Содержание к диссертации
Введение
1. Утилизация железа 9
1.1. Значение железа для бактерий 9
1.2. Сидерофоры 9
1.2.1. Характеристика сидерофоров 9
1.2.2. История открытия сидерофоров 10
2. Утилизация железа в бактериях рода Yersinia 11
2.1. Особенности строения энтеробактерий 11
2.2. Род Yersinia 12
2.3. Системы утилизации железа в Y. enterocolitica 13
2.4. Транслокация сидерофоров через клеточные мембраны 14
2.5. Депонирование железа 15
2.6. Железо как регулятор 15
2.7. Йерсиниабактин 16
2.8. Остров патогенности (High Pathogenicity Island, НРІ) 17
3. YbtA 19
3.1. Семейство AraC/XilS 19
3.2. YbtA, известные на сегодняшний день факты и предположения 20
3.2.1. Биохимическая характеристика YbtA 20
3.2.2. YbtA-регулируемые промоторы 22
3.2.3. ERIC элемент промоторам/Л Y. enterocolitica 24
2 Материалы и методы 26
1. Материалы. 26
1.1. Оборудование 26
1.2. Химикалии и ферменты 27
2. Бактерии, плазмиды и п рай меры 27
2.1. Бактерии 27
2.2. Праймеры 28
2.3. Плазмиды 29
3. Бактериальные среды и антибиотики, использованные в работе 30
3.1. Бактериальные среды 30
3.2. Антибиотики 31
4. Работа с бактериями 31
4.1. Условия роста 31
4.2. Трансформация клеток 33
4.3. Хранение культур 32
5. Использованные стандартные молекулярно-биологическис и биохимические методы 32
5.1. Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР) 32
5.2. Выделение и очистка ДНК 32
5.2.1. Выделение хромосомальной ДНК 32
5.2.2. Выделение плазмид 32
5.2.3. Выделение ПЦР-фрагментов 32
5.3. Выделение РНК и реакция удлинения п рай мера 33
5.3.1. Выделение РНК 33
5.3.2. Реакция удлинения праймера 33
5.4. Измерение концентрации белков и нуклеиновых кислот 33
5.4.1. Измерение концентрации ДНК и РНК 33
5.4.2. Измерение концентрации белка 34
5.5. Энзиматическая модификация ДНК 34
5.5.1. Сайт-специфическая рестрикция 34
5.5.2. Лигация 34
5.6. Электрофоретический анализ ДНК и белков 34
5.6.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле 34
5.6.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 35
6. Конструирование экспрессионной плазмиды рЕТЗс-YbtA 35
7. Очистка YbtA 36
7.1. Экспрессия YbtA в Е. coli 36
7.2. Хроматографическая очистка YbtA 37
8. Конструирование репортерных плазмид для изучения экспрессии YbtA - контролируемых генов и реакции удлинения праймера 38
8.1. Конструирование репортерных плазмид, несущих оригинальные промоторы генов HPI 38
8.2. Внесение делений в промоторы репортерных плазмид 40
9. ПЦР - амплификация промоторных фрагментов для EMSA и DNasel футпринтннга 41
10. Очистка йерснннабактнна 42
10.1. Биосинтез и очистка йерсиниабактина 42
10.2. Анализ йерсиниабактина 42
11. Анализ изменения электрофоретнческой подвижности 43
12. Определение флуоресценции CFP при репортерном анализе 43
13. DNase І футпринтинг. 44
14. Выравнивание защищенных областей 44
3 Результаты и обсуждение 45
1. УЫА-зависимые промоторы НР1 45
1.1. Точки начала транскрипции YbtA-зависимых промоторов HPI 45
1.2. -10 и -35 последовательности YbtA-зависимых промоторов HPI 46
2. Взаимодействие YbtA с промоторами-мишенями 49
2.1. Выделение YbtA 49
2.2. Взаимодействие YbtA с промоторами - мишенями 50
2.2.1. Комплексы YbtA-ДНК, формируемые промоторами HPI 50
2.2.2. Специфические YbtA - связывающие участки 51
3. Участие йерснннабактнна в регуляции YbtA-зависимых промоторов 56
3.1. Выделение йерсиниабактина 56
3.2. Влияние йерсиниабактина в среде на активность YbtA-зависимых промоторов 57
3.3. Опенка влияния йерсиниабактина на взаимодействия YbtA и ДНК 58
3.4. Оценка возможности связывания YbtA и Ybt-Fe комплекса 59
4. ERIC-элемент промоторов ігрб и ybtA Y. enterocolitica 61
4. Влияние ERIC-элемента на экспрессию с промоторов ігрб и ybtA 61
5 Функция сайтов связывания YbtA RSI. RS2 и RS3 в регуляции промоторов rht.4 и ігрб 64
5.1. Участие сайтов связывания YbtA в формировании комплексов с промоторами ігрб и ybtA 65
5.2. Влияние делеций сайтов связывания YbtA на транскрипционную активность промоторов ігрб и ybtA 67
6. Влияние компонентов системы утилизации железа на работу дивергентных промоторов ybtA и ігрб 72
6.1. Экспрессия промоторов в мутантах дефективных по различным компонентам системы утилизации железа 72
Обсуждение 73
Заключение 74
- Утилизация железа в бактериях рода Yersinia
- Бактерии, плазмиды и п рай меры
- Конструирование репортерных плазмид для изучения экспрессии YbtA - контролируемых генов и реакции удлинения праймера
- ERIC-элемент промоторов ігрб и ybtA Y. enterocolitica
Введение к работе
Патогенные микроорганизмы в среде организма хозяина сталкиваются с условиями недостатка железа, которое находится в комплексах с железосвязывающими белками, такими как трансферрин и лактоферрин. Как часть неспецифической иммунной защиты, доступность свободного железа может быть ещё более уменьшена осуществляемым лактоферрином транспортом железа в клетки печени (Bullen J.J. et al, 1987; Bullen J.J. et al, 1987). Чтобы выживать при железо дефицитных условиях, микроорганизмы используют различные механизмы утилизации железа. Один из них -
т- 3+
