Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Современная классификация генов цитохрома Р450 18
1.2. Типы индукторов цитохрома Р450 18
1.3. Активность и индуцибельность цитохромов Р450 в онтогенезе 19
1.3.1. Общие аспекты развития монооксигеназной системы печени животных и человека 19
1.3.2. Развитие активностей цитохрома Р450 в эмбриональный период жизни 20
1.3.3. Развитие микросомных монооксигеназ печени у животных раннего неонатального периода 23
1.3.4. Регуляция активности CYP в эмбриональный и неонатальный периоды жизни 25
1.3.5. Множественные формы цитохрома Р450 в разные периоды развития. Неонатальный импринтинг 28
1.4.Тканеспецифичность индукции цитохромов Р450 34
1.5. Характеристика цитохромов Р450 подсемейства 1А 40
1.5.1. Индукция цитохрома Р450 1А1 41
1.5.2. Индукция цитохрома Р450 1А2 48
1.6. Активация генов подсемейства CYP2B барбитуратами и другими соединениями 52
І.б.І.Характеристика цитохромов подсемейства Р450 2В 52
1.6.2. Механизм индукции CYP2B барбитуратами 55
1.7. Генетический полиморфизм цитохромов Р450 и химический канцерогенез 66
1.7.1. Полиморфизм CYP человека 66
1.7.2. Межлинейные различия в активности цитохрома Р450 у лабораторных животных 70
1.8. Цитохром Р450 в метаболизме эндогенных соединений 72
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследований 77
2.1 Материалы 77
2.2. Плазмиды 78
2.3. Животные. 79
2.4. Обработка животных индукторами 79
2.5. Выделение микросом 80
2.6. Определение белка 80
2.7. Определение количества цитохромов Р450 и 65 81
2.8. Определение активности НАДФН-цитохролі Р450редуктазы 81
2.9. Определение каталитической активности форм CYP 82
2.9.1 Гидроксилирование БП 82
2.9.2. О-деалкилированиеэтоксирезоруфинов 82
2.9.3. N-деметилирование бензфетамина 83
2.9.4. Метаболизм алдрина 83
2.9.5. Метаболизм андростендиона 84
2.10. Иммунохимические методы 85
2.10.1.Получение антител 85
2.10.2. Ракетный иммуноэлектрофорез 85
2.10.3. Ингибирование метаболизма различных субстратов антителами 86
2.11. Получение очищенных препаратов цитохрома Р450. 86
2.12. Очистка НАДФН-цитохром Р450редуктазы 89
2.13. DcNa-гель электрофорез и иммуноблотинг белков микросом 90
2.14. Приготовление радиоактивных зондов 91
2.15. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции 92
2.16. Получение двухцепочечных фрагментов ДНК из олигонуклеотидов 92
2.17. Выделение суммарной РНК из клеток печени 92
2.18. Электрофорез РНК и ДНК 93
2.19. Гибридизация РНК 94
2.20. Полимеразная цепная реакция 95
2.21. Выделение белковых ядерных экстрактов 96
2.22. Анализ ДНК-белковых комплексов методом задержки ДНК в геле. 97
2.22.1. Инкубация олигонуклеотидов с белками ядерных экстрактов из печени крыс, индуцированных ксенобиотиками 97
2.24.1. Инкубация олигонуклеотидов с белками ядерных экстрактов из печени контрольных крыс при добавлении индукторов в условиях in vitro 98
2.23. Статистическая обработка результатов 98
ГЛАВА 3. Результаты исследований 99
3.1. Идентификация молекулярных форм цитохрома Р450, изолированных из печени крыс, индуцированных фенобарбиталом и 3-метилхолантрепом 99
3.2. Оценка каталитической активности множественных форм цитохрома Р450 в микросомах печени крыс по метаболизму андростендиона 106
3. 3. Активность цитохромов Р4501А и 2В в печени новорожденных крыс 114
3.3.1. Характеристика форм CYP, индуцированных в печени неонатальных крыс 116
3.3.2. Иммунохимическое определение индуцированных форм CYP 117
3.3.3. Метаболизм специфических субстратов МОС печени крыс раннего неонатального периода 119
3.3.4. Каталитическая активность индуцированных форм CYP у новорояеденных крыс 121
3.4. Иследование экспрессии генов цитохромов Р4501А в печени и легких крыс, индуцированных различными ксенобиотиками 125
3. 5. Характеристика CYPla печени мышей различных линий 132
3.6. Межлинейные различия в ферментативной активности CYP2B1 и экспрессии его гена в печени крыс при индукции фенобарбиталом и трифенилдиоксаном 136
3.7. Регуляция экспрессии гена CYP2B индукторами ФБ-типа 141
3.7.1. Исследование активности цитохрома Р4502В1 и экспрессии его гена при индукции ФБ и ТФД 141
3.7.2. Исследование взаимодействия позитивного и негативного цис-активных элементов гена CYP2B2 с ядерными белками печени крыс в разное время после введения им индукторов 144
3.7.3. Исследование взаимодействия позитивного и негативного цис-активных элементов гена CYP2B2 с ядерными белками печени крыс
при добавлении индукторов в системе in vitro 150
3.8. Альтернативный сплайсинг мРНК цитохрома Р450 2В2 в печени крыс 155
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 159
Заключение 179
Выводы 180
Список цитируемой литературы
- Общие аспекты развития монооксигеназной системы печени животных и человека
- Определение активности НАДФН-цитохролі Р450редуктазы
- Ингибирование метаболизма различных субстратов антителами
- Оценка каталитической активности множественных форм цитохрома Р450 в микросомах печени крыс по метаболизму андростендиона
Введение к работе
Быстрый научно-технический прогресс цивилизации приводит к возникновению серьезных проблем, связанных с загрязнением окружающей человека внешней среды. С развитием химической промышленности с каждым годом увеличивается число вредных факторов, влияющих на организм человека. К таким факторам прежде всего относятся пестициды, пищевые добавки, канцерогены, отходы производства и другие соединения химического происхождения. В связи с этим трудно переоценить значение ферментативных систем, обеспечивающих защиту от перечисленных выше факторов.
