и OxyS РНК Е. coli 63

4.5. Исследование РНК-связывающих свойств белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa 65

4.6. Кристаллизация белка Hfq P. aeruginosa 68

4.7. Сбор дифракционных данных 70

Выводы 72

Список цитируемой литературы 73

• Участие белка Hfq в регуляции трансляции rpoS мРНК малыми нетранслируемыми РНК Е. coli
• Питательные среды
• Выделение и очистка рекомбинантного белка PaeHfq
• Сбор дифракционных данных

Введение к работе

Введение

Изучение регуляции экспрессии генов является одной из наиболее важных задач молекулярной биологии. Осуществление контроля экспрессии генов происходит как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции и представляет собой достаточно сложную систему взаимодействий многих молекул. Для детального понимания механизмов этого процесса необходимо знание структурной организации различных его компонентов.

Белок Hfq является одним из ключевых регуляторов экспрессии бактериальных генов. Он контролирует трансляцию многих клеточных мРНК. Hfq взаимодействует с данными мРНК и меняет их вторичную структуру, а также связывается с различными нетранс л ируемыми малыми регуляторними РНК. Механизм взаимодействия белка Hfq с РНК пока ещё не известен. Данный белок является высококонсервативным среди бактерий, его гомологи найдены также у архей и эукариот. На сегодняшний день определены пространственные структуры нескольких эукариотических и архейных гомологов Hfq, а также недавно решены структуры двух бактериальных белков Hfq. Данная диссертация посвящена разработке методов выделения белков Hfq бактерий Escherichia col і и Pseudomonas aeruginosa, изучению их РНК-связывающих свойств, а также кристаллизации белка Hfq для структурных исследований.

Полученные штаммы-суперпродуценты белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa используются для препаративного выделения данных белков. Ауксотрофные по метионину штаммы-суперпродуценты белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa используются для препаративного выделения тяжелоатомных производных данных белков, у которых атомы серы в метиониновых остатках заменены атомами селена. Разработанные для данных белков методики выделения из биомассы полученных штаммов позволяют быстро получать высокоочищенные препараты нативных и

Введение

модифицированных белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa в больших количествах.

Полученные специальные конструкции с клонированными под контроль Т7-промоторов измененными генами регуляторных OxyS, DsrA, RprA и RyhB РНК Е. coli позволяют синтезировать in vitro данные РНК в препаративных количествах с минимальными затратами ресурсов. Получены комплексы белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa с регуляторними DsrA, RprA и RyhB РНК. Исследована стабильность данных комплексов, и измерены константы их диссоциации в разных солевых условиях.

Проведен поиск условий кристаллизации и получены кристаллы Hfq P. aeruginosa, получены тяжелоатомные производные кристаллов данного белка. Нативные кристаллы и их тяжелоатомные производные использованы для сбора кристаллографических данных и определения пространственной структуры белка Hfq P. aeruginosa с разрешением 1.6 А.

Полученные штаммы-суперпродуценты, разработанные методики выделений и выделенные нами препараты белков Hfq Е, coli и P. aeruginosa, а также конструкция для транскрипции in vitro малой регуляторной OxyS РНК, связывающейся с белком Hfq, используются для функциональных исследований в Институте молекулярной генетики (Вена, Австрия).

Обюр литературы

1. Обзор литературы. Регуляторная роль белка Ilfq в жизнедеятельности бактериальных клеток

Hfq (другое название HF1) является высококонсервативным термостабильным бактериальным белком с молекулярной массой около 10 кДа. Он кодируется геном hfq, расположенным в хромосоме Escherichia сой на 94.8 мин (Kajitani & Ishihama, 1991) и входящим в состав mutL-miaA оперона (Tsui & Winkler, 1994). Экспрессия гена hfq заметно увеличивается в стационарной фазе роста клеток (Tsui et ah, 1997).

Hfq был открыт в конце 70-х годов прошлого столетия как клеточный белок Е. coli, принимающий участие в репликативном цикле бактериофага QP in vitro (Kajitani & Ishihama, 1991; Franze de Fernandez et ah, 1968; Franze de Fernandez et ah, 1972; Su et ah, 1997). В более поздних экспериментах in vivo было показано, что Hfq плавит 3'-конец "+" цепи фаговой РНК и обеспечивает взаимодействие Qp репликазы с данным районом РНК и начало синтеза "-" цепи (Barrera et ah, 1993; Schuppli et ah, 1997). В неинфицированных бактериальных клетках белок Hfq является полифуикциональным регулятором трансляции большого числа мРНК, включая мРНК белков репарации ДНК (Tsui et ah, 1997). Hfq действует как прямо (связываясь с мРНК контролируемого гена и стимулируя её трансляцию, синтез поли(А) или деградацию), так и опосредованно (через стимуляцию трансляции мРНК другого глобального клеточного регулятора - о субъединицы бактериальной РНК-полимеразы), Мутация по гену hfq репрессирует либо активирует синтез более 50 белков (Muffler et ah, 1997). Hfq обладает сильным сродством к РНК, в особенности к AU-богатым последовательностям (Senear & Steitz, 1976). В нескольких работах биохимическими методами и с помощью электронной микроскопии было показано, что бактериальный Hfq в растворе существует в виде гексамера (Franze de Fernandez et ah, 1968; Васильева и др., 2002; Zhang et ah, 2002).

Обзор литературы

Гены hfq обнаружены более чем в семидесяти из ста сорока прокариотических геномов, для которых известны полные нуклеотидные последовательности, причём, у некоторых организмов ген hfq дуплицирован (Sun et al., 2002).

Разнообразие фенотипов, наблюдающееся в штаммах Е. coli с нокаутированным геном hfq, включает в себя уменьшение негативного суперскручивания плазмид в стационарной фазе роста, повышение осмочувствительности, чувствительности к окислителям и УФ-излучению, а также снижение скорости роста и количества клеток в культуре и ускорение окисления углеродных ресурсов клетки (Tsui et al., 1994).

pFUKP >PYLN. MAKGQSLQD MAKGQSLQD MAKGQSLQDPY

Е. coli

S. typhimurium H. influenzae Y.enterocolitica Sh. flexneri P. multocida Ph. profundum

IKLQGQIESFDQFVILLKOT

iklqgqiesfdqfvillkn'] iklqgqiesfdqfvillkn1

,vngiklqgqvesfdqfvillkna lvngiklqgqiesfdqfvillkn1

|і^и-ylvngiklqgqiesfdqfvillkn']

E. coli

S. typhimurium H. influenzae Y.enterocolitica Sh. flexneri P. multocida Ph. profundum

VlSgPHj ||S||jAGGGTSSNYHHGSSAQNTSAQQDSEETE 102

чИН ^1HSN^{NAGGGAS:NNYHHGSNA}^^GSTA^^^{DSEETE 102}

«vl&lsH iHNNMHHTAPTEAVENVETQAE 91

TVvIsipMBsHlpSGS-TNNYHGSNPSAPQQPQQDSDDAE 101

QMVYKHAISTV 62

|v|A|S VS HHN1SNNSNQQNYQQEQQTD SNVEKAE 96

QMVYKHAISTVr-1 64

идентичные остатки гомологичные остатки

Рис. 1. Сравнение последовательностей некоторых бактериальных белков Hfq.

N-концевые части белков Hfq бактерий очень консервативны, тогда как С-концевые заметно отличаются (рис. 1). Недавно было обнаружено, что гомолог Hfq из бактерии Pseudomonas aeruginosa, который в С-концевой области на 20 аминокислотных остатков короче белка Hfq Е. coli, полностью функционально замещает данный белок в клетках Е. coli с инактивированным геном hfq (Sonnleitner et al., 2002).

Обзор литературы

1.1. Образование комплексов белка Hfq с некоторыми мРНК как фактор регуляции трансляции

Hfq принимает участие в контроле трансляции многих бактериальных мРНК, выступая в роли как положительного, так и отрицательного регулятора. При связывании данного белка с регулируемой мРНК происходит изменение её вторичной структуры и, как следствие, изменение стабильности мРНК или уровня её трансляции.

11 t'q

30S l||q /">

І * ї \ Г

^тР^{А МРНК} 3' - 5'^^ЩІТ"^ отрА мРНК

І!Ч

—II—„

~«ни

Рис. 2. Схема регуляции стабильности отрА мРНК при участии белка Hfq. а - Участки узнавания РНКазой Е вовлечены в образование вторичной структуры или закрыты транслирующими рибосомами, мРНК стабильна. б - При связывании Hfq меняется вторичная структура мРНК, участки узнавания РНКазой Е становятся одноцепочечными и разрезаются деградосомой, кроме того, изменение вторичной структуры мРНК приводит к прекращению трансляции и рибосомы больше не защищают данные участки, что также ведет к деградации мРНК.

В экспериментах по изучению времени полужизни отрЛ мРНК Е. coli, кодирующей основной белок внешней мембраны и транслирующейся в зависимости от фазы роста, показано, что в стационарной фазе роста белок Hfq связывается со шпилькой в 5'-нетранслируемой области мРНК и способствует её деградации РНКазой Е (Vytvytska et al., 1998). Механизм такой регуляции трансляции достаточно хорошо изучен (рис. 2). Во время трансляции в экспоненциальной фазе роста (при недостатке Hfq) инициирующие 30S субчастицы рибосом связываются с отрА мРНК и защищают её от разрезания РНКазой Е. В стационарной фазе роста Hfq конкурирует с 30S

Обзор литературы

субчастицами за участок связывания рибосом на отрА мРНК и препятствует образованию тройственного инициаторного комплекса: трансляция репрессируется, сайты узнавания РНКазой Е больше не защищаются элонгирующими рибосомами, и происходит разрезание мРНК деградосомой (Vytvytska et ai, 2000).

Кроме того, при присоединении Hfq меняется вторичная структура мРНК и сайты узнавания РНКазой Е, входившие ранее в состав двуцепочечных структур и защищенные таким образом (McDowall et al., 1995), становятся открытыми и также разрезаются деградосомой (Chen et al, 1991; Rosenbaum et al, 1993). Существуют также данные о том, что участки узнавания белком Hfq и РНКазой Е на некоторых мРНК и регуляториых РНК совпадают (Moll et ai, 2003).

Сходный механизм регуляции продолжительности жизни мРНК при помощи Hfq и эндонуклеаз показан и в некоторых других случаях. Например, присоединение Hfq дестабилизирует mutS мРНК, кодирующую белок репарации ДНК, узнающий дефекты комплементарное цепей при метилировании (у человека нарушения экспрессии гена, аналогичного mutS, обуславливают предрасположенность к заболеванию наследственным неполипозным раком прямой кишки). Таким же образом присоединение Hfq дестабилизирует и miaA-hfq котранскрипт (кодирующий белок, вносящий модификации ms²i⁶A-37 и і^бА-37 в тРНК, и белок Hfq, соответственно), что позволяет говорить об авторегуляции экспрессии белка Hfq (Tsui & Winkler, 1994; Tsui et al., 1997). Hfq также участвует в независимой от трансляции деградации некоторых мРНК (Ueno & Yonesaki, 2002).

Мутантный штамм Е. со И с делецией гена hfq продуцирует так называемые "миниклетки" удлинённой формы в результате асимметричного клеточного деления (Ward & Lutkenhaus, 1985). Этот эффект обусловлен увеличением синтеза белка клеточного деления FtsZ в

Обзор литературы

стационарной (но не в экспоненциальной) фазе. Эффективность трансляции и стабильность yfcZ мРНК контролируется РЫКазой Е (как и в случае регуляции трансляции отрЛ мРНК) (Takada et al., 1999). Высказываются предположения о том, что мутация по гену hfq, по-видимому, влияет на стабильность ftsZ мРНК (Cam et al., 1996). Показано также, что транскрипция гена ftsZ контролируется o^s субъединицей РНК-полимеразы, трансляция которой, в свою очередь, стимулируется белком Hfq (Cam et al., 1996).

a

FeSP

„FepA

"FhuE

FepA

Hfq/jRyhB

FeSP VfrV;

FhuE

Hfq

FeSP

Hfq/RyhB

Рис. 3. Схема регуляции содержания железа в клетке Е. coli.

а - При избытке железа в среде Hfq ингибирует синтез белков-транспортеров,

а мРНК белков-накопителей железа (на рисунке обозначены FeSP, Fe

Storage Proteins) транслируются. б - При недостатке железа в среде в клетке синтезируются транспортирующие

железо белки FepA и FhuE, а комплекс Hfq с регуляторной RyhB РНК

ингибирует синтез белков-накопителей железа.

Hfq является компонентом защитных механизмов, регулирующих содержание железа в клетке и включающихся при окислительном стрессе (рис. 3). При нокауте гена hfq у Е. coli повышается уровень экспрессии белков внешней мембраны FepA и FhuE, участвующих в транспорте ионов железа. В результате железо накапливается в клетке, что приводит к появлению гидроксил-радикалов и к повышению чувствительности клеток

Обзор литературы

к перекиси водорода. Таким образом, можно предположить, что в условиях избытка железа Hfq является негативным регулятором синтеза транспортирующих железо в клетку белков FepA и FhuE (Wachi et al., 1999). Недавно было показано, что Hfq в комплексе с регуляторной RyhB РНК в условиях недостатка железа обеспечивает снижение уровня продукции накапливающих железо белков (и тем самым высвобождение связываемого ими железа в цитозоль) и некоторых неважных для выживания клетки железосодержащих белков, а также снижение экспрессии sodB мРНК, кодирующей супероксиддисмутазу (Masse & Gottesmann, 2002; Vecerek et at., 2003). Известно, что комплекс Hfq-RyhB РНК контролирует экспрессию как минимум шести оперонов Е. coli, кодирующих связывающие и запасающие железо белки. Белок Hfq стабилизирует RyhB РНК, защищая её от разрезания РНКазой Е. Возможно, при взаимодействии RyhB РНК с её мРНК-мишенями белок Hfq высвобождается и открывает участки узнавания РНКазой Е, что приводит к деградации RyhB РНК (Masse et al._t 2003). Недавно было показано, что Hfq взаимодействует с sodB мРНК (кодирующей Fe-зависимую супероксиддисмуктазу), меняя её вторичную структуру и делая возможным её взаимодействие с RyhB РНК. Комплементарное взаимодействие sodB мРНК с RyhB РНК блокирует инициаторньш кодон и вызывает деградацию обеих молекул РНК (Geissmann & Touati, 2004).

Белок Hfq необходим также для функционирования малой антисмысловой Spot 42 РНК, осуществляющей контроль экспрессии генов галактозного оперона Е. coli, Hfq стабилизирует данную регуляторную РНК без изменения её вторичной структуры и значительно стимулирует образование комплементарных взаимодействий между Spot 42 РНК и galK' мРНК, входя в состав тройственного комплекса (Moller et ah, 2002а). Образование данного РНК-РНК комплекса препятствует посадке 30S

Обзор литературы

субчастиц рибосом на galK' мРНК и ингибирует инициацию трансляции (МиПег et at., 2002b).