производство низкомолекулярных хелаторов с высоким сродством к re также известных как сидерофоры. Таким образом, биосинтез сидерофора может быть расценен как важный фактор вирулентности (de Almeida et al, 1993; Rakin et al, 1999a). Это особенно верно для рода Yersinia, поскольку только члены высокопатогенной группы (Brubaker, 1991; Carter, 1975; Perry et al, 1997) содержат кластер генов, обеспечивающих систему синтеза сидерофора йерсиниабактина и его утилизации. Этот кластер был назван Островом патогенности (High Pathogenicity Island, HPI) (Carniel et al, 1996; Gehring et al, 1998; Rakin et al, 1999b). Предположительно, основную роль в регуляции экспрессии генов острова играет транскрипционный регулятор YbtA, AraC/XilS - подобный белок, кодируемый геном в составе этого же острова (Bearden et al, 1997). Как было показано в экспериментах с мутантами, YbtA активирует экспрессию биосинтетических и транспортных генов HPI, но в то же время репрессирует свой собственный ген.
Изучение регуляторных механизмов является одной из фундаментальных задач молекулярной биологии. Однако, несмотря на важное медицинское значение изучения системы утилизации железа у Yersinia, она до сих пор является «черным ящиком» и реальные молекулярные механизмы ее регулирования неизвестны. С 1996 года, когда была указана необходимость прямых экспериментов (Fetherston et al, 1996), не было опубликовано никаких работ, посвященных исследованию регуляции экспрессии генов HPI.
*
Целью настоящей работы являлось изучение регуляции генов Острова Патоген ности. В основные задачи входило: поиск YbtA-связывающих последовательностей, выяснение возможности влияния предположенных ранее эффекторов на взаимодействие YbtA и промоторов острова, объяснение механизма YbtA-зависимой репрессии и активации различных генов.
Научная новизна работы. Впервые были охарактеризованы YbtA-регулируемые промоторы HPI, выделен гомогенный YbtA и определены сайты связывания YbtA. Кроме того, была предложена модель, позволяющая объяснить способность YbtA быть как активатором транскрипции, так и репрессором.
Научно-практическое значение работы. Изучение регуляторных механизмов лежит в основе молекулярной биологии, поэтому результаты данной работы имеют фундаментальное значение, расширяя познания в этой области. Показано, что кроме ранее предположенной пары нуклеотидных повторов RS1 и RS2 в каждом промоторе, был идентифицирован дополнительный сайт связывания YbtA RS3 в дивергентно транскрибируемом промоторе ybtA/ігрб. На основании экспериментов с репортерными плазмидами было установлено, что повтор RS3 играет ключевую роль в репрессии промотора уЫА. Сравнивая ybtA/ігрб промоторы Y. enterocolitica и Y. pest is, было обнаружено, что 125 нуклеотидная вставка ERIC-элемента в RS2 последовательности промотора Y. enterocolitica ybtA/ігрб увеличивает экспрессию уЫА. Кроме того, было продемонстрировано существование возможных дополнительных регуляторных механизмов, универсальных для всех промоторов системы утилизации йерси н иабакти на.
Утилизация железа в бактериях рода Yersinia
Ранее известный как Pasteurella, данный род получил в 1964 своё сегодняшнее название Yersinia по фамилии первооткрывателя возбудителя чумы А. Иерсина. Род Yersinia является членом семейства Enterobacteriaceae (Frederiksen, 1964). В настоящее время известны 11 различных видов. 3 из них имеют медицинское значение (Brenner, 1979): Y. pestis является возбудителем чумы, a Y. enterocolitica и Y. Pseudotuberculosis -распространённые энтеропатогены (Кпарр, 1988). Их температурный оптимум - 28С, однако они могут размножатся также при 4С. Y. pestis неподвижны, в то время как энтеропатогенные йерсинии при 28С (но не при 37С) способны к передвижению. Род Yersinia можно разделить на непатогенную группу и 2 группы различной патогенности относительно вирулентности для мышей (Brubaker, 1991; Perry and Fetherston, 1997). Y. pestis, так же как и Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica биогруппы 1 В принадлежат к высокопатогенной летальной для мышей группе; слабопатогенную, нелетальную для мышей группу составляют Y. enterocolitica биогрупп 2-5. В противоположность непатогенной группе (например, Y. enterocolitica биогруппы 1 А) как слабо, так и высокопатогенные йерсинии обладают 70 - т.п.о. плазмидой вирулентности (pYV). Так как вирулентный для мышей фенотип не может переноситься передачей плазмиды вирулентности от высокопатогенных к непатогенным йерсиниям, предполагалось, что существуют хромосомные гены, ответственные за формирование высокопатогенного фенотипа (Heesemann et al., 1983). Такие гены были вскоре идентифицированы: только члены высокопатогенной группы содержат кластер генов, обеспечивающих систему синтеза сидерофора йерсиниабактина и его утилизации (Brubaker, 1991; Carter, 1975; Perry et al, 1997). Этот кластер был назван Островом патогенности (High Pathogenicity Island, HPI), (Carniel et al., 1996; Gehring et al., 1998; Rakin et al, 1999b). Y. enterocolitica может использовать как собственный (эндогенный) сидерофор, так и экзогенные сидерофоры, произведенные другими организмами. (Табл. 1). Кроме того, йерсинии могут утилизировать гемин (Stojiljkovic et al, 1992; Stojiljkovic et al, 1994a).
