Введение к работе
Актуальность проблемы. Повышенная температура или тепловой шок (ТШ) при воздействии на все известные организмы, от бактерии до человека, активирует гены теплового шока (бтш), представляющие собой эффективную защитную систему как на клеточном уровне, так и на уровне целого организма. Гены теплового шока кодируют специфические белки (БТШ).
Гены ТШ и их продукты, сразу после открытия в 1974 г., стали объектом пристального исследования. Оказалось, что БТШ индуцируются не только теплом, но и целым рядом других повреждающих факторов как физического, так и химического происхождения.
Система генов ТШ очень быстро реагирует на внешний стимул. Гены ТШ высоко консервативны. Наиболее консервативными являются гены бтш70. Аминокислотные последовательности БТШ70 у человека и E. сoli гомологичны на 50%, а ряд доменов – на 96% (Schlesinger, 1990). Такой консерватизм БТШ у всех изученных организмов свидетельствует об исключительно важной роли этих белков в защите клеток от повреждений во время и после стресса (Lidquist, 1986; Feder and Hoffman, 1999).
Основная функция БТШ при стрессе – предотвращение агрегации и восстановление нативной третичной структуры денатурированных белков, концентрация которых резко увеличивается при повышении температуры (Fink 1999; Hartl and Hayer, 2002).
Со времени открытия БТШ были подробно исследованы их структура и функции, а также молекулярные механизмы их экспрессии.
Вопрос об участии БТШ70 в адаптации на уровне целого организма в течение длительного времени оставался неисследованным. Наиболее актуальным в этом направлении является изучение молекулярных механизмов адаптации организмов и возможной роли БТШ в этом процессе у разных географических популяций одного и того же вида, а также у близких видов, живущих в условиях, резко отличающихся по средней температуре обитания. Такой подход, впервые предложенный М.Б. Евгеньевым, дает возможность не только исследовать молекулярно-физиологические функции БТШ при стрессе, но и понять их значение в экологии, адаптации и эволюции популяций.
Первые работы такого плана были выполнены в России на различных видах шелкопряда и на девяти видах ящериц, отличающихся по температуре обитания (Шейнкер и др., 1987; Ulmasov et al., 1992). В этих исследованиях были обнаружены различия в уровне синтеза БТШ70 у разных видов, в зависимости от температуры района их обитания. Однако, в то время было неясно, какие механизмы регуляции экспрессии БТШ лежат в основе этих различий.
В частности, не было известно, имеются ли какие-нибудь различия в ответе на ТШ у теплокровных организмов, тысячелетиями проживавших в контрастных по температурному режиму районах (например, пустыни Средней Азии и северные районы России).
Основным механизмом термоустойчивости у пустынных видов ящериц (Ulmasov et al., 1992) и муравьев (Gehring and Wehner, 1995) является, по-видимому, конститутивный синтез БТШ в нормальных условиях, обусловливающий готовность организма пережить резкий подъем температуры. У мух рода Drosophila синтез БТШ70 в норме репрессирован. Было актуально узнать, существует ли взаимосвязь между уровнем индукции БТШ70 и термоустойчивостью у разных видов мух рода Drosophila. Важно было выяснить, какие молекулярные механизмы лежат в основе вариабельности уровня индукции БТШ70, обеспечивающей адаптацию мух и других организмов к различным условиям обитания.
Устройство кластера генов бтш70 у D. melanogaster хорошо изучено, известна также и структура промоторной области генов бтш у этого вида. Было интересно провести сравнительный анализ локуса генов бтш70 у видов Drosophila группы virilis, отделённых от группы melanogaster десятками миллионов лет дивергентной эволюции. Следовало также выяснить, имеются ли различия в устройстве кластера генов бтш70 и внутри самой группы virilis, у контрастных по температуре обитания видов, таких как D. virilis, D. lummei. Такого плана исследования могут прояснить пути эволюции и адаптации у родственных видов, обитающих в разных температурных нишах.
В последние десятилетия накоплено много фактов, говорящих о важной роли мобильных генетических элементов (МЭ) в адаптации и эволюции самых различных видов животных. Однако, возможный вклад МЭ в адаптацию видов к определенным температурным режимам обитания не был изучен. Встраивание МЭ в регуляторную область генов бтш может иметь весьма важные последствия, способные повлиять на тонкие механизмы регуляции и эволюции этой важнейшей адаптационной системы. Соответственно, актуальность изучения закономерностей встраивания МЭ в промоторную область генов бтш и влияние таких встраиваний на термоустойчивость организмов не вызывает сомнения.
Цель работы. Выявление основных молекулярных механизмов регуляции генов бтш при адаптации организмов к различным условиям обитания.
Основные задачи исследования
1. Провести анализ кинетики и уровня синтеза БТШ70 в норме и после ТШ у ящериц, резко различающихся по температуре среды обитания.
2. Выявить молекулярные механизмы регуляции экспрессии БТШ70 у изучаемых модельных видов. В частности изучить:
а) число копий бтш70 у сравниваемых видов,
б) регуляцию транскрипции бтш.
3. На примере первичной культуры фибробластов, полученных из кожи коренных жителей Туркменистана и центральной части России, изучить возможные различия в термоустойчивости у теплокровных.
4. Провести детальное исследование ответа на ТШ на примере рядов видов и линий Drosophila (D. melanogaster, D. lummei, D. montana, D. texana, D. virilis, D. novamexicana и D. mojavensis), различающихся по температуре экологической ниши обитания. Для этого исследовать:
а) базальную и индуцируемую термоустойчивость,
б) уровень экспрессии БТШ70,
в) паттерн белкового синтеза после ТШ,
г) регуляцию транскрипции бтш.