В ряде случаев присоединение Hfq, по-видимому, стабилизирует мРНК. Например, гомологи белка Hfq у бактерий Azorhizobium caulinodans и Rhodobacter capsulatis, кодируемые геном nrfA, являются позитивными регуляторами и контролируют клеточный ответ на два экзогенных сигнала: присутствие азота и кислорода в среде. Предполагается, что эти белки (по оригинальной номенклатуре называемые NfrA) контролируют стабильность и уровень трансляции ni/Al, ni/A2 и an/A мРНК, кодирующих активаторы транскрипции каскада генов, ответственных за изменения клеточного метаболизма. Возможно, стабилизация транскриптов происходит в результате связывания данных гомологов Hfq с мРНК -мишенями, в результате чего их вторичная структура изменяется и происходит стимуляция инициации трансляции (Kaminski et ah, 1994; Kaminski & Elmerich, 1998; Drepper et ah, 2002). У патогенной бактерии Yersinia enterocolitica гомолог белка Hfq, кодируемый геном yrp (yersinia regulator for pleiotropic phenotype), положительно регулирует продукцию термостойкого энтеротоксина Y-ST, вызывающего диарею у кроликов (Nakao et aL, 1995). Механизм данного процесса регуляции пока не ясен, возможно, в нём принимает участие а субъединица бактериальной РНК-пол им еразы (см. следующую главу). У Brucella abortus ген hfq также играет важную роль в патогенезе и адаптации к внутриклеточным условиям жизни (Roop et aL, 2002). Предполагается, что его продукт отвечает за устойчивость к различным видам стресса во время стационарной фазы роста, в том числе за устойчивость к присутствию перекиси водорода и низкому рН среды. При инактивации гена hfq меняется вирулентность В. abortus: микроорганизм теряет способность к репликации в культуре макрофагов мыши и быстро элиминируется из печени и селезенки искусственно заражённых мышей (Robertson &

Обзор литературы

Roop И, 1999). Hfq является полифункциональным регулятором вирулентности и стрессового ответа у P. aeruginosa (Sonnleitner et aL, 2003).

1.2. Участие белка Hfq в регуляции трансляции rpoS мРНК малыми

петранслируемыми РНК . coli

Впервые малые нетранслируемые РНК были обнаружены в бактериальных клетках, затем - во всех живых клетках. Многие из них регулируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне, либо прямо взаимодействуя с мРНК, либо образуя комплексы с различными регуляторными белками. Малые РНК бактерий представляют собой достаточно стабильные молекулы, синтезирующиеся в клетках в больших количествах и участвующие в образовании РНК-РНК и РНК-белковых комплексов (Wassarman et al., 1999). У бактерий обнаружено более 50 видов малых регуляторных РНК (Argaman et al., 2001; Rivas et aL, 2001; Tang et aL, 2001; Klein et al., 2002; Masse et aL, 2003). Гены относящихся к данному семейству РНК обладают некоторыми сходными особенностями (Hershberg et aL, 2003). Показано, что многие из этих РНК взаимодействуют с белком Hfq (Wassarman et aL, 2001).

Белок Hfq является положительным регулятором экспрессии гена rpoS, кодирующего a^s (или о ) субъединицу бактериальной РНК-полимеразы (Muffler et aL, 1996; Brown & Elliott, 1996). Экспрессия

гена, кодирующего а субъединицу РНК-полимеразы, индуцируется в стационарной фазе роста или при голодании клетки (Тапака et aL, 1993). a^s регулирует экспрессию генов, необходимых при осмотическом стрессе, низком значении рН среды, недостатке кислорода, тепловом шоке, голодании или переходе клетки в стационарную фазу роста (Hengge-Aronis, 1993, 1996; Loewen & Hengge-Aronis, 1994). Кроме того, данная субъединица регулирует синтез факторов вирулентности

Обзор литературы

нескольких патогенных видов бактерий, включая Salmonella typhimurium (Fang, 1992; Webb et al, 1999), Vibrio cholerae (Merrell et al., 2000), Shigella flexneri (Small et al, 1994), P. aeruginosa (Jorgensen et al, 1999; Suh et al., 1999), Legionella pneumophila (Hales & Shuman, 1999; Bachman & Swanson, 2001), Xenorhabdus nematophilus (Vivas & Goodrich-Blair, 2001) и Y. enterocolitica (Badger & Miller, 1995).

Регуляция экспрессии гена rpoS - сложный и пока до конца не исследованный процесс, в который вовлечено довольно большое количество белков и регуляторных РНК (Klauck et al., 1997; Webb et al.,

1999). Контроль синтеза о субъединицы РНК-полимеразы осуществляется на уровне транскрипции, трансляции и стабильности белка (Lange & Hengge-Aronis, 1994).

I.а

«

гpoS мРНК

Hfq/DsrA

II. о

rpoS мРНК

Трансляция

Hfq/O.xyS

Hfq/OxyS

rpoS мРВК

^fT"~"

Рис. 4. Схема регуляции экспрессии rpoS мРНК при участии Hfq и малых нетранслируемых DsrA и OxyS РНК.

I. а - Участок связывания рибосом (на рисунке обозначен SD) вовлечён в образование вторичной структуры, инициация трансляции затруднена, rpoS мРНК не транслируется. б - При присоединении комплекса Hfq с регуляторной DsrA РНК меняется вторичная структура rpoS мРНК, участок связывания рибосом становится доступен для инициирующих рибосом, идёт трансляция. П. а - Вторичная структура rpoS мРНК позволяет инициацию трансляции. б - При присоединении комплекса Hfq с регуляторной OxyS РНК меняется вторичная структура rpoS мРНК, участок связывания рибосом вовлекается в образование шпильки, трансляция репрессируется.

Обзор литературы

Hfq является одним из главных регуляторов экспрессии rpoS (Nogueira & Springer, 2000) (рис. 4). Предполагается, что Hfq стимулирует трансляцию rpoS мРНК, изменяя вторичную структуру 5'-нетранслируемой области мРНК недалеко от последовательности Шайна-Дальгарно и, тем самым, стимулируя связывание рибосом с транскриптом (Muffler et al, 1996; Brown & Elliott, 1996; Brown & Elliott, 1997; Cunning etal., 1998). Важную роль в узнавании белком регуляторного участка мРНК играет вторичная структура мРНК (Brown & Elliott, 1997). В механизме регуляции экспрессии гена rpoS участвуют несколько регуляторных нетранслируемых клеточных РНК: OxyS РНК (Altuvia et al, 1997; Zhang et al, 1998), DsrA РНК (Sledjeski & Gottesman, 1996; Majdalani et al, 1998; Lease & Belfort, 2000-a, 2000-b) и RprA РНК (Majdalani et al, 2001). Во всех трёх случаях в регуляции участвует также белок Hfq. Комплекс Hfq с OxyS РНК репрессирует трансляцию rpoS, тогда как комплексы Hfq с DsrA РНК или RprA РНК стимулируют ее (Zhang et al, 1998; Sledjeski et al, 2001; Repoila et al, 2003).

Ранее предполагалось, что регуляторные РНК связываются с белком Hfq, меняют его активность и таким образом влияют на трансляцию rpoS мРНК. Сейчас показано, что Hfq участвует в образовании тройственного комплекса, в состав которого входят мРНК-мишень (в данном случае rpoS мРНК) и регуляторная нетранслируемая РНК (Zhang et al, 2002; Moller et al, 2002; Brescia et al, 2003). Существуют два предположения о роли Hfq в данных тройственных комплексах: либо белок стабилизирует активную конформацию мРНК или регуляторной РНК, либо является "платформой" для посадки на мРНК дополнительных факторов, участвующих в контроле экспрессии гена (например, регуляторных РНК) (Hengge-Aronis, 2002).

При взаимодействии DsrA или RprA РНК с лидерной областью rpoS мРНК разрушается ингибирующая трансляцию вторичная структура мРНК (Majdalani et al, 2001). Таким образом, Hfq является не прямым

Обїор литературы

регулятором трансляции rpoS мРНК, а контролирует активность регуляторных РНК, влияя на их пространственную структуру и обеспечивая их взаимодействие с нужным участком мРНК. Например, при связывании Hfq с DsrA РНК вторичная структура РНК не изменяется, но значительно меняется ее' третичная конформация (Brescia et al., 2003). DsrA или RprA РНК действуют по сходному механизму, но в ответ на разные внешние сигналы: DsrA РНК осуществляет регуляцию трансляции rpoS мРНК при пониженных температурах (Repoila & Gottesman, 2001, 2003), тогда как RprA РНК действует в ответ на сигналы стресса клеточной поверхности (Majdalani et aL, 2002). Кроме того, DsrA РИК контролирует экспрессию некоторых других генов как на уровне трансляции (гены argR, UvIH, rbsD), образуя регуляторные комплексы с мРНК (Lease et al., 1998), так и на уровне транскрипции, путём регуляции синтеза о субъединицы РНК-полимеразы (гены rcsA, dsrB) (Sledjeski & Gottesman, 1995). Есть данные, что DsrA связывается непосредственно с 30S субчастицей рибосомы, не мешая при этом связыванию с 30S субчастицей RpoS мРНК и тРНКме, (Worhunsky et al., 2003), OxyS РНК репрессирует трансляцию rpoS в ответ на окислительный стресс. Показано, что OxyS РНК регулирует экспрессию не только rpoS, но и fhlA мРНК, кодирующей активатор транскрипции. При этом также происходит образование тройственного комплекса OxyS РНК с flilA мРНК и белком Hfq (Altuvia et al., 1998; Argaman & Altuvia, 2000; Zhang et al, 2002).

Недавно опубликованы данные, свидетельствующие об участии еще как минимум одной малой регуляторной РНК в стимуляции трансляции RpoS мРНК. Данная РНК также действует в комплексе с белком Hfq и является компонентом транспортной системы неорганического фосфата (Ruiz & Silhavy, 2003).

Обїор литературы

Несмотря на то, что o^s является регулятором экспрессии многих генов, около 40% генов, контролируемых белком Hfq, регулируются без участия этой субъединицы РНК-полимеразы (Muffler et al., 1997).

1.3. Hfq - белок, нсспецифически связывающийся с РНК

Недавно было показано, что белок Hfq относится к классу неспецифически связывающихся с РНК белков - так называемых РНК-шаперонов (Moller et ai, 2002; Zhang et al., 2002; Moll et al, 2003). Эти белки обнаружены во всех известных живых клетках и вирусах (Cristofari & Darlix, 2002). Идея существования данных белков как отдельного класса возникла около двадцати лет назад (Karpel et ah, 1982). Их отличие от специфически связывающих РНК белков заключается в существенно более низкой специфичности связывания РНК (Herschlag, 1995; Lorsch, 2002). РНК-шапероны взаимодействуют с различными типами РНК и являются необходимыми для поддержания теломерных участков хромосом, транскрипции ДНК, экспорта пре-РНК, сплайсинга, модификации, трансляции и деградации мРНК. Данный класс РНК-связывающих белков весьма разнообразен. Эти белки обеспечивают быстрое образование комплементарных РНК-РНК взаимодействий, обмен цепей и молекул РНК в предсуществующих РНК-РНК комплексах, восстанавливают структуру неправильно свёрнутых молекул РНК (Pontius & Berg, 1992; Herschlag et al., 1994) и участвуют в разрезании РНК рибозимами в физиологических условиях, индуцируя конформационные изменения в каталитических центрах РНК (Mayer et ai, 2001; Mohr et ai, 2002; Waldsich et ai, 2002).

Белок Hfq обладает высокой РНК-связывающей активностью, преимущественно связываясь с короткими U-богатыми участками РНК (Achsel et al., 2001). Hfq взаимодействует со многими молекулами РНК в бактериальных клетках, изменяя их вторичную структуру и образуя

Обзор литературы

бинарные и тройственные регуляторные комплексы. На основании вышеперечисленных фактов бактериальный белок Hfq относят к классу неспецифически связывающихся с РНК белков.

1.4. Роль Hfq в метаболизме поли(А)

Полиадеиилирование мРНК у прокариот значительно отличается от полиаденилирования в эукариотических системах. Например, в клетках Е. сої і всего лишь 2% от популяции мРНК полиаденилировано (Сао & Sarkar, 1992). Длина поли(А) участков бактериальных мРНК зависит от конкуренции между поли(А)-полимеразой и экзонуклеазами, атакующими 3'-конец мРНК, и сравнительно невелика: 10-40 нуклеотидных остатков (О*Нага et al., 1995). Кроме того, полиаденилироваться могут не только зрелые мРНК, но и фрагменты РНК, образующиеся в результате экзо- или эндонуклеазного расщепления. Функционально полиадеиилирование у прокариот и эукариот также различно: если у эукариот полиадеиилирование мРНК значительно продлевает время её полужизни, то у прокариот полиаденилированная РНК подвергается быстрой деградации (Dreyfus & Regnier, 2002).

В экспериментах in vitro Hfq значительно стимулирует синтез поли(А) на различных мРНК поли(А)-полимеразой I (увеличивая процессивность фермента) (Hajnsdorf & Regnier, 2000). В клетке Hfq влияет на увеличение длины олиго(А) у мРНК (Le Derout et al, 2003). Показано, что процессивность поли(А)-полимеразы I значительно зависит от вторичной структуры мРНК: полиадеиилирование мРНК, содержащей одноцепочечные 5' и 3' концы, происходит намного быстрее и с большей эффективностью (Feng & Cohen, 2000). Возможно, действие белка Hfq заключается в изменении вторичной структуры мРНК и увеличении её доступности для поли(А)-полимеразы I.

Обзор литературы

Есть предположения, что Hfq является гомологом эукариотического поли(А)-связывающего белка (РАВР И), защищающим в бактериальной клетке мРНК от экзорибонуклеаз и совместно с поли(А)-полимеразой участвующим в синтезе поли(А) участков РНК и контролирующим их длину (Edmonds, 2002) (рис. 5). Показано, что Hfq участвует в процессе неспецифического или низкоспецифического узнавания 3' концов РНК поли(А)-полимеразой I (Le Derout et ah, 2003). Недавно опубликованы данные о том, что Hfq защищает in vitro поли(А) участки мРНК от экзонуклеолитической деградации полинуклеотидфосфорилазой и РНКазой II (Folichon et al., 2003).

в 7 > иг, Щ

6 ІЬап/ 6 Щ

Рис. 5. Влияние связывания Hfq на удлинение поли(А) участков бактериальных мРНК.

а - В отсутствие Hfq существует равновесие между активностями поли(А) полимеразы I (ПАП) и 3'-экзорибонуклеаз (на рисунке обозначены звездочкой).

б - Присоединение Hfq защищает поли(А) участок мРНК от действия 3'-экзорибонуклеаз, что увеличивает процессивность ПАП.