Захват осуществляется, как и в случае других грамм - отрицательных бактерий, ТопВ - зависимыми специфическими рецепторами на внешней мембране. Так же недавно описана ТопВ сидерофор - независимая система утилизации Yfu (Yersiniae ferric uptake) для Y. enterocolitica (Saken et al, 2000). Различные системы утилизации железа в Y. enterocolitica представлены ниже: Бактерии синтезируют цитоплазматические железосвязывающие белки. Так, геном Y. pestis содержит гены бактериоферритина (bfrA), ассоциированного с бактериоферритином ферридоксина (bfd) и ферритина A iftnA) (Parkhill et al, 2001; Deng et al, 2002). Однако в настоящее время точно не известно, выполняют ли эти белки функцию храпения железа. Обнаруженные цитоплазматические железосодержащие высокомолекулярные комплексы, агрегаты 19-килодальтонного белка, могут состоять как из BfrA, так и из FtnA. HemS/HmuS, как и ShuS из бактерий рода Shigella, могут нейтрализовать токсичность поглощаемого гемма за счет связывания с ним (Stojiljkovic et al, 2002; Stojiljkovic et al., 1994b). 2.6. Железо как регулятор. В грамотрицательных бактериях регулятор экспрессии Fur репрессирует экспрессию многих генов, включая и системы утилизации железа. В условиях избытка железа, комплекс Fur и Fe + связывается со специфическим сайтом связывания (FBS, Fur binding site) в регулируемых промоторах и ограничивает их транскрипцию (Escolar et al., 1999; Hantke, 1981). При дефиците железа свободный Fur не является репрессором (Hantke, 2001). Мутации в гене fur ведут к неспособности бактерий расти в условиях избытка железа. Возможно это объясняется избыточной экспрессией компонентов железотранспортных систем и накопления токсичных количеств железа (Staggs et al, 1994). В геноме Y. pestis было обнаружено как минимум 38 репрессируемых и 6 активируемых железом генов. Большинство из них регулируется через Fur. Fur из Y. pestis, Е. coli и других энтеробактерий характеризуются очень высокой гомологией нуклеотидной последовательности (Staggs et al, 1991; Staggs et al, 1992; Staggs et al, 1994). В Y. pestis Fur репрессирует практически все системы утилизации железа (Carniel et al, 1992; Gong et al, 2001; Heesemann et al, 1993; Saken et al, 2000). В случае промотора yfeA-D был обнаружен уникальный нехарактерный для энтеробактерий случай Fur-зависимой репрессии этого промотора марганцем Лі (МгГ) (Bearden et al, 1998; Perry et al, 2003). Это может объясняться как особыми свойствами Fur из Y. pestis, так и особенностями промотора. Синтез сидерофора в патогенных йерсиниях постулировался уже в 1975 (Wake et al, 1975). С помощью индикаторного агара (CAS-Agar) позднее было показано, что только высокопатогенные штаммы Y. enterocolitica производят сидерофор йерсиниабактин (Yersiniabaktin, Ybt) (Heesemann et al, 1987). В 1995 йерсиниабактин был очищен из культуры Y. enterocolitica и была определена его структурная формула, напоминающая структуру пиохелина (Pyochelin) из Pseudomonas aeruginosa (Drechsel Н, 1995). Оба сидерофора обладают фенолятным и тиазольными циклами: двумя (пиохелин) и тремя (йерсиниабактин) соответственно (рис.2). Молекулярная масса йерсиниабактина - 482 дальтон, он обладает значительным сродством к железу, константа диссоциации комплекса Fe-Ybt порядка 1036. Он имеет слегка желтый цвет; в спектре поглощения можно выделить 3 широких пика, 210, 260 и 320 нм (Haag et al, 1993). Ybt флуоресцирует в этиловом спирте, в водных растворах его флуоресценция очень незначительна; максимум возбуждения - 270 нм, максимум излучения - 428 нм. Комплекс йерсиниабактина с железом слабоокрашен и по спектру поглощения отличается от чистого Ybt дополнительным небольшим пиком на 400 нм и неспособностью к флуоресценции. Ybt, кроме Fe , так же способен образовывать комплекс с Al3+(Chambers et al, 1996). Первоначально было обнаружено, что синтезирующиеся в железодефицитных условиях белки HMWP1 и HMWP2 (High Molecular Weight Proteins; 240 kDa и 190 kDa соответственно), а также белок внешней мембраны Irp65 (Iron-Repressible Protein, 65 kDa) находятся только в высокопатогенных, вирулентных для мышей йерсиниях.
