Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Микросомальная монооксигеназная система в метаболизме экзогенных и . _
эндогенных соединений
Цитохром Р450 - ключевой компонент микросомальной . „ монооксигеназной системы
Множественные формы цитохромов Р450 15
Феномен индукции цитохромов Р450 18
Индукторы цитохромов Р450 20
Молекулярные механизмы индукции цитохромов Р450 20
1.2. Характеристика цитохромов Р450 подсемейства 1А 23
Субстратная специфичность СYP1А1 иСУР1А2 26
Регуляция экспрессии гена цитохрома Р450 1А1 27
Индукция цитохрома Р450 1А1 полициклическими ароматическими ?_ углеводородами
Неклассические индукторы CYP1A1 32
Негативная регуляция CYP1A1 35
Регуляция экспрессии гена цитохрома Р450 1А2 37
Роль физиологических факторов в индукции CYP1А 40
Эндогенные индукторы СYP1А 40
Старение и стресс: влияние на регуляцию экспрессии CYP1А 43
1.2.5. Межлинейные различия в активности CYP1А у мышей 45
Заключение 47
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 48
Материалы 48
Животные 49
Методы исследования 49
Индукция CYP1А в микросомах печени мышей 49
Воздействие на животных иммобилизационным стрессом 49
Выделение микросом печени мышей 50
Определение концентрации белка в микросомах 50
Определение общего содержания цитохрома Р450 в микросомах печени 51
Вертикальный электрофорез белков в полиакриламидном геле в ,.. денатурирующих условиях
Полусухой электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану 51
Иммунохимический анализ белков микросом 52
Определение ферментативной активности CYP1A1 HCYP1A2 52
Получение препаратов суммарной РНК из клеток печени мышей 53
Электрофорез РНК в частично денатурирующих условиях 53
Определение концентрации РНК в образце 54
Реакция обратной транскрипции 54
Мультиплексная полимеразная цепная реакция (ПЦР) 55
Анализ продуктов ПЦР 56
Получение препаратов геномной ДНК 57
Секвенирование продуктов ПЦР 57
Статистическая обработка данных 58
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 59
3.1. Индукция CYP1A1 и CYP1A2 в печени инбредных линий мышей, _Q
обработанных 3-метилхолантреном (MX) и о-аминоазотолуолом (О AT)
Иммунохимический анализ микросомал ьных белков С YP1А1 и С YP1А2 59
Ферментативная активность CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей 61
Уровень экспрессии генов CYP1A1,CYP1A2, AhR и ARNT 63
Исследование экспрессии генов CYP1A1, CYP1A2, AhR и ARNT в ,« зависимости от времени после введения MX в качестве индуктора
Содержание мРНК цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени мышей 67
Содержание мРНК AhR и ARNT в печени мышей при индукции MX 69
Сравнительный анализ регуляторной последовательности гена CYP1A2 „. (от -4675 до -4204) у мышей инбредных линий
Влияние стресса на индукцию цитохрома Р4501А 74 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 78 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 92
ВЫВОДЫ 94
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 96
*
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Введение к работе
Цитохромы Р450 (CYP) подсемейства 1А окисляют многие канцерогены с образованием активных метаболитов, способных связываться с нуклеофильными сайтами макромолекул клетки, что может приводить к различным токсическим процессам, в том числе канцерогенезу (Pelkonen, Nebert, 1982; Nebert, McKinnon, 1994; Ioannides, Lewis, 2004). В свою очередь, канцерогенные соединения, особенно относящиеся к полициклическим ароматическим углеводородам (ПАУ), вызывают индукцию этих CYP, что сопровождается многократным увеличением, как уровня их мРНК, так и ферментативных активностей (Nebert, 1994; Cheung et al, 1994; Shimada, 2006). Токсический эффект от канцерогена, попавшего в живой организм, определяется количеством его активного метаболита, который может образоваться, и эффективностью его детоксификации, что напрямую зависит от уровня индуцируемой формы цитохрома Р450, активирующей канцероген. У большинства видов млекопитающих подсемейство 1А состоит из двух форм: CYP1A1 и CYP1A2. Цитохром Р450 1А (CYP1A) наиболее изучен у экспериментальных животных: крыс и мышей. CYP1A1 и CYP1A2 осуществляют биоактивацию многих прооксидантов и проканцерогенов: Р450 1А1 - бенз[д]пирена и других ПАУ, Р450 1А2 - ПАУ, ароматических аминов, нитрозоаминов, парацетамола, гетероциклических аминов (Nebert, 1994; Ioannides, Lewis, 2004).