Как уже было сказано выше, Hfq участвует не только в стабилизации, но и в деградации некоторых мРНК (Ueno & Yonesaki, 2002). Существует модель "программируемой деградации" РНК, согласно которой образуемые эндонуклеазами фрагменты РНК, содержащие одноцепочечные монофосфорилированные 5' концы, являются мишенями для полиаденилирования и дальнейшего действия деградосомы (Feng & Cohen, 2000). Влияя на вторичную структуру мРНК, Hfq принимает участие в определении участка полиаденилирования и последующей деградации мРНК. В состав деградосомы, кроме РНКазы Е и

I')

Обзор литературы

полинуклеотидфосфорилазы, также входит РНК-шаперон (DEAD-box РНК-хеликаза), который обеспечивает расплетание РНК для дальнейшего действия деградосомы (Carpousis et aL, 1999).

У эукариот основным механизмом распада мРНК является зависимое от удаления поли(А) декэпирование, приводящее к 5 —>3' деградации (Muhlrad et aL, 1994; Muhlrad et aL, 1995). Эукариотические гомологи Hfq (Sm белки) также участвуют в декапировании и деградации мРНК, обеспечивая взаимодействия между мРНК и декэпирующим комплексом, а также между мРНК и экзосомой (Boeck et aL, 1998; Thaurin et aL, 2000; He & Parker, 2001). По аналогии с эукариотическими системами предполагают, что в бактериальной клетке поли(А)-участки мРНК могут обеспечивать взаимодействие связанных с ними активаторов или репрессоров трансляции (в том числе Hfq) с 5'-операторами (Hajnsdorf & Regnier, 2000; Edmonds, 2002).

1,5. Участие Hfq в формировании бактериального нуклеоида

Большая часть клеточного Hfq (80-90%) локализована в цитоплазматической фракции и ассоциирована с рибосомами, тогда как 10-20% этого белка содержится во фракции нуклеоида (Kajitani et aL, 1994; Talukder et aL, 2000). С геномной ДНК E. coli ассоциированы двенадцать ДНК-связывающих структурных белков (Ishihama, 1999). Hfq обладает способностью неспецифически связываться как с суперскрученной, так и с линейной ДНК и наряду с другими белками участвует в формировании нуклеоида Е. coli (Takada et aL, 1997; Talukder & Ishihama, 1999). В экспоненциальной фазе роста Hfq является одним из трёх мажорных белков нуклеоида, тогда как в стационарной фазе его замещает белок Dps (рис. 6). Высказываются предположения, что Hfq может участвовать в регуляции репликации бактериальной ДНК (Talukder et aL, 1999).

Обзор литературы

структурные белки нуклеоида

Рис. 6. Схема изменения белкового состава нуклеоида Е. соїі в зависимости от фазы роста.

а - В экспоненциальной фазе роста Hfq является одним из мажорных

структурных белков реплицирующейся хромосомы. б - В стационарной фазе роста Hfq уходит в цитоплазму, его место на

хромосоме занимают другие структурные белки, нуклеоид становится

более компактным.

Поскольку Hfq является как ДНК-, так и РНК-связывающим белком, он может участвовать в регуляции сопряжения процессов репликации, транскрипции и трансляции в бактериальной клетке (Talukder & Ishihama, 1999).

1.6. Белок Hfq - Sm-подобный белок бактерий

Sm белки впервые были обнаружены в составе локализованных в ядре РНК-белковых антигенов, которые узнаются антителами пациентов, больных системной красной волчанкой (Mattioli & Reichlin, 1971; Lerner & Steitz, 1979). В настоящий момент известно, что у эукариот семь Sm белков (у человека это В/В', Dl, D2, D3, Е, F и G белки; номенклатура основана на их подвижности при электрофорезе в ПААГ с SDS - Lerner & Steitz, 1979). Они связываются с малыми ядерными РНК Ul, U2, U4/U6 и U5 и являются необходимыми для сборки сплайсосом (Не & Parker, 2000; Pannone & Wolin, 2000). Сплайсосома - это РНП комплекс, состоящий из пяти мяРНК (Ul, U2, U4, U5 и U6), входящих в состав мяРНП частиц, и более шестидесяти белков (Burge et al., 1999; Nagai et al., 2001; Will & Luhrmann, 2001; Stevens et ah, 2002). Sm белки образуют гетеромерные сердцевинные

Обзор литературы

домены сплайсосомных мяРНП частиц, стабилизируя мяРНК. Их присоединение к мяРНК служит сигналом гиперметилирования кэп-структур (Mattaj, 1986; Mattaj et al, 1993), что вместе с присутствием Sm белков является сигналом ядерной локализации (Fischer & Luhrmann, 1990; Hamm et al, 1990). Созревание сплайсосом происходит в ядре, где к ним присоединяются дополнительные белки (Zieve & Sauterer, 1990).

Родственные Sm белкам семь Sm-подобных (Lsm, Sm-Like) белков эукариот и архей (Lsm2-Lsm8) связываются с 3'-концевой U-богатой последовательностью малой ядерной РНК U6 (Achsel et at., 1999; Gottschalk et al, 1999; Mayes et al, 1999; Vidal et al., 1999; Pannone et al, 2001), взаимодействуют между собой (Salgado-Garrido et al, 1999; Mayes et al, 1999) и также образуют кольцевые гептамерные и гексамерные структуры, входящие в состав сплайсосом и участвующие в метаболизме РНК (Achsel et al., 1999; Achsel et al, 2001; Collins et al, 2001; Того et al, 2001). U6 мяРНК синтезируется РНК-полимеразой ПІ, в отличие от остальных мяРНК, входящих в состав сплайсосмы, синтезируемых РНК-полимеразой II (Dahlberg & Lund, 1991). После синтеза U6 мяРНК остается в ядре, где и происходит сборка РНП частицы (Baserga & Steitz, 1993). Роль Lsm белков в сплайсинге пока недостаточно ясна. Вероятно, они изменяют структуру U6 мяРНК и влияют на её функциональную активность (Не & Parker, 2000).

Lsm белки также вовлечены в процессы сплайсинга РНК (Mayes et al, 1999), транспорта мяРНП в ядро (Gerbi & Lange, 2002), репликации теломер (Seto et ah, 1999), созревания и стабилизации транскриптов РНК-полимеразы III (Pannone et al., 1998; Salgado-Garrido et aL, 1999), в том числе, созревания пре-тРНК (Kufel et al, 2002) и npe-pPHK (Mayes et al, 1999).

Гептамерный комплекс Lsm белков (Lsml-Lsm7) связывается с молекулами мРНК и образует РНП комплекс, подобный комплексу,

Обїор литературы

состоящему из мяРНК и Sm белков (см. рис. 8). Непосредственно взаимодействуя с мРНК, данный Lsm гептамер также взаимодействует с факторами деградации мРНК (включая декапирующий фермент, экзонуклеазу и некоторые другие белки - Hatfield et al., 1996; Tarun et at, 2000) и вызывает диссоциацию цитоплазматических кэп-связывающих белков (eIF4E), ингибирующих декэпирование и дальнейший распад мРНК (Boeck et al., 1998; Bouveret et al, 2000; He & Parker, 2000; Tharun et al, 2000).

Белки SmB, SmDl, SmD3, Lsm4 и Lsm6 человека взаимодействуют с белком Smn (survival motor neuron), участвующим в сплайсинге пре-мРНК (Friesen & Dreyfuss, 2000). Мутации или делеция теломерной копии гена smn приводит к дегенерации моторных нейронов спинного мозга и возникновению спинальной мышечной атрофии (Czeizel & Hamula, 1989). Smn белок участвует в образовании большого SMN комплекса, в состав которого входят также белки гемин 2 (он же SIP1), гемин 3 (DEAD-бокс РНК-хеликаза), гемин 4, гемин 5, гемин 6 и гемин 7. Данный комплекс локализуется как в ядре, так и в цитоплазме (Pellizzoni et al._t 1998). Он необходим и достаточен для корректного АТФ-зависимого связывания семи Sm белков с U мяРНК, и является фактором специфичности в сборке мяРНП (Pellizzoni et al., 2002).

Последовательности всех Sm и Lsm белков содержат консервативный Sm-мотив, состоящий из двух сегментов: Sml и Sm2, разделенных участком последовательности, вариабельным по длине и аминокислотному составу (рис. 7). В Sm и Lsm белках человека и архей этот структурный мотив отвечает за РНК-белковые и белок-белковые взаимодействия (Cooper et al., 1995; Hermann et al., 1995; Seraphin, 1995). Sm белки узнают консервативный участок РНК, называемый элементом Sm сайта. Этот элемент представляет собой одноцепочечный консенсус PuAU^GPu, обычно фланкированный шпилечными структурами (Branlant

Обзор литературы

et al, 1982; Liautard et al., 1982). 5'-аденозин критичен для связывания Sm белков, а основания и 2'-гидроксильные группы уридинов являются детерминантами связывания (Raker et al, 1999). Связывание Sm белков с мяРНК высокоспецифично. Так, например, если уридины U2 мяРНК не изомеризованы в псевдоуридины, сборки сплайсосом не происходит (Mueller, 2002).

Ll pi L2 p2

|33

L4

L5 p5

AfuSml

AfuSm2

HsaSmB

HsaSmD2

HsaSmDl

HsaSmD3

^>

ISTWPSRPVSHHSNNAGGGTSSNYHHGSSAQNTSAQQDSEETE

ISTWPSRPVRLPSGDQPAEPGNA

ISTYTVETEGQASTESEE-

EWRK

EKVRS

KPKNSKQAEREEKRV GKGKKKSKPVNKDRY

EPVQ

RVAQ

SPAPGGE-

QPQEE

31TVEGPPP-LRNPLIA-ILPDSLP-ILPDMLK-

^—DTl

.GNN1

Eb DSl

Рис. 7. Сравнение первичных структур Sm и Lsm белков организмов, относящихся к разным доменам.

Есо - Е. coli Hfq, Рае - Pseudomonas aeruginosa Hfq, Sau - Staphylococcus aureus Hfq, AfuSml - Archaeoglobus fulgidus Sml, AfuSm2 - A.fulgidus Sm2, HsaSmB - Homo sapiens SmB, HsaSmD2 - H. sapiens SmD2, HsaSmDl -H. sapiens SmDl, HsaSmD3 -H. sapiens SmD3.

Недавно Lsm белки были найдены и у бактерий (Miller et al., 2002; Zhang et al, 2002) и было показано, что белок Hfq принадлежит к Sm-подобным белкам и участвует в формировании РНК-РНК регуляторных комплексов, способствуя установлению комплементарных РНК-РНК контактов in vivo. Этот белок влияет на активность многих регуляторных и антисмысловых РНК (Zhang et al, 2002; Moller et al,

Обзор литературы

2002). Последовательности бактериальных белков Hfq содержат консервативный Sml мотив, характерный для семейства Sm-подобных белков. Принадлежность Hfq к данному семейству подтверждается также данными электронной микроскопии: Hfq образует гексамерные кольцевые структуры с полостью в центре, где располагаются РНК-связывающие поверхности (Zhang et al., 2002; М0ІІЄГ et al, 2002) - рис. 8.

Эксперименты по футпринтингу Spot 42 РНК показали, что бактериальный белок Hfq связывается с U-богатыми участками РНК, окруженными А и G нуклеотидами с 5' и 3' сторон, соответственно (Mailer et al., 2002). Следует заметить, что классический сайт связывания эукариотических Sm белков на РНК выглядит сходным образом: 5'-AUUUUUG-3' (Kambach et al., 1999; Stark et al., 2001). Однако, специфичность связывания Hfq с РНК не столь высока, как в случае взаимодействия с РНК эукариотических Sm и Sm-подобных белков (Zhang et al., 2003).

1.7. Пространственные структуры белка Hfq и его гомологов

Методом ре нтге неструктурного анализа определены

пространственные структуры нескольких Sm и Lsm белков из разных организмов (табл. 1). Все они образуют кольцевые структуры, состоящие из шести или семи субъединиц (см. рис. 8).

У эукариот в состав Sm и Lsm комплексов входят семь субъединиц, различающихся по размеру и аминокислотному составу. Однако существуют данные о том, что субкомплекс Sm белков Е, F, G человека обладает шестикратной симметрией (Plessel et al., 1997). Геномы бактерий и архей Pyrococcus spp. и Halobacterium spp. кодируют один, геномы остальных исследованных архей - два Sm-подобных белка, которые образуют комплексы из гомологичных субъединиц. У архей обнаружены два типа Sm белков: Sml и Sm2. В отсутствие РНК архейные белки Sml

Обзор литературы

Рис. 8. Сравнение пространственных структур эукариотического, архейного и бактериального представителей семейства Sm-белков. а - Пространственная структура эукариотического Sm белка Н. sapiens, б - Пространственная структура архейного Lsml белка A. fulgidis. в - Пространственная структура бактериального Lsm белка (Hfq) S. aureus в комплексе с 7-нуклеотидным фрагментом РНК.

Обзор литературы

типа образуют гептамеры, белки Sm2 типа - гексамеры (Того et al., 2002). В связанном с РЬЖ состоянии белки Sm2 типа A. fulgidus также образуют гептамерные комплексы (Achsel et al., 2001).

Бактериальные Sm-подобные белки существуют в виде гексамерных комплексов как в свободном, так и в связанном с РНК состоянии (Zhang et al., 2002; М0ІІЄГ et al., 2002; Schumacher et al., 2002). Предполагается, что белки Sm2 типа гомологичны Sm белкам эукариот, а белки Sml типа гомологичны Lsm белкам эукариот (Того et al,, 2002).

Таблица 1. Известные структуры гомологов белка Hfq из разных царств.

Недавно было обнаружено, что бактериальные белки Hfq содержат Sm-мотив, ранее обнаруживаемый только у эукариотических и архейных гомологов. Такая укладка является вариантом так называемой ОВ-структуры (Murzin, 1993). Sm-мотив представляет собой высококонсервативный структурный домен, состоящий из N-концевой а-спирали и сильно изогнутого бочкообразного пятитяжевого антипараллелыюго р-листа (рис. 9). Sml сегмент составляют pi, [32 и рЗ тяжи, Sm2 - Р4 и р5 тяжи, длина и положение N-концевой сс-спирали по отношению к р-листу варьирует среди известных структур. Таким образом, Sm и Lsm белки эукариот, архей и бактерий принадлежат к одному структурному семейству.

Обзор литературы

Характер взаимодействий между субъединицами также является весьма консервативным среди Sm и Sm-подобных белков. Кольцевая структура комплекса поддерживается водородными связями между |34-тяжем одной и (35-тяжем следующей субъединицы, образующими в олигомере кольцевой Р-слой. Кроме того, необходимым компонентом во взаимодействиях мономеров являются водородные связи, образованные главными цепями пептидов. Аминокислотные остатки тяжей |34 и |35 и N-концевой а-спирали участвуют в гидрофобных взаимодействиях, также поддерживающих кольцевую структуру олигомерного комплекса. При этом петли L2, L3 и L5 экспонированы на внутренней поверхности кольца, а N и С-концы мономеров находятся на внешней его поверхности. Слегка различающиеся ориентации мономеров по отношению друг к другу позволяют им собираться в гексамеры или гептамеры, соответственно.