Было сформулировано и экспериментально обосновано представление о том, что в клетке функционирует система ферментов, окисляющая чужеродные соединения, названная микросомной монооксигеназной системой со смешанными функциями (Omura, Sato, 1964; Арчаков, 1975; Estabrook, 1979; Ляхович, Цырлов, 1981). Монооксигеназы не только превращают чужеродные соединения (ксенобиотики) в более полярные, легко удаляемые из организма, но и активно участвуют в обмене различных эндогенных соединений, таких как холестерин, простагландины, витамины, стероидные гормоны и др. Данные ферменты локализованы в эндоплазматическом ретикулуме клетки и при центрифугировании гомогенатов тканей выделяются с микросомальной фракцией.
Ферменты микросомной монооксигеназной системы окисляют субстраты при определенных условиях. Для этого необходимо, прежде всего, достаточное количество кофермента НАДФН и растворимого в воде кислорода. Включение молекулярного кислорода в органические субстраты катализируют ферменты типа оксидаз. По структуре микросомальные оксидазы представляют собой цепь переноса электронов с НАДФН на кислород. Работы многих авторов, в том числе эксперименты по фракционированию и реконструкции этой ферментной системы, позволили выделить 3 основных ее компонента -НАДФН-цитохром Р450 редуктаза, цитохром Р450 и липиды. Ферменты этой системы обладают широкой субстратной специфичностью. Среди реакций, в которых они принимают участие, гидроксилирование ароматического кольца углеводородов, N-, О- гидроксилирование и N-, О- и S-деалкилирование разнообразных субстратов, расщепление азосвязи аминоазосоединений и целый
ряд других биохимических превращений. Микросомные монооксигеназы участвуют также в метаболизме химических канцерогенов, что является инициирующим этапом в цепи превращений проканцерогена в активный канцероген (Pelkonen, Nebert, 1982).
Столь широкая субстратная специфичность ферментов микросомной
монооксигеназной системы обеспечивается функционированием
множественных форм цитохрома Р450 - терминального акцептора электронов этой системы (Porter, Coon, 1991). К настоящему времени известно более 400 различных форм этого гемопротеида, описанных для бактерий, растений и животных (Nelson et al., 1996). На основании генной структуры и аминокислотной последовательности цитохромы Р450 были разделены на семейства, которые обозначаются арабскими цифрами. В единое семейство попадают цитохромы Р450, гомология которых не менее 40%. При гомологии более, чем 70%, гемопротеиды входят в одно подсемейство, которое обозначается заглавными буквами латинского алфавита. И, наконец, внутри каждого подсемейства существуют отдельные члены, вновь обозначаемые арабскими цифрами. В качестве примера можно привести ферменты CYP1A1 и CYP1A2, индуцируемые ПАУ в печени многих млекопитающих (Океу, 1990). Таким образом, цитохромы Р450, представленные столь разнообразными ферментами, осуществляют в клетке огромное число метаболических превращений химических соединений как экзо-, так и эндогенного происхождения. Не будет преувеличением сказать, что регуляция их активности является важной составляющей в поддержании клеточного гомеостаза.
Активность внутриклеточного метаболизма химических соединений, а, следовательно, и судьба попавшего в клетку ксенобиотика, зависит от наличия или отсутствия той или иной формы цитохрома Р450. Эффективность метаболизма ксенобиотиков прежде всего определяется возможностью данных ферментов к индукции, т.е. увеличению количества фермента с усилением его каталитических способностей. Способность к индукции характерна для многих цитохромов Р450 (Denison, Whitlock, 1995). Химические соединения, обладающие свойством индуцировать различные формы цитохрома Р450, были разделены на несколько типов. Воздействие на экспериментальных животных фенобарбиталом характеризуется многократным увеличением содержания
цитохромов Р450 подсемейства 2В - CYP2B1 и CYP2B2 (Fonne, Meyer, 1987; Ryan, Lewin, 1990), тогда как многие ПАУ вызывают индукцию цитохромов Р450 1А1 и 1А2 (Соппеу, 1982; Poland, Knutson, 1982). И если первый окисляет ксенобиотики преимущественно по пути детоксификации, то второй в большинстве случаев осуществляет активацию многих канцерогенов в реактивные метаболиты, направляя тем самым метаболизм по пути токсификации (Phillips, 1983). В связи с этим очевидна важность проблемы изучения механизмов индукции ферментативных активностей этих цитохромов Р450, а также способов регуляции активностей. К настоящему времени внимание исследователей направлено на изучение механизмов индукции цитохромов Р4501А и Р4502В в печени экспериментальных животных. Доказано, что для активации гена CYP1A необходимо взаимодействие цитозольного белка - Ah-рецептора с ксенобиотиком, траслокация активированного комплекса в ядро с последующим его взаимодействием с ядерным фактором ARNT и, наконец, взаимодействие вновь образованного комплекса Ah-рецептор- ARNT с цис-активными элементами гена (Whitlock, 1999). О механизмах активации ФБ-индуцированных генов CYP2B известно меньше. Лишь в последние 2-3 года удалось идентифицировать CAR белок, принадлежащий к семейству орфановых рецепторов, который участвует в активации транскрипции генов CYP2B фенобарбиталом (Honkakoski et al., 1998). В регуляторной области этих генов найдены функционально значимые районы, с которыми связываются факторы транскрипции (Trottier ET AL., 1995). Однако, последовательность событий, приводящая к активации транскрипции гена, пока остается неизвестной. Таким образом, изучение механизмов индукции цитохромов Р450 является важнейшей составляющей в понимании регуляции активности этих ферментов.