Показано, что для активации генов CYP1A необходимо взаимодействие цитозольного белка - Ah-рецептора с ксенобиотиком, транслокация активированного комплекса в ядро с последующим его взаимодействием с ядерным фактором ARNT и, наконец, взаимодействие вновь образованного комплекса Ah-рецептор - ARNT с цис-активными элементами генов CYP1A (Whitlock, 1999; Nebert et al., 2004; Fujii-Kuriyama, 2005).
В окислительном метаболизме лекарств и других ксенобиотиков, как в популяции людей, так и грызунов, существенную роль играет полиморфизм генов CYP, в том числе CYP1A1 и CYP1A2 (Nebert et al., 2004; Daly, 2003). В последнее время проводятся интенсивные исследования в данной области. Впервые такие генетические различия показаны на инбредных линиях мышей.
Так, введение ПАУ мышам индуцибельных линий, обладающих генотипом Ah Ahb или AhbAh (Ah+ генотип), приводит к значительному увеличению активности CYP1A1 и CYP1A2, тогда как у мышей, обладающих генотипом AhdAhd (Ah- генотип), этого не наблюдается (Nebert, 1989). Инбредные линии мышей широко используются в качестве модели для изучения механизмов активации генов цитохрома Р450, а также процессов химического канцерогенеза. Показано, что такие мыши различаются по чувствительности к канцерогенному действию ПАУ, аминоазобензолов и других соединений (Gonzalez et al., 1993; Nebert et al., 2004; Каледин и др., 1990; Каледин и др., 1999; Захарова и др., 1998; Гуляева и др., 2000). Однако молекулярный механизм таких различий остается до конца не исследованным. Кроме того, выявлен и Ah-независимый механизм индукции цитохрома Р450 1А2 (Chaloupka et al., 1994; Nerurkar et al., 1993). Bee это говорит о более сложной картине регуляции экспрессии цитохрома Р450 1А в генетически различающихся линиях мышей, чем существующие на сегодняшний день представления, объясняющие это явление лишь различиями в генотипе Ah рецептора. В связи с этим представляется весьма актуальным исследование индукции цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в норме и при воздействии ксенобиотиков в печени мышей, различающихся по чувствительности к индуцирующему действию ПАУ-соединений.
Целью настоящей работы является исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 1А в печени мышей, различающихся по генотипу Ah рецептора, при индукции химическими канцерогенами и под влиянием физиологических факторов.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Определить содержание мРНК, наличие белка и ферментативную активность CYP1A1 и CYP1A2 в печени инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah рецептора при индукции 3-метилхолантреном и о-аминоазотолуолом;
Для выяснения роли транскрипционных факторов в регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А определить уровень экспрессии генов AhR и ARNT в печени инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah рецептора при индукции 3-метилхолантреном;
Провести сравнительный анализ регуляторной последовательности гена CYP1A2 (от -4675 до -4204), содержащей энхансерные модули, необходимые для конститутивной экспрессии гена CYP1A2, у инбредных линий мышей;
На модели иммобилизационного стресса исследовать влияние физиологических факторов на индукцию цитохрома Р4501А у молодых и старых животных.
Таким образом, использование генетической модели мышей с одновременным измерением таких параметров, как активность ферментов и экспрессия соответствующих генов, а также уровень экспрессии транскрипционных факторов, вовлеченных в индукцию, возможно, позволит выстроить последовательность молекулярных событий активации генов цитохрома Р450 1А для мышей с различным генотипом Ah-рецептора.