^4 S4

Рис. 9. Пространственная структура мономера Lsm2 белка A.fulgidus в двух ориентациях (Того et al., 2002).

N-концевая а-спираль выделена красным цветом, тяжи pi, р2, (33 (Sml-мотив) - синим, тяжи Р4 и Р5 (8т2-мотив) - жёлтым. Р-тяжи и петли обозначены буквами S и L, соответственно.

Внешний диаметр комплексов составляет около 60 А (65А в случае EcoHfq), внутренний - около 10 А (1 іА в случае EcoHfq). Интересно, что у всех исследованных к настоящему моменту белков Sml типа в положении 65 находится отрицательно заряженный остаток (обычно Asp, в одном

Обїор литературы

случае Gly), участвующий в ионных взаимодействиях, поддерживающих структуру ол игом ера. У белков Sm2 типа в этом положении находится незаряженный остаток (Ser, Asn или Thr) (Того et al., 2002).

Размеры центральной полости известных Sm и Lsm белков (12 А в свободном и 15 А в связанном с РНК состоянии) меньше диаметра двуцепочечной РНК, поэтому были высказаны предположения о связывании данными белками одноцепочечной РНК. На внутренней поверхности кольца Sm белков человека располагаются области контакта с Sm-сайтом малых ядерных РНК (Urlaub et al., 2001). До определения пространственных структур комплексов Sm-подобных белков с РНК (Того et al., 2001; Schumacher et at, 2002) обсуждались две модели связывания РНК с Sm и Lsm белками. Одна из них предполагала "протягивание" РНК через центральное отверстие в мультимере, другая — непосредственную сборку мультимера вокруг РНК (Mura et al., 2001). Несмотря на то, что пространственная структура бактериального Hfq в комплексе с синтетическим олигорибонуклеотидом известна, механизм взаимодействия молекулы РНК с кольцом олигомера Hfq in vivo пока остаётся неизвестным (Schumacher et al., 2002).

Определение пространственных структур бактериальных и архейных Sm белков в комплексе с олигорибонуклеотидами дало возможность утверждать, что РНК-белковые контакты организованы в комплексах несколько иным способом. РНК-связывагащей является только одна из поверхностей белкового мультимера. Ранее биохимическими методами было показано, что принимающие участие в связывании РНК аминокислотные остатки расположены в Sml мотиве и петле L3 (Urlaub et al, 2001).

Сравнивая пространственные структуры разных Sm и Lsm белков, можно видеть ярко выраженную полярность заряда на противоположных поверхностях молекул. Консервативный остаток Lys, расположенный в

Обзор литературы

петле L2, обращен во внутреннюю полость, образуя вокруг неё положительно заряженную область. Асимметрия заряженных поверхностей делает белки данного семейства похожими на диски с довольно большим дипольным моментом. В отличие от своих эукариотических гомологов, гетеродимеры и гетеротримеры которых образуют кольцевые гептамерные структуры вокруг связываемой ими молекулы мяРНК, бактериальные белки Hfq взаимодействуют с РНК в виде предсуществующих гексамеров. Возможно, контакт с РНК происходит только на одной из поверхностей гексамерного кольца без взаимодействия РНК с его центральным отверстием.

Рис. 10. Пространственная структура гексамера, состоящего из фрагментов белка Hfq Е. coli длиной 67 аминокислотных остатков (Protein Data Bank 1НК9, Sauter et al., 2003).

Недавно методом молекулярного замещения была определена пространственная структура сердцевинного фрагмента белка Hfq Е. coli, содержащего остатки 6-72 (рис. 10). Было обнаружено, что данный фрагмент молекулы содержит Sm-укладку, а его структура схожа с

Обзор литературы

пространственной структурой белка Hfq S. aureus (Sauter et al, 2003). Ядро белка Hfq (остатки 7-66 у Е. coli) является наиболее консервативной его частью, общей для всех бактериальных белков (рис. 11).

Рис. 11. Пространственная структура сердцевинного фрагмента белка Hfq Е. coli (остатки 6-72) (Sauter et al., 2003). Буквой А обозначена а-спираль, буквами В - р-слои.

Несколько аминокислотных остатков сердцевинной части белка Hfq являются строго консервативными среди бактерий и вносят важный вклад в стабилизацию пространственной структуры данной части молекулы. Например, Gly29 важен для изгиба тяжа 02, остатки Gln8 и Phe39 участвуют в связывании РНК, а остатки Lys56 и His57 входят в состав YKHAI-мотива (Schumacher et al., 2002). Некоторые менее консервативные остатки являются характерными только для бактериальных гомологов Hfq (Sun et al., 2002). Р-шпилька L4 (находящаяся между листами РЗ и 04) является наиболее вариабельным элементом структуры сердцевинной части молекулы Hfq. Она состоит из двух (в случае Е. coli) или трёх (в случае S. aureus) аминокислотных остатков. С-концевая часть молекулы практически отсутствует у белков Hfq из бактерий рода Bacillus, а у белка

Обзор литературы

из Е. coli состоит из 38, в основном, гидрофильных остатков. Этот вариабельный элемент, возможно, является подвижным, поэтому предсказать его вторичную структуру пока не удаётся (Zhang et aL, 2002; Ariuison et al., 2002). Существуют предположения, что остатки 57-102 белка Hfq из Е. coli входят в состав неупорядоченной структуры (Ariuison et al., 2002). Возможно» С-концевая часть молекулы EcoHfq располагается над кольцом гексамера и участвует в связывании РНК. Кроме того, она может служить платформой для связывания других клеточных факторов, например, рибосом (Sauter et al., 2003).

Взаимодействия субъединиц в бактериальных гексамерах белков Hfq весьма консервативны. Sm-укладка белков Hfq обладает характерными особенностями по сравнению с Sm/Lsm белками: а-спираль в белках Hfq на два аминокислотных остатка длиннее, (3-шпилька L3 (находящаяся между листами р2 и рЗ) короче (три остатка вместо четырёх в Sm/Lsm белках), а так называемая "вариабельная область", включающая рЗ-тяж, петлю L4 и начало р4-тяжа в Sm/Lsm белках (14—28 аминокислотных остатков), значительно сокращена (в белках Hfq она состоит только из 2-3 остатков, входящих в состав короткой р-шпильки L4) (Sauter et al., 2003).

Заключение

Hfq - РНК-связывающий белок, взаимодействующий со многими клеточными РНК, в том числе с малыми РНК, называемыми "риборегуляторами", модулирующими стабильность и эффективность трансляции мРНК. Данный белок также является прямым регулятором экспрессии мРНК многих генов: его связывание меняет вторичную структуру транскриптов, изменяя этим их стабильность в клетке. Hfq принадлежит к семейству Sm-подобных белков. Белки этого семейства у эу кари от, архей и бактерий происходят, по-видимому, от общего предка, регулировавшего образование специфических РНК-РНК контактов

Обзор литературы

(Donahue & Jarrell, 2002). Точный механизм, который Sm белки используют для стабилизации РНК-РНК взаимодействий, пока остаётся невыясненным. Таким образом, один из главных клеточных "переключателей" метаболизма, белок Hfq, является интереснейшим объектом исследований в различных областях молекулярной биологии и, возможно, его изучение поможет в скором будущем понять многие неразгаданные тайны жизни.

Материалы

2. Материалы 2.1. Химические реактивы и ферменты

В работе использовались следующие химические реактивы,

ферменты и материалы:

Хроматографические носители: DEAE-Sepharose, S-Sepharose, CM-Sepharose, Chelating Sepharose, Superdex G-75, Superose 12B (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция), Heparine-Ultragel (Serva, Германия), CM-Toyopearl, Butyl-Toyopearl 650S (Toyosoda, Япония).

Ферменты: PstI, Smal, Taq ДЬІК-полимераза (СибЭнзим, Россия), BamHI,
Cfr9I, Hindlll, T4 ДНК-лигаза, T7 РНК-полимераза (Fermentas,
* Литва), Ndel, Deep-Vent ДНК-полимераза (New England BioLabs,

Англия).

Дезоксирибоиуклеотиды (СибЭнзим, Россия; Sigma, США).

Рибопуклеотиды (Fermentas, Латвия; Sigma, США).

Буферы: MES, HEPES, бис-трис (Serva, Германия); трис-HCl (Sigma, США).

Компоненты питательных сред: триптон, дрожжевой экстракт (Oxoid, Англия), бактоагар (Difco, США).

Наборы растворов для кристаллизации: Crystal Screen, Crystal Screen її, Natrix (Hampton Research, США).

Набор для выделения плазмид QIAprep (Qiagene, США).

Наборы для выделения ДНК из агарозных гелей: QIAquick (Qiagene, США), StrataPrep (Stratagene, США).

Другие реактивы: бромистый этидий, ІЛг^О^, CdSC>4, ZnSQi (Fluka, Швейцария); ПЭГ 6000 (Loba-Chemia, Австрия); NaCl, MgCl₂, этилен гликоль, ПЭГ 400, ПЭГ 8000, цитрат натрия (Merck, Германия); бромфеноловый синий, КОН, >1,>Г-метиленбис-акриламид, TEMED, акрил амид, NaOH (Reanal, Венгрия); акриламид, SDS, ЭДТА, краситель Кумасси голубой G-250, р-

Матер налы

меркаптоэтанол, PMSF (Serva, Германия); ацетат натрия, ацетат магния, ct-лактальбумин, БСА, (NtL^SO^ ДТТ, ДМСО, селенометионин, мочевина, МД^'-метиленбисакриламид, толуидин, силиконирующая жидкость Sigmacote, IPTG (Sigma, США).

Остальные реактивы отечественного производства квалификации ОСЧ, ХЧ.

Стекловолокнистые фильтры GF/A (Whatmann, Англия).

Диализные мембраны (Serva, Германия; Spectrum Laboratories Inc., США).

Концентраторы (VivaScience, Англия; Millipore, США; Pall Filtron, США).

Нитроцеллюлозные мембраны (Schleker&Schull, Германия).

2.2. Растворы

Буфер для образцов SDS-электрофореза (5-кратный): 60% сахароза,

10% SDS, 300 мМ Трис-HCl (рН 6.8), 10% р-меркаптоэтанол. Электродный буфер для SDS-электрофореза: 0.19 М глицин, 25 мМ Трис,

0.1% SDS. А буфер: 50 мМ Трис-HCl (рН 7.6), 350 мМ КС1, 10 мМ MgCl₂,

1 мМ Р-меркаптоэтанол, 32 их/мл БСА. Б буфер: 50 мМ Трис-HCl (рН 7.6), 100 мМ КС1, 10 мМ MgCl₂,

1 мМ (3-меркаптоэтанол, 32 цг/мл БСА. Сцинтилляционная жидкость для твёрдых образцов: 6 г/л РРО, 75 мг/л

РОРОР в толуоле. Сцинтилляционная жидкость для жидких образцов: "Rotiszint eco plus"

(Roth, Германия). ТАЭ буфер: 40 мМ Трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА (рН 8.0). ТБ буфер: 10 мМ Pipes (рН 6.7), 15 мМ СаС1₂, 250 мМ КС1, 55 мМ МпС1₂. ТЕМ буфер: 89 мМ Трис-борат, 89 мМ борная кислота, 5 мМ MgCb-ТБЭ буфер: 89 мМ Трис-борат, 89 мМ борная кислота, 2.5 мМ ЭДТА. ТЭ буфер: 10 мМ Трис-HCl (рН 8.0), 2 мМ ЭДТА (рН 8.0).

Материалы

2.3. Питательные среды

LB: 1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl;

М9 (20-кратная): 12% Na₂HP0₄, 6% КН₂Р0₄, 2% NH₄C1, 1% NaCl.

M9/SeMet: среда М9, содержащая 0.4% глюкозу, 2 мМ MgS0₄, 0.2 мМ СаСЬ, 1 цМ FeCb, по 40 мг/л каждой аминокислоты (19 основных и селенометионин вместо метионина), по 0.1 мг/л биотина, холинхлорида, фолиевой кислоты, никотинамида, D-пантотената, пиридоксина, рибофлавина, 0.05 мг/л тиамина.

SOB: 2% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 0.05% NaCl, 20 мМ MgS0₄.

2.4. Бактериальные штаммы

Е. coli DH5a [F"(p80d lacZAMlS recA\ endAl gyrA96 thi-\ /ЫИ17(г_к*, m_K⁺)

supE44 relAX deoK A(/acZYA-argF)U169] (Invitragene); E, coli TG2 supM44 thi-l f recAl [F' trdD_i6 proA⁺B⁺ lacl^q

/acZAM15]] (Gibson, 1984); E. coli XLl-blue [recAl endAl gyrA96 thi-l hsdKM supE44 relAl [F>roAB

lacl^q A(lacZ)Ml5 TwlO(tet)]] (Stratagene); E. coli BL21(DE3) [F" ompT hsdSn gal dem (DE3)]: штамм содержит

хромосомную копию гена РНК-полимеразы фага Т7 под контролем

lacUVS промотора (Novagen); Е. coli B834(DE3) [F* ompT hsdSn (гв~, ^тв~) gal dem met (DE3)]:

штамм-ауксотроф по метионину, содержит хромосомную копию

гена РНК-полимеразы фага Т7 под контролем lacUVS промотора

(Novagen).

2.5. Плазмиды

pETlla-PL: вектор, производный от pETlla (Novagen), несущий

Материалы

дополнительные сайты рестрикции в полилинкере (любезно

предоставлен проф. В. Пиндлом, Инсбрукский университет,

Австрия); pET22b+ (Novagen); pUBS520: вектор, несущий ген argU аргининовой тРНК, узнающей редкие

у Е. coli кодоны AGA и AGG (Roche); pUC 18 (Novagen).

Методы

3. Методы 3.1. Методы генной инженерии

3.1.1. Выделение хромосомной ДНК Е. coll

Хромосомную ДНК Е. coli DH5a выделяли по методике Мармура (Маптшг J., 1961) с небольшими изменениями. На ночь засевали 100 мл среды LB штаммом Е. coli DH5a. Биомассу осаждали центрифугированием (7 500 g, 15 мин, 4 С) и ре суспендировал и в 5 мл буфера ТЭ. Добавляли 10% SDS до конечной концентрации 1% и аккуратно трясли 7-8 ч при комнатной температуре. Далее 4-5 раз обрабатывали образец равным объёмом смеси фенола с хлороформом (1:1) до исчезновения иитерфазы. К образцу добавляли 2.5 объёма этанола в присутствии ацетата калия, рН 4.8, ДНК осаждали центрифугированием (14 000 g, 7 мин, 20С). Осадок подсушивали в вакуумной сушке и ресуспендировали в 3 мл буфера ТЭ. Образец обрабатывали РНКазой А в концентрации 150 мг/л при 37С в течение 1 ч. Затем образец обрабатывали протеиназой К в концентрации 150 мг/л при ЪТС в течение 1 ч. К полученной смеси добавляли равный объём смеси фенола с хлороформом (1:1), затем к верхней фазе добавляли равный объём хлороформа. К полученному препарату ДНК добавляли 2.5 объёма этанола в присутствии ацетата калия, рН 4.8, и центрифугировали при 14 000 g в течение 10 мин при 20С. Осадок промывали 70% этанолом и растворяли в буфере ТЭ. Хранили при 4С.