Активность молекулярных форм цитохрома Р450 зависит не только от наличия индуктора, но и от типа ткани, где экспрессируются его гены (de Waziers et al., 1990). Главным органом, где осуществляется метаболизм практически всех ксенобиотиков, является печень. Именно в печени наиболее ярко проявляется эффект индукции цитохромов Р450, в том числе и CYP2B и СУР1А. Цитохромы Р450 других органов, в литературе известных как "экстрагепатические" Р450, также способны к индукции, хотя для них этот эффект выражен не столь ярко. Более того, картина индуцибельности
множественных форм в других, кроме печени, органах различается. Так, если в печени крыс регистрируется лишь конститутивная экспрессия CYP2B2, а при индукции ФБ появляются обе формы этого подсемейства - CYP2B1 и CYP2B2, то легких при индукции регистрируется только один фермент - CYP2B1 при полном отсутствии конститутивной экспрессии (Imaoka et al., 1989). Для цитохромов Р450 1А подсемейства также характерна тканеспецифичная экспрессия их генов: под воздействием ПАУ-индукторов в печени экспрессируются обе формы данного подсемейства, тогда как в легких активируется лишь CYP1A1 (Kiyohara et al., 1989).
Активность различных форм цитохрома Р450 зависит и от возраста. Для большинства млекопитающих характерна низкая активность цитохромов Р450 в эмбриональный период развития (Rich et al., 1997). Эта активность достигает уровня взрослых лишь через несколько недель постнатальной жизни. Индуцибельность микросомальных ферментов, в том числе цитохромов Р450, у эмбриональных и неонатальных экспериментальных животных резко снижена. И если эмбриональные цитохромы Р450, защищенные материнской плацентой, практически не индуцируются, то при воздействии на организм новорожденного различными ксенобиотиками наблюдается гетерогенность в индуцибельности многих монооксигеназ (Giachelli, Omiecinski, 1987). Выявленные качественные и количественные различия в их активности объясняются многими исследователями различной регуляцией множественных форм цитохрома Р450 на ранних этапах развития (Yang et al., 1988). Причины, вызывающие эти различия, во многом определяются формированием гормонального статуса организма и остаются до конца неисследованными.
Для окислительного метаболизма лекарств и других ксенобиотиков характерны генетические вариации как в популяции людей, так и грызунов. В последнее время проводятся исследования молекулярных основ такого полиморфизма. Значительный вклад в полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков вносят аллельные вариации структурной области генов CYP (Nebert et al., 1996). Зависимые от линии мышей вариации ответа на ПАУ-соединения связаны с полиморфизмом Ah-рецептора (Gielen et al., 1972), причем этот ответ влияет также на индуцибельность ферментов как 1-ой (CYP1A1, 1А2 и 1В1), так и 2-ой фаз метаболизма ксенобиотиков (Denison, Whitlock, 1995).
Таким образом, можно выделить основные факторы, влияющие на активность цитохромов Р450, способных также изменять и экспрессию их генов.
Феномен индуцибельности Р450: ксенобиотик-индуктор способен усилить активность той или иной формы цитохрома Р450.
Тканеспецифичность индукции цитохромов Р450.
Влияние возраста на активность ферментов.
Генетический полиморфизм в активности и индуцибельности цитохромов Р450.
Целью данной работы является исследование механизмов, регулирующих активность молекулярных форм CYP подсемейств 1А и 2В у крыс и мышей.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
Охарактеризовать цитохромы Р450 1А и 2В по субстратной специфичности. В связи с эти представляется необходимым выделить эти ферменты из микросомальной мембраны, определить их активность в метаболизме специфичных субстратов с использованием реконструированной мембранной системы. Для определения активности фермента в микросомальной фракции печени необходимо определить его количество. Одним из перспективных подходов количественного определения ферментов в печени является иммуноферментный анализ с применением моноклональных антител против исследуемых цитохромов Р450. С другой стороны, ингибируя их активность в микросомальной фракции антителами, можно достаточно уверенно судить о специфической активности изоформ цитохрома Р450.
