Содержание к диссертации
Введение
1.1 Рак ободочной и прямой кишки 10
1.1.1 Генетические изменения при развитии рака ободочной и прямой кишки 10
1.1.2 Муцинозные опухоли толстого кишечника 12
1.2 Метилирование ДНК 14
1.2.1 Функция метилирования ДНК в прокариотах 14
1.2.2 Различия метилирования ДНК в эукариотах и прокариотах 15
1.2.3 Регуляция метилирования ДНК в эукариотических клетках 16
1.2.4 CpG островки 17
1.2.5 Регуляция экспрессии с помощью метилирования ДНК 19
1.3 Роль метилирования ДНК в канцерогенезе 20
1.3.1 Мутации метилированной ДНК 20
1.3.2 Снижение среднего уровня метилирования ДНК в опухолевых клетках 21
1.3.3 Региональное гиперметилирование в опухолях 22
2 Цели представленной работы 26
3 Материалы и методы 27
3.1 Образцы ткани 27
3.1.1 Подготовка срезов тканей для микродиссекции 27
3.1.2 Микродиссекция 27
3.2 Клеточные линии 27
3.3 Реактивы 28
3.3.1 Растворы и среды 28
3.3.2 Киты для молекулярной биологии 28
3.3.3 Рестрикционные ферменты 29
3.3.4 Модифицирующие ферменты 29
3.3.5 Праймеры и олигонуклеотиды 30
3.3.5.1 Праймеры для ПЦР 30
3.3.5.1.1 MUC2 кДНК 30
3.3.5.1.2 Промотор MUC2 30
3.3.5.1.3 Участок 1-го интрона гена MUC2 30
3.3.5.1.4 Последовательность промотора гена MUC2 обработанного бисульфитом 30
3.3.5.1.5 Мстилтрансфераза DNMT2 (Асе. Nr. AF045888) 31
3.3.5.1.6 Метилтрансфераза DNMT1 (Асе. Nr. Х63692) 31
3.3.5.1.7 p21waf(Acc.Nr.:U03106) 32
3.3.5.1.8 PDH (Асе. Nr. D90086) 32
3.3.5.2 Стандартные праймеры для реакции сиквенирования 32
3.3.5.3 Праймеры для однонулеотидной достройки праймера (SNuPE от Single Nucleotide Primer Extension) З З
3.3.6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) З З
3.3.6.1 Анализ экспрессии MUC2 34
3.3.6.2 Амплификация участка промотора гена MUC2 34
3.3.6.3 Амплификация первого интрона гена MUC2 35
3.3.6.4 Амплификация обработанной бисульфитом ДНК из клеточных линий 35
3.3.6.5 Амплификация обработанной бисульфитом ДНК из срезов тканей 36
3.3.6.6 ПЦР для метилтрансферазы DNMT2 37
3.3.6.7 ПЦР для метилтрансферазы DNMT1 38
3.3.6.8 ПЦР обработанной бисульфитом плазмидной ДНК 38
3.3.6.9 Внесение мутаций в промотор MUC2 с помощью ПЦР 39
3.3.7 Зонды для Норзерн и Саузерн блот гибридизации 3 9
3.3.7.1 Анализ экспрессии гена MUC2 с помощью Норзерн блот гибридизации 39
3.3.7.2 Зонды для Саузерн блот гибридизации 39
3.3.7.3 Олигонуклеотид, содержащий первые 30 Ьр кДНК гена MUC2 40
3.3.7.4 18S рРНК 40
3.3.7.5 Проба для р21 40
3.3.7.6 Зонд для гена Люциферазы 40
3.3.8 Плазмидные вектора 41
3.3.9 Бактериальные штаммы 41
3.3.10 Геномная библиотека 41
3.4 Методы анализа фага Я. 41
3.4.1 Культура фага на чашках Петри 41
3.4.2 Определение титра фага 42
3.4.3 Скрининг фаговой библиотеки с помощью ПЦР 42
3.4.4 Приготовление фаговой суспензии с высоким титром 45
3.4.5 Выделение препаративных количеств ДНК фага лямбда 46
3.5 Выделение іиіазмид 47
3.5.1 Трансформация E.coli 47
3.5.2 Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК 47
3.5.3 Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК 48
3.5.4 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 48
3.5.5 Конструирование плазмид 48
3.5.6 Клонирование продукта ПЦР в вектор ТОРО ТА 49
3.6 Анализ экспрессии генов 49
3.6.1 Выделение тотальной РНК 49
3.6.2 Норзерн блот гибридизация 49
3.6.2.1 Приготовление геля 49