3.1.2. Выделение плазмидной ДНК". coli

На ночь засевали 3 мл жидкой среды LB. Биомассу осаждали центрифугированием при 3 000 g в течение 10 мин при 4С. Ресуспендировали в 100 мкл буфера, содержащего 25 мМ Трис-НС1, рН 8.0, 50 мМ глюкозу, 20 мМ ЭДТА. Добавляли 200 мкл раствора, содержащего 1%SDS, 0.2HNaOH. Аккуратно перемешивали,

Методы

инкубировали на льду в течение 10 мин. Затем добавляли 150 мкл 3/5 М ацетата калия, рН 4.8, осторожно перемешивали и инкубировали на льду в течение 5 мин. Центрифугировали при 14 000 g в течение 10 мин при 20С. Супернатант переносили в новую пробирку и добавляли к нему равный объём изопропанола, инкубировали в течение 10 мин при 20С. ДНК осаждали центрифугированием при 14 000 g в течение 5 мин при 20С. Осадок промывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в 400 мкл буфера ТЭ.

3.1.3. Очистка плазмиднои ДНК равновесным центрифугированием в

градиенте CsCl

Очистку выделенной плазмиднои ДНК проводили как описано в (Маниатис и др., 1984). К каждому миллилитру раствора ДНК добавляли 1 г сухого CsCl и перемешивали до полного растворения. Далее на каждые 10 мл раствора добавляли 0.8 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Полученной смесью заполняли центрифужные пробирки Beckman 65 и герметично их запаивали. Центрифугирование проводили при 50 000 g в течение 24 ч. С помощью шприца с иглой отбирали нужную полосу ДНК. Бромистый этидий удаляли экстракцией равным объёмом изоамилового спирта (5-6 раз, до исчезновения окраски растворов). Затем проводили диализ водной фазы против буфера ТЭ с тремя сменами (использовали диализные мембраны с размерами пор 10-14 кДа). ДНК осаждали двумя объёмами этанола, осадок растворяли в буфере ТЭ. Данный метод использовали для очистки векторов при клонировании генов и Т7 транскрипции in vitro.

3.1.4. Получение компетентных клеток Е. coli

На ночь засевали чашку с LB-агаром требуемым штаммом Е. coli. Затем пересевали клетки в 50 мл жидкой среды SOB и растили с качанием

Методы

при 37С до оптического поглощения (А^о) 0.45-0.5 о.е./мл. Охлаждали на льду и стерильно осаждали при 2 000 g в течение 15 мин при 4С. Суспендировали клетки в 16 мл буфера ТБ и стерильно осаждали при 2 000 g в течение 15 мин при 4С. Суспендировали клетки в 4 мл буфера ТБ. Осторожно помешивая суспензию, добавляли к ней 280 мкл ДМСО (до 7%) и инкубировали на льду в течение 10 мин. Расфасовывали компетентные клетки по 200 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -70С до полугода.

3.1.5. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК

Компетентные клетки Е. coli размораживали на льду в течение 20 мин, затем добавляли 40-50 нг плазмидной ДНК (объём ДІЖ не превышал 10% от объёма клеток) и инкубировали на льду ещё 20 мин. Далее клетки переносили в водяную баню (42С) на 60-70 сек и снова ставили в лёд на 5 мин. Добавляли среду LB без антибиотика до конечного объёма I мл и инкубировали клетки при 37С без качания в течение 1 ч. Затем высевали трансформанты на LB-arap, содержащий соответствующий антибиотик, и растили при 37С в течение ночи.

3.1.6. Получение штамма-суперпродуцента белка Hfq Е. coli

Ген hfq Е. coli амплифицировали при помощи полимеразной цепной реакции, матрицей служила хромосомная ДНК Е. coli DH5a. Использовали праймеры, содержащие сайты узнавания для рестриктаз Ndel и ВатНІ (подчёркнуты). Прямой праймер:

5' GGAAAAGAGCATAIGGCTAAGGGG 3' Обратный праймер: 5' CGCTGGATCCCCGTGTAAAAAAAC 3'

ПЦР проводили в объёме 100 мкл. Реакционная смесь содержала 10 мкл 10-кратного ПЦР буфера (570 мМ Трис, рН 8.8, 166 мМ (NH₄)₂S0₄

и 15% Tween-20), 2.5 мМ MgCI₂, смесь дезоксирибоїіуклеотидов (0.2 мМ каждого), праймеры (100 пМ каждого), 20 нт хромосомной ДНК Е. coli и 5 единиц активности Vent-ДНК полимеразы. ДНК гена амплифицировали в течение 30-35 циклов. Каждый цикл состоял из трех этапов: денатурация ДНК при 95С 30 сек, отжиг праймеров при 57С 30 сек и полимеразная реакция при 72С 3 мин. Результаты реакции анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле.

ПЦР-продукт и вектор pETl la-PL обрабатывали рестриктазами Ndel и BamHI, полученные фрагменты очищали электрофорезом и последующей элюцией из 1% агарозы. Лигирование проводили в объёме 10 мкл. Лигазная смесь содержала 50 нг вектора, 50 нг ПНР-фрагмента и 1 ед. активности Т4 ДНК-лигазы.

Штамм Е. coli BL21(DE3) трансформировали полученной рекомбинантной плазмидоЙ pEcoHfq, содержащей ген hfq Е. coli под контролем Т7 промотора. Последовательность гена проверяли секвенированием (фирма "GATC", Германия) с использованием универсальных праймеров Т7.

Синтез белка EcoHfq индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации 0.1 мМ в культуру клеток, выращенную с добавлением ампициллина (100 мг/л), при поглощении (Лбоо) 0.8 о.е./мл. После добавления индуктора клетки росли в течение 3 часов при 37С с качанием. Биомассу осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 7 000 g и 4С. Уровень продукции белка EcoHfq оценивали электрофорезом в 15% ПААГ (сшивка 19:1) в присутствии SDS. Гели окрашивали Кумасси G-250.

3.1.7. Получение штамма-суперпродуцента белка Hfq P. aeruginosa

Ген hfq P. aeruginosa амплифицировали при помощи полимеразной цепной реакции, матрицей служила плазмидная ДНК, несущая фрагмент

Методы

хромосомной ДНК P. aeruginosa, содержащий ген hfq (любезно

предоставлена У. Блези, Венский биоцентр, Австрия). Использовали

праймеры, содержащие сайты узнавания для рестриктаз Ndel и Hindlll

(подчёркнуты).

Прямой прайм ер:

5' CTTAAAGGAGTGCGGCATATGTCAAAAGGGCATTCGCTAC 3'

Обратный праймер:

5' GGGGCGAAAAAAGCTTTCAAGCGTTGCCCGGCTCGG 3'

ПЦР проводили в тех же условиях, что и при клонировании гена hfq Е. coli. ПЦР-продукт и вектор рЕТ22Ь+ обрабатывали рестриктазами Ndel и Hindlll, полученные фрагменты очищали электрофорезом и последующей элюцией из 1.5% агарозы. Лигирование проводили в объёме 20 мкл. Лигазная смесь содержала 50 нг вектора, 50 нг ПЦР-фрагмента и 1 ед. активности Т4 ДНК-лигазы,

Штамм Е. coli BL21(DE3), несущий плазмиду pUBS520, трансформировали полученной рекомбинантной плазмидой pPaeHfq, содержащей ген hfq P. aeruginosa под контролем Т7 промотора. Последовательность гена проверяли секвенированием (Венский биоцентр, Австрия) с использованием универсальных праймеров Т7.

Синтез белка PaeHfq индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации 0.5 мМ в культуру клеток, выращенную с добавлением ампициллина (100 мг/л) и канамицина (50 мг/л), при поглощении (А^оо) 0.5 о.е./мл. После добавления индуктора клетки росли в течение 3 часов при 37С с качанием. Биомассу осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 7 000 g и 4С. Уровень продукции белка PaeHfq оценивали электрофорезом в 15% ПААГ (сшивка 19:1) в присутствии SDS. Гели окрашивали Кумасси G-250.

Методы

3.1.8. Получение штаммов, продуцирующих ееленометиониновые
производные белков EcoHfq и PaeHfq

Для получения белков EcoHfq и PaeHfq, содержащих остатки селенометионина, использовали штамм Е. coli В834, ауксотрофный по метионину. В случае белка EcoHfq данный штамм трансформировали плазмидой pEcoHfq, в случае белка PaeHfq - штамм Е. coli В834, содержащий плазмиду pUBS520, трансформировали плазмидой pPaeHfq. Трансформанты высевали на чашки с LB-агаром, содержащим соответствующие антибиотики, растили в течение ночи при 37С. Утром засевали 3 мл жидкой среды LB с антибиотиками, растили при 37С с качанием до оптического поглощения 0.5 о.еАш. Далее клетки осаждали центрифугированием при 3 000 g в течение 5 мин, промывали их средой М9 и снова осаждали при тех же условиях. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл жидкой среды M9/SeMet и подращивали при 37^GC с качанием в течение ночи. Утром полученным инокулятом засевали нужный объём жидкой среды M9/SeMet и растили при 37С с качанием до поглощения 0.5 о.е./мл. Затем проводили индукцию синтеза рекомбинантного белка добавлением в культуру клеток IPTG до конечной концентрации 0.1 мМ. После добавления индуктора клетки росли в течение ночи при 30С с уменьшенным качанием либо в течение 5 ч при 37С с интенсивным качанием. Биомассу осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 7 000 g и 4С. Уровень продукции белков оценивали электрофорезом в 15% ПААГ (сшивка 19:1) в присутствии SDS. Гели окрашивали Кумасси G-250.

3.1.9. Получение конструкций для транскрипции in vitro OxyS, RprA,
RyhB и DsrA РНК

Гены oxyS и dsrA E. coli амплифицировали при помощи полимеразной цепной реакции без использования матрицы. Гены гргА и

Методы

ryhB Е. coli амплифицировали при помощи полимеразной цепной реакции,

где матрицей служила хромосомная ДІЖ Е. coli. Использовали праймеры,

содержащие сайты узнавания для рестриктаз Hindlll и Smal

(подчёркнуты). Прямые праймеры содержали Т7 промоторы (обозначены

курсивом).

Прямой праймер гргА:

5' TTTGGAAGCTT7^r^CG/tCrC^C7^rvJGGGGTTATAAATCAACATAT TG 3'

Обратный праймер гргА:

5' AAATCCCGGGAAAAAGCCCATCGTGGGAG 3'

Прямой праймер ryhB:

_т 5' TTTGGAAGCrrr^r^CG^CrC^CT^r^GGGGCGATCAGGAAGACCCTC 3'

Обратный праймер ryhB:

5' AAATCCCGGGAAAAGCCAGCACCCGGC 3'

Прямой праймер oxyS:

yTTJGGAAGCTYTAATACGACTCACTATACAAACGGAGCGGCACCTCTmAACCC TTGAAGTCACTGCCCGTTTCGAGAGTTTCTCAAC 3'

Обратный праймер oxyS:

5' АА ACTGCAGCGGATCCTGG AG ATCCGC AAAAGTTC ACGTTGGCTTTAGTTATTC GAGTTGAGAAACTCTCG 3'

Прямой праймер dsrA:

S'TTTGGAAGCrTTAATACGACTCACTATAGGGGCACATCAGAATTlCCTGGTGTAA CGAATTTTTTAAGTGCTTCTTGC 3'

Обратный праймер dsrA:

5' AAATCCCGGGAATCCCGACCCTGAGGGGGTCGGGATGAAACTTGCTTAAGCAA

GAAGCACTT 3*

В случае амплификации генов гргА и ryhB ПЦР проводили в объёме 50 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл 10-кратного ПЦР буфера (570 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 166 мМ (NH₄)₂S0₄ и 15% Tween-20), 2.5 мМ MgCb, смесь дезоксирибонуклеотидов (0.2 мМ каждого), праймеры (100 пМ каждого), 1 нг хромосомной ДНК Е. coli и 5 ед. активности Vent-ДНК полимеразы. ДНК гена амплифицировали в течение 30 циклов.

Методы

Каждый цикл состоял из трёх этапов: денатурация ДНК при 95С 30 сек, отжиг праймеров 30 сек (в первых трёх циклах температура отжига праймеров составляла 45С, в последующих - 57С) и полимеразная реакция при 72С 45 сек. Результаты реакции анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле.

В случае амплификации генов oxyS и dsrA ПЦР проводили в объёме 50 мкл с использованием ProofStart QIAgene Kit. Реакционные смеси содержали 5 мкл 10-кратного ПЦР буфера, 0.5 мМ MgCb, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (0.3 мМ каждого), праймеры (100 пМ каждого) и 2.5 ед. активности ДНК полимеразы. ДНК генов амплифицировали в течение 30 циклов. Каждый цикл состоял из трёх этапов: денатурация ДНК при 95С 15 сек, отжиг праймеров при 55С 15 сек и полимеразная реакция при 72С 30 сек. Результаты реакций анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле. Продукты реакций очищали с помощью QIAquick PCR Purification Kit.

ПЦР-продукты и вектор pUC18 обрабатывали рестриктазами Hindlll и Cfr9I (являющейся изошизомером рестриктазы Smal, и оставляющей липкие концы), полученные фрагменты очищали электрофорезом и последующей элюцией из 2% агарозы с помощью QIAquick Gel-Extraction Kit. Лигирование проводили в объеме 10 мкл. Лигазная смесь содержала 50 нг вектора, 50 нг ПЦР-фрагмента и 1 ед. активности Т4 ДНК-лигазы.

Штамм Е. coli XLl-blue трансформировали полученными рекомбинантными плазмидами, содержащими ген гргА или ryhB Е. coli под контролем Т7 промотора. Компетентные клетки штамма Е. coli TG2 трансформировали полученными рекомбинантными плазмидами, содержащими ген oxyS или dsrA Е. coli под контролем Т7 промотора. Последовательность генов проверяли секвенированием (Венский биоцентр, Австрия; Microsynth, Щвейцария) с использованием универсальных праймеров pUC/M13.