Методами иммуноферментного анализа исследовать особенности функционирования МОС печени крыс в ранний неонатальный период развития, оценить активность и индуцибельность CYP1A и CYP2B
Исследовать специфичность действия ксенобиотиков на активацию CYP1A и 2В в различных органах крыс. Применение фенобарбитала и ПАУ-соединений (бенз[а]пирен, метилхолантрен, р-нафтофлавон, Арохлор 1254) в качестве индукторов монооксигеназ позволит оценить количественные аспекты индуцибельности генов CYP1A и 2В, играющей определяющую роль в
развитии токсического ответа клетки на эти соединения. Для решения этой проблемы предполагается использовать как методы определения специфической активности, так и определение уровня мРНК.
4. Изучить влияние индукторов ФБ-типа (фенобарбитал,
трифенилдиоксан) и смешанного типа (Арохлор 1254, пиридин) на активацию
генов цитохрома Р450 2В подсемейства. Использование методов биохимии
(специфические ферментативные реакции) и молекулярной биологии (методы
гибридизации нуклеиновых кислот, ПЦР анализ, метод задержки ДНК в геле)
позволит выявить некоторые аспекты механизма действия этих соединений на
клетку.
5. Выявить межлинейные вариации в активности цитохромов Р450
подсемейств
2В и 1А у крыс и мышей.
Научная новизна работы. Исследование цитохром Р450-содержащей микросомной монооксигеназной системы печени экспериментальных животных позволило сделать ряд новых заключений о механизмах регуляции активности и экспрессии генов СУР1А и СУР2В.
Проведена идентификация и дана характеристика основных ФБ- и МХ-индуцированных молекулярных форм цитохрома Р450 в печени крыс Вистар. Показано, что в печени новорожденных крыс активность СУР1А1 в метаболизме специфических субстратов более, чем в 10 раз, превышает таковую для взрослых, что можно рассматривать как особый механизм защиты от чужеродных соединений.
Впервые показано, что под действием индукторов смешанного типа в легких индуцируется СУР1А2, обычно экспрессируемый в печени. Увеличение активности этого фермента в печени и легких не коррелирует с увеличением уровня мРНК, что позволяет сделать вывод о посттранскрипционных механизмах его регуляции.
Для СУР2В2 доказано существование альтернативного варианта мРНК в печени, причем ее наличие не зависит от типа применяемых индукторов цитохрома Р450. Выявлены межлинейные различия в активности Cypla мышей, индуцированных канцерогенным о-аминоазотолуолом, что может быть важным фактором в развитии гепатоканцерогенного процесса, индуцированного этим соединением. Выявлены различия в способности к индукции фенобарбиталом и
трифенилдиоксаном у крыс различных линий, причиной которых могут быть изменения в экспрессии гена СУР2В.
Показана различающаяся динамика накопления мРНК в печени крыс при индукции фенобарбиталом и трифенилдиоксаном. Исследованы механизмы действия этих индукторов на экспрессию гена СУР2В2. Впервые показано, что взаимодействие негативного регуляторного элемента гена СУР2В2 с ядерными белками сопровождается сначала уменьшением, а затем усилением интенсивности его связывания с белками, что дает основание пересмотреть природу негативной регуляции данного гена. Установлено, что фенобарбитал инициирует образование трех, а трифенилдиоксан - пяти ДНК-белковых комплексов, что говорит в пользу существования специфично зависимых от индуктора путей инициации транскрипции СУР2В2 гена.
Научно-практическое значение работы. В данной работе представлен обобщающий материал по регуляции активности СУР1А и СУР2В форм цитохрома Р450, участвующих в метаболизме различных ксенобиотиков, включая канцерогены и лекарства. Это дает возможность оценить действие таких соединений на живые организмы, установить факторы риска развития токсических процессов, включая канцерогенез.
Разработаны методы оценки метаболизирующей способности печени экспериментальных животных, индуцированных различными ксенобиотиками. Такая стратегия может быть использовано для решения задач, связанных как с биомониторингом окружающей среды, так и с изучением процессов биоактивации и метаболизма чужеродных соединений.
Результаты, полученные при изучении индуктор-специфической активации генов СУР2В, позволяют прояснить механизмы активации генов у эукариот. Основные положения, которые выносятся на защиту:
1. Активность цитохрома Р450 зависит от возраста животных: у
новорожденных его содержание невелико, однако, каталитическая
активность некоторых его форм (CYP1A1) значительно выше, чем у
взрослых.
2. Экспрессия генов цитохромов Р450 подсемейств 1А и 2В зависит от типа
ткани. В печени крыс регистрируется их максимальная экспрессия, тогда
как в почках и легких уровень мРНК и активность ферментов существенно ниже.
Экспрессия генов СУР1А и СУР2В в печени крыс и мышей, подвергавшихся действию индукторов, зависит от линии экспериментальных животных.
В печени крыс, помимо мРНК для СУР2В1 и СУР2В2, независимо от типа применяемого индуктора, регистрируется альтернативно сплайсированный вариант мРНК.
Экспрессия генов CYPla и CYP2B в печени крыс регулируется типом индуктора и временем его действия.
Принятые сокращения:
АД - андростендион-3,17
АР-Арохлор 1254
БР - 7-бензилрезоруфин
БФ - бензфетамин
ГХБ - гексахлобензол
MP - 7-метоксирезоруфин
МРОД - 7-метоксирезоруфин-О-деметилаза
MX- 3-метилхолантрен
МОС - микросомная монооксигеназная система
НЭ - негативный элемент транскрипции гена цитохрома Р4502В.