Также было выяснено, что эти белки критичны для вирулентности (Carniel et al, 1987; Carniel et al, 1992; Heesemann et al, 1993). Далее было показано, что в случае 1гр65 речь идет о рецепторе FyuA (Ferric Yersiniabactin Uptake) для Ybt и бактериоцина Y. pestis пестицина (Rakin et al, 1994). Позже было доказано, что HMWPl и HMWP2 участвуют в синтезе йерсиниабактина (Bearden et al, 1997; Pelludat et al, 1998). Гены для HMWPl (irpl) и HMWP2 (irp2) и также гены рецептораfyuA лежат в хромосомной области, отличающейся от остального генома более высоким соотношением G+C (57.5% против 46-48%), которая обозначается как "High Pathogenicity Island" (HPI) и имеется в наличии только в высокопатогенных йерсиниях (Carniel et al, 1996; Rakin et al, 1999a). В настоящее время весь HPI отсиквенирован и установлено, что он состоит из ядра (коровой части, "core") и АТ-богатой части (Rakin et al, 1999а). В то время как коровая часть консервативна во всех высокопатогенных йерсиниях (98% сходства последовательности ДНК), на основе переменной AT - богатой части можно различать 2 эволюционных линии: Yen-HPI (43,3 т.п.о.) в Y. enterocolitica IB и Yps-HPI (36,1 т.п.о.) в Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (Rakin et al, 1995). Единственное значительное различие между ними в ядерной части - это ERIC-элемент, (Hulton et al, 1991) -который в Yen-HPI находится в регионе промотора ybt А, но отсутствует в Yps-HPI (Rakin et al, 1999a) (рис. 3). Ядро охватывает 11 генов, которые кодируют йерсиниабактиновую систему (биосинтез, транспорт и регуляцию экспрессии): ген АгаС-подобного транскрибционного регулятора YbtA (Bearden et al, 1997; Buchrieser et al, 1999; Pelludat et al., 1998), ген рецептора йерсиниабактина FyuA (также называемый Psn для Y. pestis), гены биосинтеза сидерофора irpl-5 {irpl, irp2, ybtU, ybtT и ybtE в Y. pestis), которые сгруппированы в один большой оперон размером 19 т.п.о. (Bearden et al., 1997; Gehring et al, 1998; Pelludat et al, 1998) и полицистронный оперон генов ігрб-9, кодирующий белки Ігрб и 7, которые вовлечены в транспортировку Fe—Ybt комплекса через цитоплазматическую мембрану (YbtP и YbtQ для Y.pestis) (Fetherston et al, 1999), Irp9 (YbtS), который осуществляет синтез эфира салициловой кислоты (Pelludat et al, 2003; Kerbarh et al, 2005), предшественника Ybt, и Irp8 (YbtX) функция которого до сих пор не определена, но показано, что он имеет сходство с белком AmpG из Е. coli, который предположительно является пермеазой и задействован в переработке муреиновых компонентов клеточной стенки. (Lindquist et al, 1993).
Бактерии, плазмиды и п рай меры
Бактериальные штаммы, используемые в данной работе, внесены в список в Таблице 1. Все штаммы Yersinia были выращены на твердой, либо в жидкой среде Luria-Bertani (LB), содержащей 50 мкг/мл налидиксина при 28С. В зависимости от индивидуальной устойчивости, так же добавлялось 100 мкг/мл стрептомицина, 50 мкг/мл хлорамфеникола, и 50 мкг/мл канамицина. Для имитации железодефицитных условий роста в организме хозяина, бактерии были выращены в среде LBD (LB с добавлением 300 мкМ ецх -дипиридила (Sigma) (Pickett et al, 1981)) при 37C. Для оценки транскрипционного эффекта йерсиниабактина, бактерии выращивались в LBDY среде (LBD с добавлением 2.4 мкМ очищенного Ybt). Е. coli BL21-CodonPIus (DE3) (Stratagene), использованный для производства YbtA, был выращен в среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 30 мкг/мл хлорамфеникола, при 37С. 4.2. Трансформация клеток. Отмытые в дистиллированой воде и разведенные в 10% водном растворе глицерина клетки трансформировались с помощью электропоратора Gene-Pulser 11/Pulse Controller II (Bio-Rad) при напряжении 2500 В. Для длительного хранения бактерии замораживались при -80С в среде LB с 10% глицерина. 5. Использованные стандартные молекулярно—биологические и биохимические методы. 5.1. Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР). При ПЦР амплификации ДНК использовались термостабильные Taq и Pwo полимеразы (Roche). Подбор праймеров с учетом температуры отжига осуществлялся в программе Vector NTI Suite 7. Амплификация проводилась в стандартных условиях в течение 30 циклов. 5.2. Выделение и очистка ДНК. 5.2.1. Выделение хромосомальной ДНК. Изоляция хромосомальной ДНК в количествах до 100 мкг производилась с помощью Qiagen Genomicip 100/G (Qiagen, согласно инструкции производителя.