Методы

3.2, Методы работы с белками

3.2.1. Выделение и очистка рекомбинантного белка EcoHfq

Для получения препаративных количеств белка EcoHfq клетки
рекомбинантного штамма BL21(DE3)/pHfq ресуспендировали в 50 мМ
Трис-НС1-буфере, рН 8.0, содержащем 0.25 М MgCl₂, 1 М NaCl, 2.5 мМ
ЭДТА, 0.1 мМ PMSF, и разрушали ультразвуком. Разрушенные клеточные
стенки и мембраны убирали низкоскоростным центрифугированием в
течение 20 мин при 13 000 g и 4С. Супернатант прогревали при 83С в
течение 20 мин и центрифугировали при 13 000 g и 4С в течение 1 ч. К
супернатанту добавляли сухой NaCl до конечной концентрации 1.5 М и
сухой (NH^SC^ до конечной концентрации 1.7 М. Раствор белка
наносили на 5-мл колонку со смолой Butyl-Toyopearl, уравновешенной
20 мМ буфером Трис-HCl, рН 8.0, содержащим 1.5 М NaCl и 1.7 М
(NH^hSC^. Далее колонку промывали тем же раствором до полного
выхода не связывающейся с носителем фракции. Связавшийся с носителем
белок EcoHfq элюировался градиентом (NH^SCVNaCl

(1.7/1.5 - 0/0 М) в 50 мл 20 мМ Трис-HCl буфера, рН 8.0. Скорость элюции составляла 25 мл/ч, элюат фракционировался по 2 мл. Измеряли оптическое поглощение (^2go) каждой фракции. Отсутствие РНК во фракциях проверяли по спектру поглощения. Фракции, не содержащие РНК, анализировали SDS-электрофорезом. Фракции, содержащие белок EcoHfq, объединяли и концентрировали на концентраторах VivaSpin-30 до величины оптического поглощения раствора (Л274) 25 о.е./мл. Активность белка, полученного данным методом, была проверена нашими австрийскими коллегами (в качестве контроля брали белок EcoHfq, содержащий 6 остатков гистидина с С-конца и выделенный с помощью аффинной хроматографии без стадии прогрева).

Для удаления примеси ферритина полученный раствор белка в 50 мМ Трис-ацетатном буфере, рН 8.0, содержащем 0.5 М NaCl, наносили

Методы

на 5-мл колонку со смолой Chelating Sepharose, заряженной ионами Zn и уравновешенной тем же буфером. Далее колонку промывали тем же раствором до полного выхода не связывающейся с носителем фракции (ферритин). Связавшийся с носителем белок EcoHfq элюировался градиентом имидазола 0-100 мМ в 15 мл 50 мМ Трис-ацетатного буфера, рН 8.0, содержащего 0.5 М NaCl и 1 М NH₄C1. Скорость элюции составляла 30 мл/ч, элюат фракционировался по 1.5 мл. Измеряли оптическое поглощение (/4₂go) каждой фракции.

Данная методика позволяет получать 5-7 м г EcoHfq из 1 г клеток. Полученный препарат белка хранили при 20С в концентрации ~1 мМ в растворе, содержащем 20 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 100 мМ NaCl и 100 мМ (NH^SCXj, в течение 2-3 месяцев.

Выделение рекомбинантного белка EcoHfq, содержащего остатки SeMet, из штамма-суперпродуцента В834(DE3)/pEcoHfq проводили по той же методике без изменений.

3.2.2. Выделение и очистка рекомбинантного белка PaeHfq

Препаративное выделение рекомбинантного белка PaeHfq из штамма-суперпродуцента BL21(DE3)/pUBS520/pPaeHfq проводили по методике, разработанной нами для выделения белка EcoHfq и описанной выше, за исключением последней хроматографической стадии. После очистки на гидрофобной смоле проводили ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефарозе. Выход белка составлял 4-5 мг из 1 г клеток. Препарат белка хранили при —70С в концентрации --0.5 мМ в растворе, содержащем 20 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 200 мМ NaCl и 200 мМ (NH₄)₂S0_4j в течение 1-2 месяцев.

Выделение рекомбинантного белка PaeHfq, содержащего остатки SeMet, из штамма-суперпродуцента B834(DE3)/pUBS520/pPaeHfq проводили по той же методике без изменений.

Методы

3.2.3. Гель-электрофорез белков в ПААГ в присутствии SDS

Электрофорез проводили по методу Леммли (Laemmli, 1970) в присутствии SDS в электрофоретической камере Bio-Rad.

Электрофорез проводили в пластинах толщиной 0.75 мм. Гелевая пластина состояла из разделяющего и концентрирующего гелей. Разделяющий гель содержал 14,2% акриламида, 0.8% МБА, 0.1% SDS, 375 мМ Трис-HCl, рН 8.8. Концентрирующий гель содержал 5% акриламида, 0.25% МБА, 0.1% SDS, 125 мМ Трис-HCl, рН 6.8. Для полимеризации гелей к 5 мл раствора добавляли 5 мкл ТЕМЕД и 25 мкл 10% раствора персульфата аммония. Полимеризация длилась 25-30 мин при комнатной температуре. Для электрофореза использовали электродный буфер для SDS-электрофореза.

Образцы растворяли в буфере для образцов SDS-электрофореза в соотношении объёма образца к объёму буфера 4:1 и кипятили на водяной бане в течение 3 мин. Объём образцов не превышал 30 мкл. Образцы подслаивали под электродный буфер в ячейки гелевой пластины и проводили электрофорез в течение 1.5 ч. До вхождения образцов в разделяющий гель электрофорез вели при 100 В, затем - при 180 В.

После электрофореза гели фиксировали и окрашивали при нагревании в течение 5 мин в растворе, содержащем 0.05% Кумасси G-250, 30% этанол, 10% уксусную кислоту. От избытка красителя гели отмывали в растворе 5% уксусной кислоты при нагревании.

3.3. Анализ гомогенности и оценка молекулярных весов полученных препаратов EcoHfq и PaeHfq

3.3.1. Проведение гель-фильтрационной хроматографии препарата белка EcoHfq

Для оценки гомогенности полученного препарата EcoHfq и проверки гипотезы о существовании белка в форме гексамера нами была проведена

Методы

аналитическая гель-фильтрационная хроматография в системе FPLC на
носителе Superose 12В с маркёрами молекулярных весов. Размеры колонки
составляли 30 см в длину, 10 мм в диаметре, скорость элюции -
0.4 мл/мин, чувствительность - 0.02 о.е. (фильтр 275 нм). Хроматографию
проводили в 50 мМ буфере Трис-HCl, рН 8.0, содержащем 1.5 М NaCI. В
качестве маркёров молекулярных весов использовали бычий
сывороточный альбумин (MW = 66 кДа) и а-лактальбумин
(MW= 14.2 кДа), предварительно переведённые диализом в
хроматографический буфер. Калибровку проводили нанесением на
колонку маркёров в следующих количествах: 100 мкл бычьего
* сывороточного альбумина в концентрации 2 о.еУмл, 100 мкл

а-лактальбумина в концентрации 0.72 о.еУмл. Для проведения эксперимента на колонку наносили 85 мкл белка EcoHfq в концентрации 0.8 о.е./мл.

3.3.2. Проведение аналитического ультрацентрифугировапия в шлирен-системе препаратов белков EcoHfq и PaeHfq

Для проведения аналитического ультрацентрифугирования в

шлирен-системе белки EcoHfq и PaeHfq диализовали против 50 мМ

Трис-HCl буфера, рН 8.0, содержащего 200 мМ NaCl, и доводили до

концентрации 3 мг/мл. Объём образцов составлял 0.25 мл. В качестве

контроля использовали тот же буфер. Коэффициенты седиментации «

рассчитывали по формуле:

S = (lnR_i+i - lnRi)/[a>²x(t_i+i - ti)xl0"¹³x60],

где S - коэффициент седиментации в единицах Сведберга,

R - расстояние от оси вращения до образца (см),

со - угловая скорость (рассчитывается по формуле: ш = 2тт/б0, где п -

число оборотов ротора в минуту),

t - время от начала эксперимента (мин).

*

Методы

3.4. Методы работы с РНК и РНК-белковыми комплексами

3.4.1. Т7 транскрипция ш vitro OxyS, DsrA, RprA и RyhB РНК

Препаративную Т7 транскрипцию in vitro проводили в объёме 250 мкл. В качестве матрицы использовали линеаризованную по Smal сайту плазмиду с клонированным геном соответствующей РНК. Реакционные смеси содержали 25 мкл 10-кратного транскрипционного буфера (400 мМ Hepes-KOH, рН 8.0, 280 мМ MgCl₂, 10 мМ ДТТ, 10 мМ спермидин), 15мкг матричной ДНК, рибонуклеотидтрифосфаты в концентрации 4 мМ каждый, 200 ед. активности Т7 РНК-полимеразы. Реакция проводилась в течение 3-4 ч при 37С. Продукты реакции анализировали электрофорезом в ПААГ в присутствии 8 М мочевины.

3.4.2. Гель-электрофорез РНК в ПААГ в присутствии 8 М мочевины

Электрофорез проводили в присутствии 8 М мочевины в электрофоретической камере Bio-Rad.

Электрофорез проводили в пластинах толщиной 0.75 мм. Гель содержал 19% акриламида, 1% МБ А, 8 М мочевины, 89 мМ Трис-борат, 89 мМ борную кислоту, 2,5 мМ ЭДТА. Для полимеризации гелей к 5 мл раствора добавляли 5 мкл ТЕМЕД и 25 мкл 10% раствора персульфата аммония. Полимеризация длилась 25-30 мин при комнатной температуре. Для электрофореза использовали электродный буфер ТБЭ.

Образцы растворяли в 8 М мочевине и кипятили на водяной бане в течение 3 мин. Объём образцов не превышал 30 мкл. Образцы подслаивали под электродный буфер в ячейки гелевой пластины и проводили электрофорез в течение 1.5-2 ч. До вхождения образцов в разделяющий гель электрофорез вели при 100 В, затем - при 180 В.

После электрофореза гели окрашивали либо в растворе бромистого этидия, либо в растворе, содержащем 0.1% толуидип синий и 10%

Методы

уксусную кислоту, в течение 10 мин. От избытка красителей гели отмывали дистиллированной водой.

3.4.3. Получение и очистка равномерно ³²Р-меченных DsrA, RprA и
RyhB РНК

Так называемую "горячую" Т7 транскрипцию in vitro проводили в объёме 20 мкл с использованием набора MAXIscript (Ambion, США). Реакционная смесь содержала 1 мкг линеаризованной плазмидной ДНК и 5 мкл [ Р]-аУТФ (10 цСи/мкл). Реакционную смесь инкубировали при 37С в течение 1 ч, затем добавляли 5 ед. активности ДНКазы I и инкубировали смесь 15 мин при комнатной температуре.

Очистку полученных транскриптов проводили с использованием колонок фирмы Roche. Чистоту транскриптов проверяли методом гель-электрофореза в ПААГ в присутствии 8 М мочевины. Для оценки интенсивности мечения брали 1 мкл очищенного транскрипта, смешивали с 3 мл сцинтилляционной жидкости "Rotiszint ecoplus" (Fluka) и анализировали в счётчике радиоактивности "Beckmann".

3.4.4. Определение кажущихся констант диссоциации РНК-белковых
комплексов

Белок EcoHfq был серийно разведён в буфере А или в буфере Б до концентраций от 10" М до 10' М (учитывая существование белка в

растворе в виде гексамера). Препараты [ Р]-РНК, находящиеся в том же буфере и содержащие около 20 000 срт в 25 мкл (<10"^,2М), прогревали при 65С в течение 5 мин, затем ренатурировали при 37С 10 мин, охлаждали на льду и добавляли к аликвотам белка (25 мкл). Аликвоты белка также предварительно прогревали при 37С 10 мин и охлаждали на льду перед добавлением РНК. Смеси с конечным объёмом 50 мкл оставляли на льду на 10 мин, а затем под слабым давлением пропускали через нитроцеллюлозные мембраны, выдержанные в буфере А или Б при

Методы

4С в течение по крайней мере 2 ч. Затем мембраны промывали 350 мкл охлаждённого буфера А (или Б) и высушивали в течение 20 мин при 80С. Сухие мембраны помещали в 3 мл сцинтилляционной жидкости каждую и анализировали в счётчике радиоактивности "Beckmann". Время счёта для каждой пробы составляло 10 мин. Уровень насыщения составлял 40-80% от внесённой радиоактивности. Неспецифическая задержка меченой РНК на фильтрах, измеренная при фильтрации реакционной смеси, не содержащей белка EcoHfq, составляла не более 3% и использовалась для коррекции полученных значений. Для дальнейших расчётов все значения нормализовали, т.е. принимали наибольшее значение за 1, а наименьшее -за 0. Кажущимися константами диссоциации, К& считали концентрации белка, необходимые для получения 50% от насыщения. Каждый эксперимент был повторен дважды. Стандартная ошибка не превышала ±10%. Все расчёты проводились с использованием программы Microsoft Excel.

3.4.5. Метод гель-шифта

Комплексы белков EcoHfq или PaeHfq с различными мечеными регуляторными РНК (DsrA РНК, RprA РНК или RyhB РНК) получали как описано выше для экспериментов по связыванию на нитроцеллюлозных фильтрах, но в 5 мкл буфера А. После образования исследуемых РНК-белковых комплексов к ним добавляли по 15 мкл раствора 8 М мочевины, содержащего 0.02% бромфенолового синего, кипятили на водяной бане в течение 3 мин и наносили полученные препараты на 15% ПААГ (сшивка 37.5:1), содержащий 8 М мочевину. Далее следовали методике проведения электрофореза РНК в денатурирующих условиях (см. главу 3.4.2) в электродном буфере ТБЭ или ТЕМ, и затем экспонировали рентгеновскую плёнку с гелем в течение 5-10 мин.

Методы

3.5. Кристаллизация белка PaeHfq

Предварительный поиск условий кристаллизации вели методом диффузии паров в висящей капле при 21С и 4С с использованием коммерческих наборов Crystal Screen, Crystal Screen II и Natrix. Белок диализом переводили в 20 мМ Трис-HCl буфер, рН 8.0, содержащий 100 мМ NaCl и 100 мМ (NH^SC^. Концентрация белка в каплях составляла 3-5 мг/мл, объём капель составлял 5-7 мкл, объёмы противорастворов варьировали в пределах 0.7-1 мл.

Для оптимизации условий кристаллизации белок PaeHfq диализом переводили в 20 мМ буфер Трис-HCl, рН 8.0, содержащий 200 мМ NaCl и 200 мМ (NH^SC^, и доводили до концентрации 20-30 мг/мл. Два мкл раствора белка PaeHfq смешивали с тремя мкл противораствора и оставляли капли при 21 С до появления кристаллов. Непосредственно перед проведением каждого эксперимента по кристаллизации препарат белка центрифугировали в течение 15 мин в настольной центрифуге Eppendorf при комнатной температуре и переносили в новую полипропиленовую пробирку. В качестве противорастворов использовали совместно 1 М сульфат лития и 0.6-0.8 М сульфат аммония в 100 мМ цитрате натрия, рН 5.6, либо 1.6 М сульфат аммония в 100 мМ буфере MES-K.OH, рН 6.5, либо 20% ПЭГ₈₀оо- Для стимуляции роста кристаллов в капли добавляли CdS0₄ или ZnS0₄ до 3-5 мМ.