ПАУ - полициклические ароматические углеводороды
ПР -7-пентоксирезоруфин
ПЭ - позитивный элемент транскрипции гена цитохрома Р4502В
CYP - цитохром Р450
ТФД - 1,3,5-трифенилдиоксан
ФБ - фенобарбитал
ЭПР - эндоплазматический ретикулум
ЭР - 7-этоксирезоруфин
ЭРОД - 7-этоксирезоруфин 0-деэтилаза
Общие аспекты развития монооксигеназной системы печени животных и человека
Эмбриональное развитие компонентов микросомальной электрон-транспортной цепи показало, что эмбрионы большинства животных имеют слабо развитый ЭПР, низкое содержание цитохрома Ь5 и цитохрома Р450 при полном отсутствии N-деметилазной активности (Dalner et al., 1965). В конце эмбрионального периода ЭПР гепатоцитов увеличивается в размерах и имеет преимущественно шероховатую поверхность (Ecobichon et al., 1978), после рождения его рост продолжается, но развивается главным образом гладкий ЭПР. Метаболическая активность микросомальной фракции развивается пропорционально увеличению гладкого ЭПР в клетке и резко увеличивается после рождения. Вопрос об индуцибельности цитохрома Р450 в печени плодов достаточно сложен. Как известно, на пути ксенобиотиков к плоду существует барьер - плацента. Многие из известных ксенобиотиков не проходят через этот барьер. Увеличение некоторых монооксигеназных активностей было зарегистрировано в печени эмбрионов после введения ПАУ-индукторов беременным самкам кроликов (Hart et al., 1982) и крыс (Welch et al., 1972). Как правило, эмбриональная активность стимулируется в тех случаях, когда индуктор вводится в конце беременности. Однако способность эмбриональной монооксигеназной системы отвечать на воздействие индукторов заметно снижена по сравнению с постнатальным периодом развития (Schlede, 1974). Крестейл и др. исследовали развитие некоторых цитохром Р450-зависимых реакций у эмбриональных (20- и 22-дневных плодов), новорожденных (12-часовых) и неонатальных (5-дневных) крыс (Crestail et al., 1979). Несмотря на то, что в печени эмбрионов регистрируется наличие цитохрома Р450 (0,05нмоль/мг), метаболизм анилина и / -нитроанизола не определяется. После рождения данные параметры резко увеличиваются и уже у 12-часовых новорожденных их уровень составляет третью часть активности взрослых особей. Введение фенобарбитала беременным самкам не повышает содержания цитохрома Р450 в печени плодов, в отличие от 3-метилхолантрена, который увеличивает содержание данного гемопротеида почти в два раза. При воздействии этих индукторов на 5-дневных крысят наблюдается значительное увеличение как содержания цитохрома Р450, так и его ферментативных активностей, что практически соответствует картине индукции взрослых. Низкую конститутивную активность цитохрома Р450 в печени эмбрионов крыс зарегистрировали и другие исследователи. Так, Гуетнер и Маннеринг, исследуя содержание цитохрома Р450 и НАДФН-цитохром Р450 редуктазы, а также аминопирин-, этилморфин-Ы-деметилазные и бензпирен-гидроксилазную активность, показали, что введение фенобарбитала не меняет эти параметры у эмбрионов, тогда как
3-метилхолантрен увеличивает как содержание цитохрома Р450, так и БП-гидроксилазную активность (Guenthner, Mannering, 1977). Следовательно, на ранних этапах развития крыс действие индукторов на активность монооксигеназ различно. Авторы предполагают существование у эмбрионов особого механизма регуляции активности цитохрома Р450, вероятно, связанного с гормональным статусом матери. Таким образом, как активность, так и индуцибельность монооксигеназных ферментов у эмбрионов экспериментальных животных существенно ниже, чем у неонатальных и взрослых особей. Попытка обнаружить CYP1A1 в печени эмбрионов мышей была неудачной (Day et al., 1989). Позднее, использование более чувствительного метода ПЦР позволило сделать вывод об экспрессии этих Р450 в печени эмбрионов грызунов и человека (Omiecinski et al., 1990). Экспрессия некоторых других форм CYP и соответствующие активности были зарегистрированы в тканях плода человека (Juchau et al., 1980). На более поздних стадиях эмбриогенеза были зарегистрированы такие CYP, как CYP3A7 и CYP3A5 (Komori et al., 1990). Сегодня наши знания о природе, функции и значении цитохромов Р450 во время органогенеза остаются неполными. Существуют доказательства того, что некоторые изоформы CYP экспрессируются исключительно у эмбрионов и отсутствуют у взрослых, позднее заменяясь на другие ферменты (Cresteil et al., 1986). Природа эмбриональных цитохромов Р450 человека изучена хуже. Ли с соавт., используя феноксозоловые эфиры в качестве субстратов CYP, показали, что на 50-ый-60-ый дни после зачатия, в таких органах эмбриона, как печень, почки, легкие, надпочечники и сердце, регистрируется активность изоформ CYP (Lee et al., 1991). Эксперименты по ингибированию активностей антителами позволили предположить незначительную роль охарактеризованных ранее цитохромов Р450: CYP 1А, 2В, 2С и ЗА. Этот факт дал основание сделать авторам вывод о существовании специфических форм CYP для этого периода жизни. Аутруп и др. исследовали трансплацентарный транспорт генотоксичных соединений измерением содержания аддуктов ПАУ с сывороточным альбумином крови матери и плода (Autrup et al., 1995). Наибольшее количество аддуктов обнаружено у курящих матерей, тогда как в крови плодов их концентрация существенно ниже, что свидетельствует о роли плаценты в защите от генотоксичных канцерогенов.