3.6.2.2 Перенос РНК на мембрану 50
3.6.2.3 Мечение зондов 50
3.6.2.4 Гибридизация мембран 50
3.6.3 Обратная транскрипция-ПЦР (RT-ПЦР) 51
3.6.3.1 Синтез кДНК 51
3.7 Анализ метилирования ДНК 52
3.7.1 Саузерн блот гибридизация 52
3.7.2 Анализ метилирования ДНК с помощью бисульфитного сиквенирования 53
3.7.3 Анализ метилирования при помощи SNuPE 54
3.7.4 Ингибирование метилирования 5-аза-2'-деоксицитидином 56
3.8 Репортерный анализ активности промотора 56
3.8.1 Метилирование ДНК in vitro 56
3.8.2 Трансфекция эукариотических клеток 56
3.8.3 Определение активности люциферазы и р-галактозидазы 57
3.8.4 Нормализация эффективности трансфекции при помощи дот блот гибридизации 57
4 Результаты 58
4.1 Выделение и анализ промотора гена MUC2 58
4.1.1 Получение клона фага лямбда содержащего 5'участок гена MUC2 58
4.1.2 Сиквенирование и анализ промотора 64
4.1.3 Анализ регуляции промотора MUC2 66
4.2 Метилирование промотора в различных клеточных линиях 71
4.2.1 Метилирование промотора MUC2 в клетках экспрессирующих и не экспрессирующих MUC2 71
4.2.2 Анализ метилирования промотора MUC2 бисульфитным сиквенированием 74
4.2.3 Подавление метилирования приводит к активации MUC2 77
4.3 Метилирование промотора MUC2 в клонированных клетках 78
4.3.1 Подавление метилирования и получение клонов 78
4.3.2 Метилирование промотора MUC2 в полученных клонах 81
4.3.3 Изменения экспрессии генов в клонах 84
4.4 Влияние сайт-специфичного метилирования на активность промотора 86
4.4.1 Влияние метилирования на активность промотора в различных клеточных линиях 86
4.4.2 Анализ мутаций цитозинов в CpG сайтах #5 и #8 88
4.4.3 Анализ потенциального de novo метилирования или деметилирования трансфецированной плазмиды -89
4.5 Метилирование промотора MUC2 в тканях 90
4.5.1 Использование микродиссекции 90
4.5.2 Анализ метилирования промотора MUC2 в тканях 90
4.5.3 Метилирование промотора MUC2 в бокаловидных клетках 92
5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 94
5.1 Анализ последовательности промотора MUC2 94
5.2 Регуляция экспрессии MUC2 в клеточных линиях 95
5.3 Регуляция экспрессии MUC2 в нормальной и опухолевой тканях 99
5.4 Роль метилирования при развитии муцинозных карцином 102
6 Список литературы
- Муцинозные опухоли толстого кишечника
- Клеточные линии
- Праймеры для однонулеотидной достройки праймера (SNuPE от Single Nucleotide Primer Extension)
- Сиквенирование и анализ промотора
Введение к работе
Высокие показатели смертности от рака ободочной и прямой кишки (колоректального рака) во всем мире [1] послужили предпосылкой для его всестороннего изучения. В 1990 году Феарон (Fearon) и Фогельстейн (Fogelstein) предложили модель многоступенчатого процесса развития колоректальной карциномы [2]. Авторы предположили, что в процессе развития опухоль проходит через несколько стадий характеризующихся сериями генетических изменений, охватывающих онкогены [3] и гены-супрессоры [4]. Аденомы, развиваясь из нормальных эпителиальных клеток, проходят через несколько стадий дисплазии, и развиваются в карциному [2]. Инвазивная опухоль продолжает развиваться, и накопление новых генетических изменений коррелирует со способностью опухоли метастазировать. Этот длительный, многоступенчатый процесс занимает годы, а иногда - десятилетия [2].