3.6. Сбор дифракционных данных

Предварительную проверку качества полученных кристаллов проводили на генераторе рентгеновских лучей с вращающимся анодом (Институт белка РАН, Пущино). Сбор дифракционных данных проводили на синхротронных линиях DESY (EMBL, Гамбург, Германия), используя MAR CCD детекторы, и SpRing-8 (Харима, Япония).

Методы

Сбор кристал л ографических данных при температуре 100К проводили с использованием двух криопротектантов. В одном случае кристаллы петлёй переносили сначала в противораствор, а затем в сохраняющий раствор, содержащий 1.2 М (NH^hSd» в 50 мМ Na-цитратном буфере, рН 5.6, и 15% этиленгликоль в качестве криопротектанта, и немедленно замораживали. В другом случае кристаллы петлёй переносили в раствор, содержащий 1 М (NH^SCU в 50 мМ Na-цитратном буфере, рН 5.6, и 30%w/v глюкозу в качестве криопротектанта, выдерживали их в данном растворе 3-5 мин и затем быстро замораживали в струе жидкого азота.

Предварительную обработку полученных данных вели с использованием пакетов программ XDS (Kabsch, 2001), Mosflm и Denzo.

Результаты и обсуждение

4. Результаты и их обсуждение

Участие белка Hfq в регуляции трансляции rpoS мРНК малыми нетранслируемыми РНК Е. coli

Впервые малые нетранслируемые РНК были обнаружены в бактериальных клетках, затем - во всех живых клетках. Многие из них регулируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне, либо прямо взаимодействуя с мРНК, либо образуя комплексы с различными регуляторными белками. Малые РНК бактерий представляют собой достаточно стабильные молекулы, синтезирующиеся в клетках в больших количествах и участвующие в образовании РНК-РНК и РНК-белковых комплексов (Wassarman et al., 1999).

У бактерий обнаружено более 50 видов малых регуляторных РНК (Argaman et al., 2001; Rivas et aL, 2001; Tang et aL, 2001; Klein et al., 2002; Masse et aL, 2003). Гены относящихся к данному семейству РНК обладают некоторыми сходными особенностями (Hershberg et aL, 2003). Показано, что многие из этих РНК взаимодействуют с белком Hfq (Wassarman et aL, 2001). Белок Hfq является положительным регулятором экспрессии гена rpoS, кодирующего as (или о ) субъединицу бактериальной РНК-полимеразы (Muffler et aL, 1996; Brown & Elliott, 1996). Экспрессия о гена, кодирующего а субъединицу РНК-полимеразы, индуцируется в стационарной фазе роста или при голодании клетки (Тапака et aL, 1993). as регулирует экспрессию генов, необходимых при осмотическом стрессе, низком значении рН среды, недостатке кислорода, тепловом шоке, голодании или переходе клетки в стационарную фазу роста (Hengge-Aronis, 1993, 1996; Loewen & Hengge-Aronis, 1994). Кроме того, данная субъединица регулирует синтез факторов вирулентности Обзор литературы нескольких патогенных видов бактерий, включая Salmonella typhimurium (Fang, 1992; Webb et al, 1999), Vibrio cholerae (Merrell et al., 2000), Shigella flexneri (Small et al, 1994), P. aeruginosa (Jorgensen et al, 1999; Suh et al., 1999), Legionella pneumophila (Hales & Shuman, 1999; Bachman & Swanson, 2001), Xenorhabdus nematophilus (Vivas & Goodrich-Blair, 2001) и Y. enterocolitica (Badger & Miller, 1995). Регуляция экспрессии гена rpoS - сложный и пока до конца не исследованный процесс, в который вовлечено довольно большое количество белков и регуляторных РНК (Klauck et al., 1997; Webb et al., с 1999). Контроль синтеза о субъединицы РНК-полимеразы осуществляется на уровне транскрипции, трансляции и стабильности белка (Lange & Hengge-Aronis, 1994). Hfq является одним из главных регуляторов экспрессии rpoS (Nogueira & Springer, 2000) (рис. 4).

Предполагается, что Hfq стимулирует трансляцию rpoS мРНК, изменяя вторичную структуру 5 -нетранслируемой области мРНК недалеко от последовательности Шайна-Дальгарно и, тем самым, стимулируя связывание рибосом с транскриптом (Muffler et al, 1996; Brown & Elliott, 1996; Brown & Elliott, 1997; Cunning etal., 1998). Важную роль в узнавании белком регуляторного участка мРНК играет вторичная структура мРНК (Brown & Elliott, 1997). В механизме регуляции экспрессии гена rpoS участвуют несколько регуляторных нетранслируемых клеточных РНК: OxyS РНК (Altuvia et al, 1997; Zhang et al, 1998), DsrA РНК (Sledjeski & Gottesman, 1996; Majdalani et al, 1998; Lease & Belfort, 2000-a, 2000-b) и RprA РНК (Majdalani et al, 2001). Во всех трёх случаях в регуляции участвует также белок Hfq. Комплекс Hfq с OxyS РНК репрессирует трансляцию rpoS, тогда как комплексы Hfq с DsrA РНК или RprA РНК стимулируют ее (Zhang et al, 1998; Sledjeski et al, 2001; Repoila et al, 2003). Ранее предполагалось, что регуляторные РНК связываются с белком Hfq, меняют его активность и таким образом влияют на трансляцию rpoS мРНК. Сейчас показано, что Hfq участвует в образовании тройственного комплекса, в состав которого входят мРНК-мишень (в данном случае rpoS мРНК) и регуляторная нетранслируемая РНК (Zhang et al, 2002; Moller et al, 2002; Brescia et al, 2003).

Существуют два предположения о роли Hfq в данных тройственных комплексах: либо белок стабилизирует активную конформацию мРНК или регуляторной РНК, либо является "платформой" для посадки на мРНК дополнительных факторов, участвующих в контроле экспрессии гена (например, регуляторных РНК) (Hengge-Aronis, 2002). При взаимодействии DsrA или RprA РНК с лидерной областью rpoS мРНК разрушается ингибирующая трансляцию вторичная структура мРНК (Majdalani et al, 2001). Таким образом, Hfq является не прямым Обїор литературы регулятором трансляции rpoS мРНК, а контролирует активность регуляторных РНК, влияя на их пространственную структуру и обеспечивая их взаимодействие с нужным участком мРНК. Например, при связывании Hfq с DsrA РНК вторичная структура РНК не изменяется, но значительно меняется ее третичная конформация (Brescia et al., 2003). DsrA или RprA РНК действуют по сходному механизму, но в ответ на разные внешние сигналы: DsrA РНК осуществляет регуляцию трансляции rpoS мРНК при пониженных температурах (Repoila & Gottesman, 2001, 2003), тогда как RprA РНК действует в ответ на сигналы стресса клеточной поверхности (Majdalani et aL, 2002). Кроме того, DsrA РИК контролирует экспрессию некоторых других генов как на уровне трансляции (гены argR, UvIH, rbsD), образуя регуляторные комплексы с мРНК (Lease et al., 1998), так и на уровне транскрипции, путём регуляции синтеза о субъединицы РНК-полимеразы (гены rcsA, dsrB) (Sledjeski & Gottesman, 1995).

Есть данные, что DsrA связывается непосредственно с 30S субчастицей рибосомы, не мешая при этом связыванию с 30S субчастицей RpoS мРНК и тРНКме, (Worhunsky et al., 2003), OxyS РНК репрессирует трансляцию rpoS в ответ на окислительный стресс. Показано, что OxyS РНК регулирует экспрессию не только rpoS, но и fhlA мРНК, кодирующей активатор транскрипции. При этом также происходит образование тройственного комплекса OxyS РНК с flilA мРНК и белком Hfq (Altuvia et al., 1998; Argaman & Altuvia, 2000; Zhang et al, 2002). Недавно опубликованы данные, свидетельствующие об участии еще как минимум одной малой регуляторной РНК в стимуляции трансляции RpoS мРНК. Данная РНК также действует в комплексе с белком Hfq и является компонентом транспортной системы неорганического фосфата (Ruiz & Silhavy, 2003).

Питательные среды

Хромосомную ДНК Е. coli DH5a выделяли по методике Мармура (Маптшг J., 1961) с небольшими изменениями. На ночь засевали 100 мл среды LB штаммом Е. coli DH5a. Биомассу осаждали центрифугированием (7 500 g, 15 мин, 4 С) и ре суспендировал и в 5 мл буфера ТЭ. Добавляли 10% SDS до конечной концентрации 1% и аккуратно трясли 7-8 ч при комнатной температуре. Далее 4-5 раз обрабатывали образец равным объёмом смеси фенола с хлороформом (1:1) до исчезновения иитерфазы. К образцу добавляли 2.5 объёма этанола в присутствии ацетата калия, рН 4.8, ДНК осаждали центрифугированием (14 000 g, 7 мин, 20С). Осадок подсушивали в вакуумной сушке и ресуспендировали в 3 мл буфера ТЭ. Образец обрабатывали РНКазой А в концентрации 150 мг/л при 37С в течение 1 ч. Затем образец обрабатывали протеиназой К в концентрации 150 мг/л при ЪТС в течение 1 ч. К полученной смеси добавляли равный объём смеси фенола с хлороформом (1:1), затем к верхней фазе добавляли равный объём хлороформа. К полученному препарату ДНК добавляли 2.5 объёма этанола в присутствии ацетата калия, рН 4.8, и центрифугировали при 14 000 g в течение 10 мин при 20С.

Осадок промывали 70% этанолом и растворяли в буфере ТЭ. Хранили при 4С. На ночь засевали 3 мл жидкой среды LB. Биомассу осаждали центрифугированием при 3 000 g в течение 10 мин при 4С. Ресуспендировали в 100 мкл буфера, содержащего 25 мМ Трис-НС1, рН 8.0, 50 мМ глюкозу, 20 мМ ЭДТА. Добавляли 200 мкл раствора, содержащего 1%SDS, 0.2HNaOH. Аккуратно перемешивали, Методы инкубировали на льду в течение 10 мин. Затем добавляли 150 мкл 3/5 М ацетата калия, рН 4.8, осторожно перемешивали и инкубировали на льду в течение 5 мин. Центрифугировали при 14 000 g в течение 10 мин при 20С. Супернатант переносили в новую пробирку и добавляли к нему равный объём изопропанола, инкубировали в течение 10 мин при 20С. ДНК осаждали центрифугированием при 14 000 g в течение 5 мин при 20С. Осадок промывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в 400 мкл буфера ТЭ. Очистку выделенной плазмиднои ДНК проводили как описано в (Маниатис и др., 1984). К каждому миллилитру раствора ДНК добавляли 1 г сухого CsCl и перемешивали до полного растворения. Далее на каждые 10 мл раствора добавляли 0.8 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Полученной смесью заполняли центрифужные пробирки Beckman 65 и герметично их запаивали. Центрифугирование проводили при 50 000 g в течение 24 ч. С помощью шприца с иглой отбирали нужную полосу ДНК. Бромистый этидий удаляли экстракцией равным объёмом изоамилового спирта (5-6 раз, до исчезновения окраски растворов). Затем проводили диализ водной фазы против буфера ТЭ с тремя сменами (использовали диализные мембраны с размерами пор 10-14 кДа). ДНК осаждали двумя объёмами этанола, осадок растворяли в буфере ТЭ. Данный метод использовали для очистки векторов при клонировании генов и Т7 транскрипции in vitro. На ночь засевали чашку с LB-агаром требуемым штаммом Е. coli. Затем пересевали клетки в 50 мл жидкой среды SOB и растили с качанием при 37С до оптического поглощения (А о) 0.45-0.5 о.е./мл.

Охлаждали на льду и стерильно осаждали при 2 000 g в течение 15 мин при 4С. Суспендировали клетки в 16 мл буфера ТБ и стерильно осаждали при 2 000 g в течение 15 мин при 4С. Суспендировали клетки в 4 мл буфера ТБ. Осторожно помешивая суспензию, добавляли к ней 280 мкл ДМСО (до 7%) и инкубировали на льду в течение 10 мин. Расфасовывали компетентные клетки по 200 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -70С до полугода. Компетентные клетки Е. coli размораживали на льду в течение 20 мин, затем добавляли 40-50 нг плазмидной ДНК (объём ДІЖ не превышал 10% от объёма клеток) и инкубировали на льду ещё 20 мин. Далее клетки переносили в водяную баню (42С) на 60-70 сек и снова ставили в лёд на 5 мин. Добавляли среду LB без антибиотика до конечного объёма I мл и инкубировали клетки при 37С без качания в течение 1 ч. Затем высевали трансформанты на LB-arap, содержащий соответствующий антибиотик, и растили при 37С в течение ночи.

Ген hfq Е. coli амплифицировали при помощи полимеразной цепной реакции, матрицей служила хромосомная ДНК Е. coli DH5a. Использовали праймеры, содержащие сайты узнавания для рестриктаз Ndel и ВатНІ (подчёркнуты). Прямой праймер: 5 GGAAAAGAGCATAIGGCTAAGGGG 3 Обратный праймер: 5 CGCTGGATCCCCGTGTAAAAAAAC 3 ПЦР проводили в объёме 100 мкл. Реакционная смесь содержала 10 мкл 10-кратного ПЦР буфера (570 мМ Трис, рН 8.8, 166 мМ (NH4)2S04 и 15% Tween-20), 2.5 мМ MgCI2, смесь дезоксирибоїіуклеотидов (0.2 мМ каждого), праймеры (100 пМ каждого), 20 нт хромосомной ДНК Е. coli и 5 единиц активности Vent-ДНК полимеразы. ДНК гена амплифицировали в течение 30-35 циклов. Каждый цикл состоял из трех этапов: денатурация ДНК при 95С 30 сек, отжиг праймеров при 57С 30 сек и полимеразная реакция при 72С 3 мин. Результаты реакции анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле. ПЦР-продукт и вектор pETl la-PL обрабатывали рестриктазами Ndel и BamHI, полученные фрагменты очищали электрофорезом и последующей элюцией из 1% агарозы. Лигирование проводили в объёме 10 мкл. Лигазная смесь содержала 50 нг вектора, 50 нг ПНР-фрагмента и 1 ед. активности Т4 ДНК-лигазы. Штамм Е. coli BL21(DE3) трансформировали полученной рекомбинантной плазмидоЙ pEcoHfq, содержащей ген hfq Е. coli под контролем Т7 промотора. Последовательность гена проверяли секвенированием (фирма "GATC", Германия) с использованием универсальных праймеров Т7.