Определение активности НАДФН-цитохролі Р450редуктазы
Метаболизм БП проводился в соответствии с методом, разработанным в нашей лаборатории (Цырлов, Ляхович, 1979). Инкубационная смесь содержала 0,05М трис НС1, ЗмМ MgCb. В качестве стандарта использовался 3-ОН-БП. Концентрация белка в пробе - 10-15 мкг в 1 мл, субстрата - 1мМ, время реакции - 3 мин. Реакция останавливалась добавлением тритоновой смеси (10% тритон Х-100, 1% ЭДТА, 1М NaOH). Количество образовавшегося 3-ОН-БП определялось спектрофлуорометрически на "Hitachi-556". Для определения скорости метаболизма этого субстрата очищенными формами CYP была использована реконструированная система, разработанная Ли с соавт. (Lu et al., 1973), которая содержала 0,02 нмоль CYP1A1, 200 нмоль НАДФН-цитохром Р450 редуктазы и 0,01 мг фосфолипида дилаураилфосфатидилхолина в объеме 0,2 мл. После инкубации при 37 в течение 10 мин был добавлен 0,1М трис-HCl буфер рН 7,4, содержащий 3mM MgCfe. Далее метаболизм проводился как для микросом.
Скорость О-деалкилирования ряда алкоксирезоруфинов - ЭР, MP, ПР и БР определялась спектрофлуоромерически по методу Бурке и Майера (Burke, Mayer, 1973). В кювету объемом 0,6 мл добавлялось 0,4 мл 50 мМ HEPES буфера рН 7,4, содержащего 15 тМ MgC , 1тМ ЭДТА, 20-25 мкг микросомального белка, 1 мкМ субстрата. Образование продукта реакции - резоруфина - регистрировалось при длинах волн возбуждения 530 нм и эмиссии 585 нм на спектрофлуориметре Hitachi MPF-4 (Япония), снабженным самописцем Hitachi 0.56. В качестве стандарта для построения калибровочной кривой использовался резоруфин. Реконструированная система для определения этого метаболизма содержала 0,005 нмоль CYP1A1, 200 ед. редуктазы и 0,01 мг дилаураилфосфатидилхолина. После инкубации при комнатной температуре было добавлено 0,4 мл К-фосфатного буфера рН 7,4, и далее метаболизм проводился как для микросом.
Скорость N-деметилирования БФ определялась по образованию формальдегида (Nash, 1953). Инкубационная смесь содержала 0,1 М К-фосфатного буфера, содержащего ЗмМ MgC . Концентрация белка в пробе - 0,5 мг в 1 мл, субстрата -2мМ, время реакции - 5 мин. Реакция останавливалась добавлением 0,25 мл 50% раствора ТХУ. Смесь центрифугировалась при 7000 g в течение 15 мин. Далее к 0,7 мл супернатанта добавлялось 0,7 мл раствора Наша. Через 40 мин после инкубации при 37 окрашенный раствор формальдегида измерялся спектрофотометрически приА-=412 нм с использованием коэффициента экстинции 8 мМ]см"\ Реконструированная система содержала 0,1 нмоль CYP2B1, 700 нмоль НАДФН-цитохром Р450 редуктазы и 0,01 мг дилаураилфосфатидилхолина в объеме 0,2 мл. После инкубации при 37 в течение 10 мин был добавлен 1 мл 0,1М К-фосфатного буфера рН 7,4, содержащий 3mM MgCl2. Далее метаболизм проводился как для микросом.
Скорость эпоксидирования алдрина определялась согласно методу Вольф с соавт. по образованию диэлдрина, определенного методом газовой хроматографии (Wolff et al., 1980). Для этого был использован газовый хроматограф "Packard" с детектором электронного захвата. Для построения калибровочной кривой использовался диэлдрин. Инкубационная смесь - 0,1 М К-фосфатный буфер рН 7,4, содержащей 0,1 мМ MgCl2. Концентрация белка в пробе - 25 мкг в 1 мл, субстрата - мМ, время реакции - 5 мин. Реакция останавливалась добавлением 3 мл н-гексана. После экстракции в течение 10 мин Юмкл органической фазы было использовано для определения количества образовавшегося диэлдрина.