Среди генов-супрессоров, играющих роль при развитии колоректального рака, наиболее хорошо изучен ген р53. Мутации этого гена описаны для различных типов опухолей [4]. В случае рака ободочной и прямой кишки, мутации в области гена р53 обнаруживаются в 70% случаев спорадических опухолей [5]. Белок, кодируемый этим геном, отвечает за контроль повреждения ДНК, приводя к аресту клеточного цикла в фазе G1, что дает возможность системе репарации ДНК устранить повреждение. Если же репарация невозможна, р53 запускает программируемую клеточную гибель - апоптоз. Мутации р53, как правило, обнаруживаются на поздних стадиях прогрессии от аденомы к карциноме. Таким образом, в большинстве ранних аденом мутации р53 не встречаются [4]. Инактивирующие мутации другого гена-супрессора - АРС (adenomatous polyposis coli) считаются наиболее ранним событием в процессе развития колоректального рака [6]. Наследственные мутации этого гена ведут к развитию семейного аденоматозного полипоза кишечника, для которого характерно развитие опухолей кишечника в раннем возрасте. Эти данные позволяют предположить необходимость АРС для регуляции пролиферации эпителия кишечника. В спорадических колоректальных опухолях мутации АРС встречаются в 60-80% случаев [7].
Мутации онкогена Ki-ras обнаруживаются в 50% случаев опухолей обводной и прямой кишки [2]. Частота мутаций на поздних стадиях развития опухолей мало отличается от частоты мутаций обнаруживаемых в крупных аденомах [2]. Кроме того мутации гена Ki-ras обнаруживались в 13% - 58% случаев фокусов аберрантных кишечных крипт [8,9], считающихся предшественниками опухолей. Таким образом активация онкогена Ki-ras является ранним событием при развитии опухолей обводной и прямой кишки.
Исследования так называемого наследственного не-полипозного колоректального рака (HNPCC - hereditary nonpolyposis colorectal cancer) позволили описать дополнительную группу генов, вовлеченных в процесс канцерогенеза [10]. Первый из описанных генов - hMSH2 относится к семейству генов отвечающих за исправление ошибок репликации ДНК [11]. Следующий - компонент системы репарации неспаренных оснований - hMLHl был описан в 1994 Броммером (Brommer) с коллегами [12]. Мутации в этих двух генах были обнаружены в 60% исследованных случаях HNPCC. Кроме того в нескольких случаях HNPCC были обнаружены мутации в двух других компонентах системы репарации неспаренных оснований PMS1 и PMS2 [13]. Потеря этих генов, не являющихся классическими онкогенами, приводит, тем не менее, к существенному повышению вероятности мутаций ведущих, в свою очередь, к злокачественной трансформации.
Муцинозные опухоли толстого кишечника
Физиологическое метилирование ДНК - единственная ковалентная модификация молекулы ДНК - осуществляется путем переноса метальной группы с S-аденозил метионина на 5-ю позицию пуринового кольца цитозина. Метилирование ДНК обнаруживается на разных стадиях эволюции в таких различных организмах как E.coli и Н.sapience. Однако некоторые виды, такие как D.melanogaster обходятся без метилирования ДНК [23].
Функция метилирования ДНК в прокариотах Метилирование ДНК в бактериях подверглось тщательному и всестороннему исследованию. В бактериях, наряду с цитозином, метилированию подвергается также и аденин. Эта модификация служит для функциональной организации генома и играет роль при репликации. Существует целое семейство ферментов ДНК метилтрансфераз (DNA-MTases), катализирующих метилирование цитозина в различных последовательностях [24]. Ещё одна функция метилирования ДНК в бактериях это обеспечение механизма распознавания чужеродной ДНК. Рестриктные эндонуклеазы способны отличить чужеродную ДНК от эндогенной на Введение основании паттерна (структуры) метилирования. Будучи узнанной, незащищенная метилированием чужеродная ДНК подвергается нарезке и уничтожается [24].
Другая важная функция метилирования ДНК в прокариотах это контроль точности репликации. В процессе репликации ДНК дочерняя цепь не метилируется немедленно после синтеза, но сначала анализируется на наличие возможных мутаций. В случае обнаружения неспаренного основания происходит репарация неметилированной цепи [25].
Различия метилирования ДНК в эукариотах и прокариотах В эукариотах метилированию подвергаются только цитозины, расположенные в последовательности CpG. Однако защитная функция метилирования ДНК в эукариотах аналогична его функции в прокариотах, хотя и осуществляется с использованием другого механизма. В клетках человека и грызунов чужеродные вирусные последовательности быстро и эффективно метилируются, что обеспечивает надежное выключение вирусных генов [26]. Этот же механизм отвечает за выключение гена, внесенного в геном трансгенной мыши [27,28]. Таким образом, роль метилирования ДНК в распознавании и уничтожении чужого генетического материала сохранилась на протяжении эволюции.