Все необходимые буфера и растворы поставлялись производителем. 5.2.2. Выделение плазмид. Изоляция плазмидной ДНК в количествах до 1 мкг производилась с помощью QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), согласно инструкции производителя. Все необходимые буфера и растворы поставлялись производителем. При необходимости плазм иды вьщелялись из агарозного геля с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). 5.2.3. Выделение ПЦР-фрагментов. ПЦР-фрагменты в количествах до 1 мкг очищались при помощи QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) согласно инструкции производителя. РНК экстрагировалась тризольным методом из культур клеток Y. enterocolitica WA-CS несущих плазмиды pPybtAYen-GFP, pPybtAYps-GFP, pPirp6Yen-GFP и pPirp2-GFP, которые культивировались в течение ночи в среде LBD. Клетки осаждались центрифугированием (14000g, 3 мин) приблизительно из 10 мл культуры. Затем они размешивались в 1 мл тризола и полученная суспензия инкубировалась при 50С до просветления. После осаждения нерастворившегося материала (14000g, 20 мин) к раствору добавлялось 0.3 мл хлороформа с последующим интенсивным перемешиванием. Смесь отстаивалась 20 минут при комнатной температуре и разделялась на фазы центрифугированием (14000g, 10 мин). Водная РНК-содержащая фаза собиралась и РНК осаждалась добавлением изопропанола (0.5 мл изопропанола на 1 мл раствора). Осадок отмывался в 75% этаноле и растворялся в воде (RNase Free Water (Gibco)). 5.3.2. Реакция удлинения праймера. Для реакции удлинения праймера реакция обратной транскрипции была проведена с помощью кита Superscript III (Invitrogen), следуя инструкциям производителя с FAM-меченым обратным праймером GFPpr_ext_FAM (Табл. 3). Электрофорез и определение размера продуктов проводилось с помощью сиквенатора ABI 377 DNA sequencer (ABI Prism, Perkin-Elmer) и прилагающегося программного обеспечения. 5.4. Измерение концентрации белков и нуклеиновых кислот. 5.4.1. Измерение концентрации ДНК и РНК. Концентрация ДНК и РНК измерялась спектрофотометрическим методом. Пересчет оптической плотности на концентрацию производился по формуле: (OD260-OD32o) k где коэффициент к - 50 мкг/мл для ДНК и 40 мкг/мл для РНК. Концентрация белка так же определялась спектрофотометрически по формуле: OD280 k где к - коэффициент поглощения, рассчитываемый по аминокислотному составу белка (к(УЫА) = 1.37мг/мл). 5.5. Энзиматическая модификация ДНК. 5.5.1. Сайт-специфическая рестрикция. Рестрикция проводилась в буферах, поставляемых вместе с ферментами согласно прилагающейся инструкции производителя. Комплиментарные липкие или тупые концы ДНК ковалентно связывались Т4 ДНК лигазой. В работе использовался фермент и реакционный буфер фирмы New England Biolabs. При конструировании плазмид соотношение количества вставки и вектора было 3:1. Лигирование осуществлялось в течение 2-12 часов при 16С. 5.6. Электрофоретический анализ ДНК и белков. 5.6.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле.
Анализ размеров плазмид, продуктов ПЦР-амплификации и результатов рестрикции производился с использованием электрофореза в 0.7% агарозном геле в буфере ТАЕ при напряжении 100В. ТАЕ: Трис-ацетатный буфер, lx рН = 7.6: Tris-acetate -40мМ EDTA - 1мМ Прокрашивание ДНК в геле проводилось в растворе (1мг/л) интеркалирующего флуорофора бромистого этидия, флуоресценция полос ДНК детектировалась при облучении ультрафиолетом на трансилюминаторе Gel Doc EQ (Bio-Rad). Электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях проводилось по стандартной методике в 10% полиакриламидном геле. После электрофореза гель фиксировался и прокрашивался в кипящем растворе для прокрашивания. Раствор для прокрашивания: Coomassie Brilliant Blue R-250 1.5 г Изопропанол 455 мл Уксусная кислота 80 мл Н20до 1000 мл Отмывка геля проводилась его кипячением в воде с кусочками бумаги. 6. Конструирование экспрессионной плазмиды рЕТЗс - YbtA. Для производства и очистки YbtA в Е. coli использовалась плазмида рЕТЗс-YbtA (табл. 5). Последовательность уЫА была амплифицирована с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК Y. enterocolitica и праймеров YbtA_NdeI и YbtA_BamHI (табл. 4). Очищенный ПЦР продукт (PCR-purification kit, Qiagene), был порезан с образованием липких концов рестриктазами ВатШ и Ndel (MBI Fermentas, New England Biolabs). После разделения в агарозном геле в буфере ТАЕ и очистки, уЫА был лигирован с помощью Т4 лигазы (New England BioLabs) в экспрессионный вектор рЕТЗс, разрезанный в тех же сайтах рестрикции (рис. 7).