Скорость гидроксилирования АД определялась согласно методу Вуд с соавт. по образованию метаболитов: 7а-, 16а-, 6(3- и 18р-гидрокси-АД (Wood et al., 1983). Инкубационная смесь содержала 0,1 М К-фосфатного буфера, содержащего ЗмМ MgCb. Концентрация белка в пробе - 0,3-0, 5 мг в 1 мл, субстрата - 0,5мкМ, время реакции - 5 мин. В конце инкубации в каждую пробу добавлялся внутренний стандарт (кортикостерон) в концентрации ОДмкМ. Реакция останавливалась добавлением 6 мл хлористого метилена, после чего в течение 30 сек проводилась экстракция стероидов. Смесь центрифугировалась при 4000 g в течение 15 мин, после чего 4 мл органической фазы отбирались и летучая часть упаривалась под струей азота. Высушенные экстракты были растворены в 50 мкл метанола и анализированы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии под давлением. В качестве жидкой фазы был использован 45% раствор тетрагидрофурана в воде. Анализ метаболитов проводился и использованием жидкостного хроматографа фирмы "Beckman". Метаболиты были идентифицированы при длине волны 254 нм и определены количественно при сравнении их площади пика с площадью пика стандарта с использованием интегратора "Shimadzu CR-3A".
Ингибирование метаболизма различных субстратов антителами
Эта процедура проводилась по методу Дигнама и Штробела (Dignam, Strobel 1977) в сочетании с методом Ясукохи и Мастерса (Yasukochi, Masters 1976). 3-5 г микросомального белка из печени ФБ-индуцированных крыс суспендировалось в ОДМ трис-HCl, содержащем 30% глицерин, 1 мМ ЭДТА и 0,1 мМ ДТТ до конечной концентрации 10 мл/мл. После солюбилизации 10%о-м раствором детергента Ренекс 690 микросомы с конечной концентрацией детергента 1,4% центрифугировались 1 час при 105000g. Супернатант наносился на колонку с ДЭАЭ-сефадексом А-25 (5x55 см), предварительно уравновешенным буфером А (0,1 М трис-HCl рН 7,7), содержащем 20%) глицерин, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ ДТТ и 0,15% ренекса 690 со скоростью 150 мл/час. После нанесения солюбилизата колонку промывали 800 мл буфера "А". НАДФН-цитохром Р450 редуктаза элюировалась тремя литрами линейного градиента (0 - 0,4 М КС1 ) в уравновешивающем буфере "А" со скоростью 200 мл/час. Фракцию флавопротеида, элюированную при концентрации КС1 0,15 М, разбавляли равным объемом 20%-го глицерина и наносили на аффинную колонку с 2 ,5 -АДФ-сефарозой 4В (1,6x12 см), уравновешенную буфером "В" (10 мМ К-фосфатный буфер рН 7,7, содержащий 20%) глицерин, 1 мМ ЭДТА, 0,1% эмульген 911) со скоростью 20-40 мл/час. Колонку промывали 100 мл 150мМ К-фосфатного буфера рН 7,7, содержащего 20%о глицерина, 1 мМ ЭДТА, 0,1 % эмульгена 911 со скоростью 100 мл/час. Редуктаза элюировалась 0,7 мМ НАДФ в уравновешивающем буфере "В", затем освобождалась от детергента на гидроксилаапатите или амберлите ХАД-2, после чего диализовалась 2 раза в 20-ти объемах буфера "В" без детергента. Конечный препарат имел активность 18-22 ед на мг белка.
Белки микросом печени крыс, полученные методом дифференциального центрифугирования, разделяли с помощью градиентного электрофореза в полиакриламидном геле (7-15%) с додецилсульфатом Na по методу Лаэмли, приспособленному в пластинах (Laemmli, 1970). Электродный буфер - 0,025 М трис-НС1 рН 8,3, содержащий 0,195 М глицин и 0,1% DSNa. Для приготовления градиентного геля использовался 0,375 М трис-HCl рН 8,8, содержащий 0,1% DSNa. Исходный раствор содержал 30% акриламида и 0,8% И -бис-метиленбисакриламида. Полимеризация проходила при добавлении 0,025% ТЭМЭД и персульфата аммония. Для проведения электрофореза использовались приборы фирмы "Pharmacia Fine Chemicals" Толщина геля на пластинке - 0,7 мм, сила тока - 60 мА на пластину, время -2 часа. После окончания электрофореза гель фиксировался в растворе уксусная кислота : метанол : вода = 1: 1 : 8 в течение 30 мин, после чего окрашивался 0,4% раствором Кумасси в смеси уксусная кислота : метанол : вода = 1: 1 : 5 в течение 30 мин. Для отмывания пластин от краски использовалась 7% уксусная кислота.
Молекулярную массу микросомальных белков определяли по калибровочной кривой, используя в качестве стандартов белки фирмы "Serva": фосфорилаза В (м.м. 94000), альбумин (м.м.67000), овальбумин (м.м. 43000), карбоангидраза (м.м. 30000), ингибитор трипсина (м.м. 20100) и а-лактальбумин (м.м. 14400).
Для выявления молекулярных форм CYP с помощью белкового иммуноблота (Вестерн-блот анализ) белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и выявляли по Таубину и соавт., используя моноклональные антитела, полученные гибридомной технологией после иммунизации мышей CYP2B1 (клон 12С10). Данные моноклональные антитела реагируют с высокогомологичными CYP2B1 и CYP2B2. Для выявления CYP1A использовался клон 14Н5, способный распознавать CYP1A1 и CYP1A2.