Гипотеза об участии метилирования ДНК в процессе репарации в эукариотах была опровергнута Араухо (Araujo) с коллегами [29], который показал, что в клетках эукариот метилирование ДНК происходит немедленно после репликации и даже фрагменты Оказаки имеют законченный паттерн метилирования [29]. Введение Значительно более высокая сложность генома эукариот, по сравнению с прокариотами, дает основания предположить, что в этом случае метилированный цитозин может иметь дополнительные функции в качестве «пятого основания». Действительно, было показано, что метилирование цитозина играет важную роль в функциональной организации генома эукариот. Так участки генома, содержащие большое количество метилированных цитозинов, как правило, не транскрибируются. Отсутствие метилирования является необходимым условием для транскрипционной активности. Так как метилирование ДНК является обратимой модификацией и не находится в прямой зависимости от последовательности ДНК, его принято считать эпигенетическим механизмом регуляции экспрессии [30,31].
Регуляция метилирования ДНК в эукариоти ческих клетках В эукариотических клетках описаны два типа процессов нормального метилирования. Первый, это de novo метилирование, отвечающее за перераспределение метилирования во время эмбриогенеза и процессов дифференцировки, проходящих во взрослом организме [32,33]. Недавно были описаны две человеческие метилтрансферазы DNMT3a и DNMT3b, обладающие de novo метилирующей активностью [34,35]. Гомологичные гены были обнаружены у мыши [36]. Эксперименты по выключению этих генов показали, что и DNMT3a и DNMT3b абсолютно необходимы для de novo метилирующей активности, но не имеют эффекта на поддерживающее метилирование [37].
Клеточные линии
Для внесения точечных мутаций в промотор MUC2 использовался метод ПЦР сплайсинга (метод подробно описан на сайте http://www.methods.info). Перехлестывающиеся фрагменты промотора были амплифицированны с праймерами, содержащими требующуюся мутацию. Полученные фрагменты служили, в свою очередь, матрицей для получения полноразмерного промотора MUC2 для чего использовались праймеры MUC2F23 и MUC2R23. 3.3.7 Зонды для Норзерн и Саузерп блот гибридизации 3.3.7.1 Анализ экспрессии гена MUC2 с помощью Норзерн блот гибридизации Для анализа экспрессии гена MUC2, Норзерн блот гибридизация проводилась с пробой, содержащим фрагмент участка повторов гена MUC2. Фрагмент ДНК размером около 600 Ьр был вырезан с помощью фермента EcoRI из плазмиды SMUC41, полученной от Гама (J.Gum) [97], проанализирован на агарозном геле и очищен с помощью набора QiaExII.
Зонды для Саузерн блот гибридизации Для анализа метилирования ДНК в промоторе гена MUC2 использовалась Саузерн блот гибридизация пробой, полученной с помощью ПЦР с праймерами MUC2F23 и MUC2R23. Зонд для анализа первого интрона гена MUC2 был получен Материалы и методы с помощью ПЦР с праймерами MUC2F30 и MUC2R30. Полученный продукт размером 439 Ьр был обработан Mspl и фрагмент длинной 245 Ьр был очищен и использовался в качестве зонда. Обе ПЦР проводились по следующей программе: 40 циклов - денатурация 95 С 1 мин, отжиг и синтез при 72 С 2.5 мин. 3.3.7.3 Олигонуклеотид, содержащий первые 30 Ьр кДНК гена MUC2 Олигонуклеотид, содержащий первые 30 Ьр кДНК гена MUC2, использовался для скрининга геномной библиотеки с целью поиска клонов, содержащих промотор гена MUC2. 5 -САТ GGT GGC TGG CAG GGG CGG TGT GGG TTG-3 3.3.7.4 18SpPHK Олигонуклеотид, содержащий 44bp человеческой 18S рРНК, был использован для нормализации количества РНК нанесенной на гель для Норзерн блот гибридизации.
Проба для ингибитора циклин зависимой киназы р21 была получена с помощью ОТ-ПЦР (RT-PCR) с праймерами р21 F54 и р21 R54. Амплификация проводилась по следующей программе: 35 циклов - денатурация при 94 30 сек, отжиг при 55С 1 мин; синтез при 72С 2 мин. Полученный фрагмент длиной 1416 Ьр был проанализирован на агарозном геле и очищен с помощью набора QiaExII.
Для определения эффективности трансфекции использовался дот блот с зондом к репортерному гену - люциферазе. Зонд был получен при помощи Материалы и методы РОССИЙСКАЯ ГОСУ г Д.РСТП ГНН АЯ обработки ДНК плазмиды pGL3basic рестриктными ферментами Hindlll и BamHI и очистки соответствующего фрагмента.