Конструирование репортерных плазмид для изучения экспрессии YbtA - контролируемых генов и реакции удлинения праймера
Йерсиниабактин был экстрагирован из культуральной жидкости равным объемом этилацетата при комнатной температуре в течение 2 часов. Экстракт был высушен с помощью эвапоратора WB2000 (Heidolph), повторно растворен в этаноле, и Ybt был очищен гидрофобной хроматографией на колонке С2/С18 (Amersham) с градиентом 0.1% TFA в Н20 - 0.1% TFA в ацетонитриле при скорости протока 10 мл/см2 мин и давлении 30 МПа. 10.2. Анализ йерсиниабактина. Присутствие Ybt в собранных фракциях и его биологическая активность были доказаны GFP - репортерным анализом, с использованием штамма WA-CS /гр/::Кап (pPfyuAYen-GFP) (Brem et al., 2001; Pelludat et ah, 1998), экспрессия GFP в котором иннициируется только в присутствии в среде йерсиниабактина. Клетки при этом инкубировались в 1 мл LBD с добавлением 1 мкл анализируемых образцов в течении 18 часов. Ybt-содержащие фракции были высушены вакуумной сушкой и растворены в этаноле. Концентрация была определена измерением OD255 (lg є 3,72) (Drechsel Н, 1995). Чистота полученного Ybt была проанализирована сравнением его спектров поглощения и флуоресценции с предварительно описанными (Chambers et at, 1996; Haage/a/.,1993). 11. Анализ изменения электрофоретической подвижности (EMSA, Гель-итфт). Связывание YbtA с промоторами HPI было оценено изменением электрофоретической подвижности фрагментов ДНК, наработанных ПЦР. 0.1 пикомоль фрагмента было проинкубировано с различными количествами свежеприготовленного YbtA (1-0 пикомоль), в 10 мкл буфера для связывания. Чтобы исследовать влияние Ybt и Ybt-Fe комплекса на связывание YbtA с ДНК, они были добавлены в количестве 2.4 наномоль. Для конкурентного связывания, использованного при оценке влияния каждого сайта связывания в отдельности, в реакционную смесь добавлялось 0.5 пикомоль немеченых делетированых и неделетированых вариантов промотора в качестве специфического конкурента. Для детекции возможного связывания комплекса в реакционную смесь добавлялся 50 фемтамоль Fe59. После 0.5 часовой инкубации при комнатной температуре образцы были нанесены на 5% акриламид: бисакриламидный (29:1) гель в 0.5х ТАЕ буфере с 0.01 % (m/v) саркозила натрия и разгонялись при напряжении 10 В/см. Гели были сфотографированы лазерным сканером FLA-3000 (FujiFilm). Для детекции Fe59 гель высушивался на Gel Dryer 583 (BioRad) и сканировался на Phosphoimager SI (Molecular Dynamics). Буфер для связывания: 20 мМ Трис-HCl, рН 8.0 1 MMDTT 0.01 % (m/v) саркозила натрия, 30 мМ KCI 100 нг/мкл Poly (d(I-C)).
Концентрация саркозила натрия (0.01 %), используемая при этих экспериментах была значительно ниже, чем его критическая концентрация мицеллообразования (14.4 мМ или 0.42 %), что даёт уверенность, что йерсиниабактин не был захвачен мицеллами детергента, что могло бы затронуть возможное взаимодействие YbtA и йерсиниабактина. 12. Определение флуоресценции CFP при репортерном анализе. Для определения GFP флюоресценции отдельных бактериальных ячеек использовался проточный цитометр Beckman Coulter EPICS XL-MCL, оборудованный аргоновым лазером. Клетки Y. enterocolitica WA-CS и WA-CS /г/?/:: Кап, содержащие репортерные плазмиды с gfp геном под fyuA, irp2, уЫА и ігрб промотерами Y. enterocolitica и Y. pestis (pPirp2-GFP, pPybtAYen-GFP, pPirp6Yen-GFP, pPybtAYps-GFP и pPirp6YpS-GFP), взятые из ночной культуры, выращивались при различных условиях (LB, LBD и LBDY среды) в течение 4 часов в случае LB и 18 часов в случае LBD и LBDY при 37С. Затем клетки были растворены в PBS, и флуоресценция синтезированного в них GFP измерялась согласно опубликованным описаниям (Pelludat et al, 1998; Russo-Marie et alt 1993). В качестве оцениваемой величины бралась средняя интенсивность флюоресценции GFP. Данные флюоресценции и рассеивания были собраны для 10 000 событий. Эксперименты были выполнены 3-4 раза. 13. DNase І футпрннтинг. 0.1 пикомоль FAM - меченой ДНК добавлялось к различным количествам свежеприготовленного белка (2-0 пикомоль), растворенного в реакционном буфере и инкубировалось в течении 20 при комнатной температуре в реакционном объеме 10 мкл. Чтобы исследовать влияние Ybt и Ybt-Fe комплекса связывание YbtA с ДНК, они были добавлены в количестве 4.8 наномоль. Затем добавлялось 5 MU дезоксирибонуклеазы I (Roche) и реакция останавливалась после 3 минут добавлением равного объема фенола и интенсивного перемешивания. Электрофорез и визуализация геля были выполнены с использованием сиквенатора ABI 377 DNA sequencer (ABI Prism, Perkin-Elmer). Реакционный буфер: 20 мМ Трис - НС1, рН 8.0 5 мМ MgCI2 0,01 % (m/v) саркозила натрия 14. Выравнивание защищенных областей. Для выравнивания защищенных областей и обнаружения консенсусных последовательностей использовалась программа DNAman 5.0 (Lynnon BioSoft). 