Синтез белка EcoHfq индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации 0.1 мМ в культуру клеток, выращенную с добавлением ампициллина (100 мг/л), при поглощении (Лбоо) 0.8 о.е./мл. После добавления индуктора клетки росли в течение 3 часов при 37С с качанием. Биомассу осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 7 000 g и 4С. Уровень продукции белка EcoHfq оценивали электрофорезом в 15% ПААГ (сшивка 19:1) в присутствии SDS. Гели окрашивали Кумасси G-250. 3.1.7. Получение штамма-суперпродуцента белка Hfq P. aeruginosa Ген hfq P. aeruginosa амплифицировали при помощи полимеразной цепной реакции, матрицей служила плазмидная ДНК, несущая фрагмент Методы хромосомной ДНК P. aeruginosa, содержащий ген hfq (любезно предоставлена У. Блези, Венский биоцентр, Австрия). Использовали праймеры, содержащие сайты узнавания для рестриктаз Ndel и Hindlll (подчёркнуты). Прямой прайм ер: 5 GGGGCGAAAAAAGCTTTCAAGCGTTGCCCGGCTCGG вектор рЕТ22Ь+ обрабатывали рестриктазами Ndel и Hindlll, полученные фрагменты очищали электрофорезом и последующей элюцией из 1.5% агарозы. Лигирование проводили в объёме 20 мкл. Лигазная смесь содержала 50 нг вектора, 50 нг ПЦР-фрагмента и 1 ед. активности Т4 ДНК-лигазы, Штамм Е. coli BL21(DE3), несущий плазмиду pUBS520, трансформировали полученной рекомбинантной плазмидой pPaeHfq, содержащей ген hfq P. aeruginosa под контролем Т7 промотора. Последовательность гена проверяли секвенированием (Венский биоцентр, Австрия) с использованием универсальных праймеров Т7. Синтез белка PaeHfq индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации 0.5 мМ в культуру клеток, выращенную с добавлением ампициллина (100 мг/л) и канамицина (50 мг/л), при поглощении (А оо) 0.5 о.е./мл. После добавления индуктора клетки росли в течение 3 часов при 37С с качанием. Биомассу осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 7 000 g и 4С. Уровень продукции белка PaeHfq оценивали электрофорезом в 15% ПААГ (сшивка 19:1) в присутствии SDS. Гели окрашивали Кумасси G-250.

Для получения белков EcoHfq и PaeHfq, содержащих остатки селенометионина, использовали штамм Е. coli В834, ауксотрофный по метионину. В случае белка EcoHfq данный штамм трансформировали плазмидой pEcoHfq, в случае белка PaeHfq - штамм Е. coli В834, содержащий плазмиду pUBS520, трансформировали плазмидой pPaeHfq. Трансформанты высевали на чашки с LB-агаром, содержащим соответствующие антибиотики, растили в течение ночи при 37С. Утром засевали 3 мл жидкой среды LB с антибиотиками, растили при 37С с качанием до оптического поглощения 0.5 о.еАш. Далее клетки осаждали центрифугированием при 3 000 g в течение 5 мин, промывали их средой М9 и снова осаждали при тех же условиях. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл жидкой среды M9/SeMet и подращивали при

Выделение и очистка рекомбинантного белка PaeHfq

Электрофорез проводили по методу Леммли (Laemmli, 1970) в присутствии SDS в электрофоретической камере Bio-Rad. Электрофорез проводили в пластинах толщиной 0.75 мм. Гелевая пластина состояла из разделяющего и концентрирующего гелей. Разделяющий гель содержал 14,2% акриламида, 0.8% МБА, 0.1% SDS, 375 мМ Трис-HCl, рН 8.8. Концентрирующий гель содержал 5% акриламида, 0.25% МБА, 0.1% SDS, 125 мМ Трис-HCl, рН 6.8. Для полимеризации гелей к 5 мл раствора добавляли 5 мкл ТЕМЕД и 25 мкл 10% раствора персульфата аммония. Полимеризация длилась 25-30 мин при комнатной температуре. Для электрофореза использовали электродный буфер для SDS-электрофореза. Образцы растворяли в буфере для образцов SDS-электрофореза в соотношении объёма образца к объёму буфера 4:1 и кипятили на водяной бане в течение 3 мин. Объём образцов не превышал 30 мкл. Образцы подслаивали под электродный буфер в ячейки гелевой пластины и проводили электрофорез в течение 1.5 ч. До вхождения образцов в разделяющий гель электрофорез вели при 100 В, затем - при 180 В.

После электрофореза гели фиксировали и окрашивали при нагревании в течение 5 мин в растворе, содержащем 0.05% Кумасси G-250, 30% этанол, 10% уксусную кислоту. От избытка красителя гели отмывали в растворе 5% уксусной кислоты при нагревании. Методы аналитическая гель-фильтрационная хроматография в системе FPLC на носителе Superose 12В с маркёрами молекулярных весов. Размеры колонки составляли 30 см в длину, 10 мм в диаметре, скорость элюции 0.4 мл/мин, чувствительность - 0.02 о.е. (фильтр 275 нм). Хроматографию проводили в 50 мМ буфере Трис-HCl, рН 8.0, содержащем 1.5 М NaCI. В качестве маркёров молекулярных весов использовали бычий сывороточный альбумин (MW = 66 кДа) и а-лактальбумин (MW= 14.2 кДа), предварительно переведённые диализом в хроматографический буфер. Калибровку проводили нанесением на колонку маркёров в следующих количествах: 100 мкл бычьего сывороточного альбумина в концентрации 2 о.еУмл, 100 мкл а-лактальбумина в концентрации 0.72 о.еУмл. Для проведения эксперимента на колонку наносили 85 мкл белка EcoHfq в концентрации 0.8 о.е./мл. Трис-HCl буфера, рН 8.0, содержащего 200 мМ NaCl, и доводили до концентрации 3 мг/мл. Объём образцов составлял 0.25 мл. В качестве контроля использовали тот же буфер. Коэффициенты седиментации « рассчитывали по формуле: где S - коэффициент седиментации в единицах Сведберга, R - расстояние от оси вращения до образца (см), со - угловая скорость (рассчитывается по формуле: ш = 2тт/б0, где п число оборотов ротора в минуту), t - время от начала эксперимента (мин). 3.4. Методы работы с РНК и РНК-белковыми комплексами 3.4.1. Т7 транскрипция ш vitro OxyS, DsrA, RprA и RyhB РНК Препаративную Т7 транскрипцию in vitro проводили в объёме 250 мкл. В качестве матрицы использовали линеаризованную по Smal сайту плазмиду с клонированным геном соответствующей РНК. Реакционные смеси содержали 25 мкл 10-кратного транскрипционного буфера (400 мМ Hepes-KOH, рН 8.0, 280 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, 10 мМ спермидин), 15мкг матричной ДНК, рибонуклеотидтрифосфаты в концентрации 4 мМ каждый, 200 ед. активности Т7 РНК-полимеразы. Реакция проводилась в течение 3-4 ч при 37С. Продукты реакции анализировали электрофорезом в ПААГ в присутствии 8 М мочевины. Электрофорез проводили в присутствии 8 М мочевины в электрофоретической камере Bio-Rad. Электрофорез проводили в пластинах толщиной 0.75 мм.

Гель содержал 19% акриламида, 1% МБ А, 8 М мочевины, 89 мМ Трис-борат, 89 мМ борную кислоту, 2,5 мМ ЭДТА. Для полимеризации гелей к 5 мл раствора добавляли 5 мкл ТЕМЕД и 25 мкл 10% раствора персульфата аммония. Полимеризация длилась 25-30 мин при комнатной температуре. Для электрофореза использовали электродный буфер ТБЭ. Образцы растворяли в 8 М мочевине и кипятили на водяной бане в течение 3 мин. Объём образцов не превышал 30 мкл. Образцы подслаивали под электродный буфер в ячейки гелевой пластины и проводили электрофорез в течение 1.5-2 ч. До вхождения образцов в разделяющий гель электрофорез вели при 100 В, затем - при 180 В. После электрофореза гели окрашивали либо в растворе бромистого этидия, либо в растворе, содержащем 0.1% толуидип синий и 10%

Сбор дифракционных данных

Предварительную проверку качества полученных кристаллов проводили на генераторе рентгеновских лучей с вращающимся анодом (Институт белка РАН, Пущино). Сбор дифракционных данных проводили на синхротронных линиях DESY (EMBL, Гамбург, Германия), используя MAR CCD детекторы, и SpRing-8 (Харима, Япония). Методы Сбор кристал л ографических данных при температуре 100К проводили с использованием двух криопротектантов. В одном случае кристаллы петлёй переносили сначала в противораствор, а затем в сохраняющий раствор, содержащий 1.2 М (NH hSd» в 50 мМ Na-цитратном буфере, рН 5.6, и 15% этиленгликоль в качестве криопротектанта, и немедленно замораживали. В другом случае кристаллы петлёй переносили в раствор, содержащий 1 М (NH SCU в 50 мМ Na-цитратном буфере, рН 5.6, и 30%w/v глюкозу в качестве криопротектанта, выдерживали их в данном растворе 3-5 мин и затем быстро замораживали в струе жидкого азота. Предварительную обработку полученных данных вели с использованием пакетов программ XDS (Kabsch, 2001), Mosflm и Denzo. Результаты и обсуждение Гены белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa были клонированы в экспрессионные векторы pETl la-PL (любезно предоставлен д-ром В. Пиндлом) и рЕТ22Ь+. Молекулярные массы белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa равны 11.2 и 8.9 кДа, соответственно. Общая схема клонирования представлена на рис. 12. Последовательности генов были проверены секвенированием. Ген белка Hfq Е. coli был суперэкспрессирован под контролем Т7 промотора в клетках Е. coli BL21(DE3), ген белка Hfq P. aeruginosa был суперэкспрессирован под контролем Т7 промотора в клетках BL21(DE3)/pUBS520. Плазмида pUBS520 содержит ген аргининовой тРНК, узнающей редкие для Е. coli кодоны AGA и AGG. Присутствие данной плазмиды в клетках штамма-суперпродуцента Е. coli значительно увеличивает продукцию рекомбинантных белков и предупреждает замены аргининов на лизины, возникающие при недостатке соответствующей тРНК (Brinkmann et a I., 1989). Экспрессия генов проводилась в системе Штудиера (Studier et al., 1990). 1 Были подобраны оптимальные условия экспрессии генов hfq Е. coli и P. aeruginosa в полученных штаммах-суперпродуцентах. Клетки выращивали на богатой среде до оптической плотности OD59o=0.5-0.55 о.е./мл.

Экспрессию генов индуцировали добавлением изопропил-(3-0-тиогалактозида (ИПТГ) в растущие культуры до конечной концентрации 0.1 мМ, после чего клетки росли еще 3 часа при 37С с качанием. Эффективность экспрессии проверяли методом SDS-электрофореза (рис. 13). Для получения белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa, содержащих атомы Se, клетки штамма Е. coli В834, ауксотрофного по метионину, были трансформированы полученными плазмидами pEcoHfq и pPaeHfq. Далее клетки выращивались на синтетической среде с добавлением селенометионина (SeMet).

Суперпродукция белка SeMet-Hfq P. aeruginosa также проводилась в присутствии плазмиды pUBS520, как и в случае суперпродукции нативного белка Hfq P. aeruginosa. Индукция синтеза суперпродуцируемых белков проводилась добавлением ИПТГ в растущие культуры при оптическом поглощении 0.4-0.45 о.е./мл до конечной концентрации 0.1 мМ. Результаты и обсуждение Глава 4.2. Выделение гомогенных растворимых препаратов белков EcoHfq и PaeHfq из штаммов-суперпродуцентов Схема выделения белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa из штаммов-суперпродуцентов включает в себя несколько основных этапов: разрушение клеток и удаление дебриса, прогрев клеточного лизата и удаление термолабильных белков, хроматографическое разделение белков (рис. 14). Биомасса суперпродуцента белка Hfq І Разрушение ультразвуком, низкоскоростное центрифугирование Клеточный лизат S I Температурная обработка, низкоскоростное центрифугирование Супернатант после прогрева I Хроматография на Butyloyopearl Объединенные фракции, содержащие Hfq I Диализ, концентрирование Рис. 14. Схема выделения белков EcoHfq и PaeHfq из штаммов-суперпродуцентов. Первые стадии очистки белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa (удаление мембранной фракции и тепловая обработка полученного экстракта) позволили получить препараты с чистотой до 85% по данным SDS-электрофореза (рис. 15а, 156). Температуру тепловой обработки подбирали экспериментальным путем, прогревая клеточный экстракт при температурах 40-100С с шагом 5С и оценивая степень очистки белков методом SDS-электрофореза (данные не представлены).

При прогревании Результаты и обсуждение препаратов при 80С в течение 15 мин большинство белков Е. coli денатурирует и образует нерастворимый осадок, тогда как практически весь белок Hfq остается в растворе. Стадия прогрева не меняет активность белков Hfq Е. coli и P. aeruginosa, что было показано в представленной работе при исследовании РНК-связывающих свойств данных белков, а также в экспериментах по тоэпринту, проведенных нашими австрийскими коллегами. М23456М М123456М а б Рис. 15. SDS-электрофореграммы препаратов EcoHfq (а) и PaeHfq (б) на разных стадиях очистки. М - маркёры молекулярных масс, кДа; 1 - клеточный лизат до индукции ИПТГ; 2 - клеточный лизат после индукции ИПТГ; 3 - клеточный дебрис; 4 - супернатант после осаждения дебриса; 5 - осадок после тепловой обработки; 6 - супернатант после тепловой обработки. Самой сложной задачей оказалось удаление РНК из препаратов Hfq. Проведение гидрофобной хроматографии на смоле Butyloyopearl в градиенте концентраций (NH SC /NaCl (1.7/1.5 М - 0/0 М) позволило полностью очистить белки от РНК. Белки EcoHfq и PaeHfq прочно связывались с носителем и элюировались при концентрациях (NH SO/NaCl 0.4/0.35 М, тогда как РНК не связывалась с носителем и выходила при нанесении образца и промывке колонки исходным буфером.

Похожие диссертации на Структура и РНК-связывающие свойства бактериального регулятора экспрессии генов-белка Hfq

Регуляция экспрессии генов коровой части острова патогенности бактерий рода Yersinia транскрипционным регулятором YbtAАнисимов Роман Львович

Экспрессия гена белка холодового шока капусты при низкотемпературном стрессеМатниязов Рустам Тахирович

Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов белков теплового шока при адаптации организмов к различным условиям обитанияЗацепина Ольга Георгиевна

Экспрессия генов белков NS5B и NS5A вируса гепатита C, ингибиторный анализ и белок-белковое взаимодействиеИванов Александр Владимирович

Белки теплового шока микоплазм : Клонирование и экспрессия гена dnakВонский Максим Сергеевич

Создание рекомбинантных плазмид, содержащих ген нуклеокапсидного белка вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом и изучение экспрессии вирусного белка в про- и эукариотической системахЧубукова Ольга Вячеславовна

Роль экспрессии гетерологичных генов растительного дефензина rs-afp2 и суперсладкого белка тауматин II в повышении резистентности к фитопатогенам и изменении вкуса плодов на примере земляники садовойШестибратов Константин Александрович

Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации типа II C-белкамиБогданова Екатерина Сергеевна

Исследование структуры РНК и белка нуклеопротеида вируса гриппа в растворе и в составе РНП Соколова Марина Владимировна

Гены 4,5SH РНК: структура, эволюция, транскрипцияКоваль Анастасия Павловна