Для проведения экспериментов по регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 использованы олигонуклеотиды, синтезированные ПО ТОО "Диол" при ВНИИМБ, п.Кольцово, НСО или в институте Биоорганической химии СОР АН. Для изучения экспрессии генов подсемейства CYP2B взяты следующие олигонуклеотиды: "Ь" - 5 - GGTTGGTAGCCGGTGTGA - 3 , комплементарный к мРНК CYP2B1; "е" - 5 - GGATGGTGGCCTGTGAGA -3 , комплементарный к мРНК CYP2B2.
Оценка каталитической активности множественных форм цитохрома Р450 в микросомах печени крыс по метаболизму андростендиона
Однако, наиболее адекватной характеристикой этой формы CYP может служить каталитическая активность в метаболизме АД. Это связано, прежде всего, с тем, что данная реакция является высокоспецифичной для CYP2B1, тогда как другие формы CYP окисляют этот стероид в 16а-положении. При исследовании изолированных ферментов лишь одна фракция ДЭАЭ-3 была активна в данной реакции. Цитохром Р450 из фракции ДЭАЭ-ГАП-4 с высокой степенью вероятности можно соотнести с CYP2B2, так как этот Р450 неактивен в метаболизме исследуемых субстратов. Кроме того, в реакциях двойной иммунодиффузии антитела против CYP2B1 реагировали с этим белком.
Среди цитохромов Р450, изолированных из МХ-печени, был выявлен цитохром Р450 1А1, активно метаболизирующий ЭР (фракция ДЭАЭ-4). Другая форма CYP, индуцируемая ПАУ-соединениями - CYP1A2, отличительной особенностью которой является ее высокоспиновое состояние (Ryan, Levin, 1990). Этим свойством обладал CYP фракции ДЭАЭ-1. Позднее было показано, что специфическим субстратом для этого фермента является MP. Следует заметить, что идентификация основных ФБ- и МХ-индуцированных форм CYP существенно облегчается не только наличием специфических субстратных реакций, но и благодаря другим параметрам -спектральным характеристикам, изменению относительного количественного содержания в микросомах. Гораздо сложнее обстоит дело с идентификацией так называемых конститутивных форм цитохрома Р450, присутствующих в печени интактных животных. При использовании классических индукторов микросомных монооксигеназ их содержание не меняется и лишь наличие специфических субстратных реакций позволяет выявить их среди других гемопротеидов. Известно, что CYP2C11, экспрессируемый лишь в печени самцов, окисляет АД в 16а-положении (Wood et al., 1983). При анализе цитохрома Р450 как МХ-, так и ФБ-микросом, во фракции 2 регистрируется АД-16а-гидроксилазная активность, причем его активность сопоставима с таковой, полученными другими исследователями. Цитохром Р4502А, также являющийся конститутивной формой, обладает ба-АД-гидроксилазной активностью (Ryan et al., 1984). Этой активностью обладал CYP из фракции ДЭАЭ-3-ГАП, полученной из МХ-микросом (табл.2). Невысокой выход этого фермента ( 0,1%) обусловлен малым содержанием его в печени. Таким образом, были получены
электрофоретически гомогенные формы цитохрома Р450: CYP2B1, CYP2B2, CYP1A1, CYP 2С11 и CYP2A1, идентифицированные по специфическим активностям. Для основных ФБ- и МХ-индуцированных CYP: CYP2B1 и CYP1A1 соответственно, были получены поли- и моноклональные антитела, использование которых позволяет оценить их количество в печени при различных экспериментальных условиях. Применение антител для ингибирования ферментативных реакций в микросомальной фракции печени,, позволит доказать участие определенной формы цитохрома Р450 в метаболизме выбранного субстрата.
Были проведены эксперименты по определению каталитической активности изолированных CYP с применением реконструированной системы. Эти данные представлены в табл.3.
Важно отметить, что соотношение концентраций CYP и НАДФН-цитохром Р450-редуктазы является существенным в определении скорости реакции. При условии, когда лимитирующим фактором является CYP, возможно исследование метаболизма субстратов цитохромом Р450. Как следует из приведенной таблицы, субстраты, используемые в данной работе, достаточно специфично окисляются исследуемыми формами CYP. Так, активность CYP2B1 в метаболизме БФ и АД превышала таковую для CYP1A1 в 70 и 50 раз соответственно. С другой стороны, CYP1А1 с большей скоростью окисляет БП и ЭР, в 12 и 70 раз соответственно.
Специфичность этих субстратов была подтверждена в экспериментах по ингибированию активностей антителами. AHTH-CYP2B почти полностью ингибировали метаболизм БФ и АД в ФБ-микросомах печени крыс, а анти-CYPlAl - окисление БП.
Использование реакций, селективно катализируемых одной формой CYP, представляет собой перспективный подход для определения как количества, так и активности исследуемого фермента. К настоящему времени известны такие реакции, как, например, О-деэтилирование ЭР, катализируемое CYP1A1, и О-деметилирование MP- CYP1A2 (Burke et al., 1994). К специфическим реакциям можно отнести гидроксилирование стероидов тестостерона и андростерона в различные положения молекулы. Эксперименты по изучению каталитической активности изолированных форм CYP показали, что CYP2A1 окисляет АД в 17а-положении, CYP2B2 - в 1бр-, CYP2C11 - в 16а-, a CYP3A1- в бр-положении молекулы стероида (Ryan et al., 1984; Waxman, 1988). Скорость гидроксилирования стероида по определенному положению может реально отражать каталитическую активность формы CYP.