1.1. Точки начала транскрипции YbtA-зависимых промоторов HPI. Чтобы определить точку начала транскрипции YbtA-регулируемых промоторов, мы использовали реакцию удлинения праймера. Полная клеточная РНК была изолирована из Y. enterocolitica WA-CS, несущей плазмиды pPybtAYen-GFP, pPybtAYps-GFP, pPirp6Yen-GFP, и pPIrp2-GFP (табл. 5), которые были выращены при железодефицитных условиях (среда LBD). FAM - меченый праймер GFPpr_ext_FAM (табл. 4) использовавшийся для определения начала транскрипции, был комплиментарен к последовательности гена ф (рис. 11): РНК, изолированная из Y. enterocolitica WA-CS (pPfyuA-GFP), содержащей ген gfp под контролем fyuA промотора с предварительно определённой точкой начала транскрипции (Rakin et al, 1994), использовалась как контроль. Для промотора уЫА была идентифицирована наиболее вероятная точка начала транскрипции - аденин, расположенный в точке -199 пар оснований в случае Y. enterocolitica, и точке -74 пар оснований случае Y. pestis относительно сайта начала трансляции уЫА. Различие между Y. enterocolitica и Y. pestis объясняется отсутствием ERIC-элемента, который является частью первичного транскрипта уЫА в Y. enterocolitica. Точка начала транскрипции для промотора ігрб была обнаружена в точке -71 пар оснований, и для ігр2 - в точке -53 пар оснований вверх по отношению к кодону начала трансляции (ATG) этих генов (рис. 12). 1.2. -10 и -35 последовательности YbtA-зависимых промоторов HPI. Для каждого промотора были определены -10 и -35 консенсусные последовательности и все промоторы на основании гомологии последовательности были определены как о70 - зависимые, несмотря на довольно значительные отклонения от консенсусной последовательности сильных о70 зависимых промоторов:
ERIC-элемент промоторов ігрб и ybtA Y. enterocolitica
При определении точек начала транскрипции было показано, что ERIC-элемент, характерный для дивергентных промоторов уЫА и ігрб Y. enterocolitica, входит в состав РНК-транскрипта уЫА (рис. 12). При сравнении соответствующих промоторов Y. enterocolitica и Y. pestis видно, что вставка ERIC-элемента затрагивает последовательность RS2, которая, как было доказано, является участком связывания YbtA. Эти факты позволяют предположить, что ERIC-элемент может оказывать двойное влияние на транскрипцию: с одной стороны, изменяя стабильность РНК-транскрипта, и с другой, изменяя силу взаимодействий YbtA и ДНК за счет нуклеотидных замен в YbtA-связывающей последовательности. Однако, несмотря на нуклеотидные замены, вставка ERIC-элемента, очевидно, не затрагивает общую консенсусную последовательность повтора RS2 (рис. 17). Таким образом, ERIC-элемент может и не иметь критического влияния на связывание YbtA с дивергентным промотором ybtA/ігрб, и, соответственно, не влиять на регуляцию промоторов уЫА и ігрб. Для проверки этих предположений были сравнены в различных условиях уровни транскрипции промоторов уЫА и ігрб Y. enterocolitica, которые имеют вставку ERIC-элемента, и Y. pestis, у которых вставка отсутствует. Для этого была измерена GFP флуоресценция клеток Y. enterocolitica WA-CS, трансформированных плазмидами pPybtAYen-GFP, pPybtAYps-GFP, рРігрбуеп-GFP, и pPirp6Yps-GFP и росших в средах LB, LBD и LBDY (рис. 24). Оба промотора уЫА, уЫА\еп и ybtA\ps вели себя схожим образом в ожидаемой манере, активизируясь при дефиците железа и снижая активность в присутствии Ybt, но всегда активность промотора уЫА\еп была значительно выше, чем у промотора ybtAvps (рис. 20). В противоположность этому, Ybt-активируемые промоторы ігрб\т и ігрбурз демонстрировали почти равную активность при тех же самых условиях роста. Очевидно, что разница в последовательностях промоторов Y, enterocolitica и Y. pestis затрагивала только промотор уЫА. ERIC-элемента (аналогично последовательности REP (Newbury et al, 1987)), чем уменьшением сродства YbtA к сайту связывания RS1/RS2 из-за замен в нуклеотидной последовательности RS2. Возможно, это является следствием того, что, как упоминалось ранее, вставки ERIC-элемента в транскриптах образуют петельные структуры, предотвращающие деградацию РНК.