Научная новизна работы
Несмотря на то, что исследования механизмов индукции цитохромов Р450 подсемейства 1А и регуляции экспрессии их генов ведутся на протяжении многих лет, вопрос о том, как экспрессируются гены основных транскрипционных факторов AhR и ARNT, оставался нерешенным. В данной работе была впервые определена конститутивная экспрессия этих факторов в печени инбредных линий мышей, различающихся по чувствительности к индукции цитохрома Р4501А различными канцерогенными полициклическими углеводородами (ПАУ).
Впервые было проведено комплексное исследование экспрессии транскрипционных факторов AhR, ARNT и их генов-мишеней CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей различных инбредных линий при индукции 3-метилхолантреном. Впервые была измерена динамика накопления мРНК исследуемых генов и выявлен максимум ее синтеза в интервале 10-20 часов после воздействия индуктора. Показано, что в печени мышей, как чувствительных к индуцирующему действию ПАУ (Ah+ генотип), так и дефектных по этому рецептору линиях (Ah"), определяется существенное
8 количество мРНК CYP1A2, AhR, ARNT. Впервые показано наличие транскрипта гена CYP1A1 при индукции MX и О AT в печени линий SWR, AKR и DBA, ранее считавшихся нечувствительными к ПАУ-индукции линиями. Эти результаты свидетельствуют о более сложном механизме формирования чувствительности к индуцирующему действию ПАУ, чем это считалось ранее.
Наличие при индукции MX увеличения содержания мРНК CYP1A у всех линий, независимо от генотипа Ah рецептора, указывает на то, что межлинейные различия не связаны с дефектом Ah рецептора. Полученные данные позволяют предположить существование транскрипционных механизмов регуляции CYP1A у мышей Ah+ линий и CYP1A2 у линии SWR (Ah'), и посттранскрипционных - у мышей AKR и DBA (Ah').
В работе впервые показано влияние возраста и стресса на экспрессию генов CYP1A1, CYP1A2, AhR и ARNT. Содержание мРНК исследуемых генов, за исключением CYP1A1, различается между группами взрослых и старых животных. Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей заметно выше, чем в печени взрослых особей, в то время как содержание мРНК AhR у старых животных понижено по сравнению со взрослыми. Кроме того, под влиянием стресса увеличивается экспрессия генов CYP1A2, AhR и ARNT, что в большей мере проявляется у взрослых особей. Полученные результаты указывают на существенное ослабление реакции адаптации на стресс у старых животных.
Научно-практическая значимость работы
По своему содержанию работа носит преимущественно фундаментальный характер и представляет собой исследование молекулярных механизмов индукции CYP1A в печени инбредных линий мышей. Важность исследования экспрессии генов AhR, ARNT, CYP1A1 и CYP1A2, прежде всего, определяется вовлечением кодируемых ими белков в процессы канцерогенеза, особенно на его инициирующих этапах. Этот факт имеет фундаментальное значение для понимания механизма действия канцерогенных химических соединений на организм животных и человека и ведет к раскрытию природы фундаментальных биологических процессов в клетке.
9 Изучение механизмов воздействия канцерогенов на организм имеет также важное практическое значение как для экспериментальной работы, так и клинических исследований в ближайшем будущем.
Так, результаты, свидетельствующие об индивидуальных различиях в индукции CYP1A у мышей, генетически различающихся по чувствительности к ПАУ, важно учитывать при изучении механизмов химически индуцированного канцерогенеза, где традиционно используются данные линии мышей. Данные об экспрессии генов CYP1A и их транскрипционных факторов важны в разработке новых высокочувствительных тестов по определению канцерогенной активности химических соединений. Понимание механизмов биоактивации проканцерогенов раскрывает широкие перспективы для предотвращения и/или модификации канцерогенеза в терапевтических целях.