5. Исследовать механизмы эволюции генов бтш70 у группы видов с хорошо изученной филогенией (на примере группы virilis). Для этого изучить:
а) строение кластера генов бтш70 у D. virilis и D. lummei.
б) клонировать и секвенировать гены бтш70 с фланкирующими последовательностями у изучаемых видов и линий.
6. Оценить вклад других групп БТШ в термоустойчивость организмов.
7. Изучить роль МЭ в адаптации организмов к изменяющимся условиям среды обитания. Для этого на модельной системе исследовать частоту и локализацию внедрения Р элемента в гены бтш70 D. melanogaster, а также описать функциональные последствия таких внедрений.
Научная новизна
1. В ходе исследования на примере нескольких видов ящериц было показано, что основную защитную роль при ТШ у южных видов играет конститутивный синтез БТШ70, отсутствующий у северных видов. Впервые выявлена корреляция между естественными колебаниями температуры в течение дня и уровнем синтеза БТШ70 в клетках животных. Впервые показано, что конститутивный синтез БТШ70 обусловлен особенностями связывания фактора транскрипции ТШ с промотором. Выявлены характерные различия в пороге индукции БТШ и длительности их синтеза, в зависимости от температуры среды обитания сравниваемых видов.
2. Впервые выявлены различия в термоустойчивости клеток у теплокровных, на примере культур первичных фибробластов, полученных из кожи коренных жителей Туркменистана и центральной части России.
3. Впервые у видов Drosophila группы virilis изучен паттерн индукции ряда групп БТШ в ответ на различные температурные воздействия. Выявлен преимущественный синтез низкомолекулярных БТШ и БТШ40 у термоустойчивых видов, по сравнению с более термочувствительными, при жестком температурном воздействии.
3. Методом масс-спектрометрии достоверно определены основные члены семейства БТШ70 у видов группы virilis.
4. Впервые обнаружены различия в числе генов бтш70 у разных линий и видов данной группы.
5. Подробно изучена структура кластера генов бтш70 у группы видов virilis; предложена модель, объясняющая эволюцию этого кластера в роде Drosophila.
6. На примере видов Drosophila показаны сложные взаимоотношения между уровнем синтеза БТШ и термотолерантностью. Впервые выявлено встраивание МЭ Jockey в промоторную область терморезистентной линии D. melanogaster (ТТ), способной размножаться при повышенной температуре (32С). Показано снижение экспрессии генов бтш70 и изменение паттерна синтеза БТШ в этой линии.
7. На модельной системе, разработанной для D. melanogaster, методом направленного Р-мутагенеза выявлено специфическое встраивание конструкции на основе Р элемента исключительно в промоторную область генов бтш70. Найдены горячие точки встраивания.
Положения, выносимые на защиту
1. Адаптационная эволюция ответа организма на стрессирующее воздействие окружающей среды может существенно различаться в зависимости от вида и/или группы организмов.
2. Важную роль в термоустойчивости организмов играет БТШ70.
3. Пластичность индукции БТШ в значительной степени определяется фактором теплового шока (HSF). Как правило, у пустынных теплолюбивых видов температурный порог индукции белков теплового шока выше, чем у видов средней полосы.
4. Терморезистентные виды при физиологически нормальной температуре часто характеризуются наличием определенного базального уровня БТШ70 в клетках.
5. Базальный уровень синтеза БТШ может быть обусловлен свойствами HSF и промотора генов бтш.
7. В большинстве случаев адаптация организма к гипертермии достигается без изменения числа генов теплового шока, хотя у некоторых видов вариабельность в числе генов в популяции может иметь адаптивный характер.
8. Низкомолекулярные БТШ вносят существенный вклад в термоустойчивость организмов.
9. Мобильные элементы играют важную роль в регуляции активности и эволюции генов теплового шока.
Практическая ценность. Полученные в ходе исследований результаты важны для понимания механизмов адаптации организмов к изменяющимся условиям окружающей среды. В условиях глобального изменения климата и загрязнения окружающей среды, эти знания могут быть полезными для сохранения вымирающих видов. Полученные данные представляют ценность для создания практически важных трансгенных животных и растений, способных жить и размножаться в экстремальных условиях внешней среды.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 6-й Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (29 июня – 5 июля 2003 г., Санкт-Петербург – Москва); 11-й Международной Конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» в сессии «Молекулярные и клеточные аспекты биологии стресса» (6 – 10 октября 2003 г., Санкт-Петербург); 1-м Международном Конгрессе по роли ответа на стресс в биологии и медицине (Квебек, Канада, 2003 г.); на международной конференции «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции» (Ереван, 8 – 11 сентября 2005 г.); на международной конференции "Генетика в России и мире" (Москва, 28 июня – 2 июля 2006 г.); на конференциях «Динамика генофондов» 2006, 2007 гг., на 13 Международной Конференции по молекулярным механизмам старения (Квебек, Канада, май 2009 г.).
Вклад автора. Основные результаты получены лично и совместно с Евгеньевым М.Б., Ульмасовым Х.А., Гарбузом Д.Г., Молодцовым В.Б., Шиловой В.Ю., Зеленцовой Е.С.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 статей в научных рецензируемых журналах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, описания материалов и методов, пяти глав, посвященных выявлению основных молекулярных механизмов регуляции генов бтш при адаптации организмов к различным условиям обитания, выводов, списка цитируемой литературы, в который входит _____ ссылки. Работа изложена на_____страницах, сдержит ______ рисунков и _____ таблицы.