Активация экспрессии gfp под промотором ігрб в среде LBDY позволяла быть уверенным, что репрессия промотора уЫА в LBDY среде не была результатом Fur-зависимой репрессии при насыщении клеток железом, так как и уЫА, и ігрб промоторы имеют общий сайт связывания Fur. 5. Функция сайтов связывания YbtA RSI, RS2 и RS3 в регуляции промоторов \ЫА и ігрб. Как видно из результатов футпринтинга и гель-шифта, характер связывания YbtA с дивергентным промотором ybtA/ігрб отличается от связывания с другими регулируемыми YbtA промоторами. В отличие от реакций с промоторами irp2 vijyuA, связывание YbtA с промотором ybtA/ігрб, благодаря присутствию дополнительного сайта связывания RS3, приводит к формированию приблизительно вдвое большей области протекции, а так же к образованию двойной смещённой полосы при гель-шифте. Структура защищенной области - а именно перекрытие стартов транскрипции и -10 регионов обеих промоторов - позволяет предположить, что дивергентно транскрибируемые промоторы уЫА и ігрб регулируются YbtA, по-видимому, комплексно и взаимозависимо. Своеобразие положения YbtA-связывающих последовательностей этих промоторов позволяет предположить уникальный механизм регуляции, не имеющий известных аналогов в семействе AraC/XilS. Ближайший гомолог YbtA, PchR (Fetherston et al, 1996; Heinrichs and Poole, 1993), который так же может действовать как репрессор (Poole et al., 2003), имеет абсолютно иное расположение связывающих участков относительно -10 и -35 последовательностей его промоторов-мишеней (Heinrichs et al., 1996). данные хорошо соответствуют данным выравнивания YbtA-связывающих последовательностей (рис. 15), согласно которым повтор RS2 значительно менее , соответствует консенсусной последовательности, чем RS1. Деления RS3 практически не уменьшала YbtA-связывающую способность промотора уЫАЛгрб. Таким образом, на основании результатов этих двух экспериментов можно сделать вывод о вспомогательной роли RS3, которая при отсутствии других связывающих YbtA последовательностей сама не способна на связывание. 5.2. Влияние делеций сайтов связывания YbtA на транскрипционную активность промоторов ігрб uybtA. Ранее уже сообщалось, что мутации в области повторов RS1 и RS2 приводят к снижению активности промотора psn (эквивалент промотора fyuA в Y. pestis) (Fetherston, Bearden, and Perry, 1996), где YbtA играет роль активатора транскрипции. Чтобы показать воздействие делеций на уровень транскрипции с промотора ybtA/ігрб и » его Ybt-зависимое регулирование, был выполнен репортерный анализ с клетками Y. enterocolitica WA-CS::Kan, несущими плазмиды PybtAYen-GFP, pPybtAYen-GFPARSl, pPybtAYe„- jFPaRS2, pPybtAYe„-GFPARSl-2, pPybtAYen-GFPARS3, pPirp6Yen-GFP, pPirp6Yen-GFPARSl, pPirp6Yen-GFPuRS2, PPirp6Yen-GFPuRSl-2 и pPirp6Yen-GFPARS3, содержащими ген gfp под контролем нативных промоторов уЫА или ігрб и промоторов с делециями соответствующих повторов (рис. 28): для промотора ігрб активация сохранялась в полной мере. Кроме того, если экспрессия с делетированного по повтору RS3 промотора уЫА в LB и LBD средах была несколько ниже чем у неделетированного варианта, то экспрессия с промотора ігрб при делеции сильно увеличивалась по сравнению с неделетированным вариантом в тех же условиях.
Эти данные позволяли предположить, что репрессия промоторами осуществляется не простой блокировкой транскрипции при связывании YbtA со специфическими сайтами, лежащими ниже сайта начала транскрипции, что одновременно приводит к активации дивергентного перекрывающегося промотора - как, к примеру, в случае регуляции дивергентных промоторов рецептором сАМР (CRP, сАМР receptor protein) (Hanamura et al, 1991) или IIvY (Rhee etal, 1998). Обсуждение. Представленные результаты позволяют заключить, что участие YbtA-связывающих последовательностей в формировании комплекса с промоторным регионом генов уЫА и ігрб неравноценно. Очевидно, что связывание YbtA преимущественно зависит от присутствия последовательности RS1, имеющей наибольшее сходство с консенсусной последовательностью YbtA-связывающих участков. Интересно, что делеции RS2 и RS3 имеют схожий эффект, проявляющийся в исчезновении верхней смещенной полосы, соответствующей "тяжелому" комплексу. уЫА и ігрб. Учитывая, что верхняя полоса зависит от присутствия RS3, ее исчезновение легко объяснимо при делеции этой последовательности. Схожий эффект делеции RS2 позволяет предположить, что RS3-3aBHCHMoe связывание дополнительных молекул YbtA возможно лишь в присутствии обеих RS1 и RS2, несмотря на минимальное участие RS2 в связывании. Хотя последовательности RS1 и RS2 имеют различное значение для связывания YbtA, они обе одинаково критичны не только для формирования комплекса с RS3, но и для активации промотора ігрб в присутствии йерсиниабактина. Возможно, связывание YbtA с обоими RS1 и RS2 приводит к локальному искривлению спирали ДНК, что в ряде случаев способствует связыванию RNAP (Gilbert, 1976), или увеличивает скорость формирования открытого комплекса (Parekh et al., 1996). Последовательность RS3, в отличие от RSI и RS2, хотя и имеет репрессирующий эффект, по-видимому, не критична для йерсиниабактин-зависимой регуляции промотора ігрб. Напротив, для регуляции промотора уЫА, присутствие всех RS одинаково важно, делеция любого из них ведёт к потере йерсиниабактин-зависимой репрессии. Поскольку активация экспрессии промотора ігрб (в отсутствии последовательности RS3) не приводила к репрессии промотора уЫА, был сделан вывод об отсутствии прямой связи между репрессией уЫА и активацией ігрб. Так же, это может быть свидетельством того, что связывание YbtA с последовательностями RS1 и RS2 in vivo носит динамический характер и не является жестким препятствием для транскрипции уЫА. Возможно, это связано с малым соответствием RS1 и RS2 консенсусной последовательности RS (77 и 69% нуклеотидов соответственно). Только RS3-зависимое связывание дополнительных молекул YbtA, которые перекрывают последовательности -10 и -35 промотора уЫА способно вызвать его репрессию. Связывание YbtA с RS3 так же закрывает от RNAP последовательность -10 промотора ігрб, что может снижать его активность.