Основные положения, выносимые на защиту
При введении как MX, так и ОАТ, активность CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей увеличивается у линий с генотипом Ah+, и не изменяется у мышей с генотипом Ah", что подтверждает наличие генетических различий в индуцибельности цитохрома Р450 1А у мышей.
Под действием как MX, так и ОАТ, содержание мРНК CYP1A2 увеличивается у мышей всех линий, за исключением мышей SWR. Содержание мРНК CYP1A1 также увеличивается у всех линий мышей, независимо от генотипа Ah рецептора, в том числе у мышей SWR, AKR и DBA, традиционно считающихся нечувствительными к индукции ПАУ.
Вне зависимости от генотипа Ah рецептора в печени мышей определяется мРНК транскрипционных факторов AhR и ARNT, причем введение MX существенно не влияет на уровень их экспрессии. Вместе с результатами по экспрессии генов CYP1A1 и CYP1A2 это свидетельствует о том, что межлинейные различия у мышей в чувствительности к индукции ПАУ обусловлены не только дефектом Ah-рецептора.
Последовательность регуляторной области гена CYP1A2 (от -4675 до -4204), содержащая энхансерные модули, необходимые для конститутивной экспрессии гена CYP1A2, у различных инбредных линий мышей является
10 консервативной и не связана с межлинейными различиями в экспрессии CYP1A2 и чувствительностью к гепатоканцерогенному действию ОАТ. 5. Уровень экспрессии исследуемых генов, за исключением CYP1A1, различается у молодых и старых мышей в норме и под воздействием стресса. Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей заметно выше, чем в печени молодых особей, в то время как содержание мРНК AhR у старых животных понижено по сравнению с молодыми. Под влиянием стресса увеличивается экспрессия генов CYP1A2, AhR и ARNT, что в большей мере проявляется у молодых особей и может свидетельствовать об отсутствии или существенном ослаблении у старых животных реакции адаптации на стресс.
Апробация работы
Результаты работы были представлены и обсуждены на международном симпозиуме «13th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations» Стреза, Италия, 2000; на международном конгрессе «7th ESACP Congress» Кон, Франция, 2001; на международной конференции «18th European Workshop on Drug Metabolism» Валенсия, Испания, 2002; на Второй научной конференции с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии" Новосибирск, Россия, 2002; на международной конференции «11th North American ISSX Meeting» Орландо, США, 2002; на международном конгрессе «3rd European Congress of Biogerontology» Флоренция, Италия, 2002; на международной конференции «8th European ISSX Meeting» Дижон, Франция, 2003; на международном симпозиуме «8th Symposium on Catecholamines and other Neurotransmitters in Stress» Смоленице, Словакия, 2003; на международной конференции «7th International ISSX Meeting» Ванкувер, Канада, 2004.
Публикации. Автор имеет 25 печатных работ, из них 13 - по теме диссертации.
Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям -заведующей лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, профессору, доктору биологических наук, Гуляевой Людмиле Федоровне и заведующему Группой Фармакогеномики Инстититута Химической Биологии и Фундаментальной Медицины СО РАН, кандидату биологических наук, Филипенко Максиму Леонидовичу - за руководство работой на всех ее этапах, неоценимую методическую помощь, а также за помощь в написании диссертации.
Автор благодарит директора НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, академика РАМН, Ляховича Вячеслава Валентиновича за постоянную поддержку и консультации.
Автор выражает особую признательность Каледину Василию Ивановичу (Институт Цитологии и Генетики СО РАН), в тесном сотрудничестве с которым были выполнены большинство исследований.
Автор благодарит заведующего лабораторией генно-инженерных методов исследования НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН Коваленко Сергея Петровича за внимательное прочтение диссертации и ценные замечания.
Автор благодарит весь коллектив НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, а также всех сотрудников Группы Фармакогеномики Инстититута Химической Биологии и Фундаментальной Медицины СО РАН, за прекрасную творческую и дружескую атмосферу.