Суспензию фага лямбда (ЮОцл) смешивали с 200цл ночной культуры бактерий К802. После инкубации в течение 15 мин при 37С, к суспензии добавлялись 3 мл расплавленной верхней LB агарозы (0.7% агароза + среда LB + ЮгаМ MgSC«4) с температурой 47С. Полученная смесь переносилась на чашки Материалы и методы Петри с нижним агаром (1.5% агароза + среда LB + ЮтМ MgSO. ) и затвердевали 10 мин при комнатной температуре. Чашки инкубировались 18 часов при 37С
Определение титра фага Для определения титра (Т) фага X, использовались следующие разведения (D) суспензии фага: 1:10, 1:100; 1:1000; 1:10000 и 1:100000. Один и 5 цл (V) каждого разведения смешивались соответственно с 99 или 95цл буфера для разведения фага X. Фаг культивировался на чашках Петри как описано выше. После подсчета количества бляшек (N) титр определялся по формуле: T=(N/V) D.
Скрининг фаговой библиотеки с помощью ПЦР Метод скрининга библиотеки в фаге X был описан Израэлем с коллегами (Israel) [98]. Минимальное количество фаговых частиц необходимых для получения специфичного фрагмента гена определялось с помощью ПЦР. Nti - полное количество фаговых частиц использующихся для этапа скрининга, і -номер этапа (1, 2, 3) Nwi - количество фаговых частиц в каждой лунке на этапе скрининга, і - номер этапа (1, 2, 3). I. Определение минимального количества фаговых частиц (pfu) необходимых для скрининга: Для эксперимента использовались следующие разведения суспензии фага X: 103, 104, 105 pfu/мл. Один и 5 цл каждого разведения использовались в качестве матрицы для ПЦР. Минимальное количество фаговых частиц достаточное для получения специфичного продукта ПЦР использовалось как стартовое для скрининга (Nu).
Праймеры для однонулеотидной достройки праймера (SNuPE от Single Nucleotide Primer Extension)
Для выделения фаговых частиц к суспензии фага добавляли 24 г сухого NaCl, растворяли и инкубировали на льду 1 ч. Суспензию осветляли центрифугированием в течение 10 мин при 11000 х g при 4С (13000 об/мин в роторе JA21). К супернатанту добавляли PEG 6000 до конечной концентрации 10% и растворяли на магнитной мешалке. Полученный раствор инкубировали в течение ночи при 4С. Суспензию осветляли центрифугированием в течение 5 мин при 11000 х g при 4С. К супернатанту добавляли 0.5 г сухого CsCl на каждый мл суспензии фага и растворяли. Полученную суспензию наслаивали на ступенчатый градиент раствора CsCl (2 мл 1.7 г/мл, 1 мл 1.5 г/мл, 1 мл 1.45 г/мл) и центрифугировали 2 ч при 50000 х g при 4С (22000 об/мин в роторе SW41). Фаговые частицы собирали с интерфазы между 2 и 3-й ступеньками градиента. Полученную суспензию диализовали дважды по 1 ч против 1 л раствора, содержащего 10 mM NaCl, 50 тМ Tris НС1 рН8.0, 10 тМ MgCl2. Материалы и методы Для выделения ДНК к суспензии добавляли раствор ЭДТА рН 8.0 до концентрации 20 тМ, протеиназу К до концентрации 50 цг/мл и SDS до 0.5%. Суспензию инкубировали в течение 1 ч при 56С и экстрагировали дважды равным объёмом смеси фенол : хлороформ : изоамиловый спирт 25:24:1. После дополнительной экстракции хлороформом к раствору добавляли ацетат натрия до 0.3 М и преципитировали ДНК 2-мя объёмами 100% этанола. Преципитированную ДНК вынимали стеклянной палочкой, мыли в 1 мл 70% этанола, сушили на воздухе в течение 15 мин и растворяли в 50-100 цл буфера ТЕ рН 8.0. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически. 3.5 Выделение плазмид 3.5. J Трансформация Е. coli Аликвоту компетентных клеток TOPI OF (Invitrogen) размораживали на льду и добавляли 2 цл 0.5 М Р-меркаптоэтанола. К бактериям добавляли лигазную смесь (2-5 цл) или суперколированную плазмиду (10-20 нг), аккуратно перемешивали и инкубировали на льду 30 мин. Затем бактерии переносили в водяную баню на 42С, инкубировали 30 сек и охлаждали на льду 2 мин. К охлажденной суспензии добавляли 250 цл среды SOC и инкубировали 30 мин при 37С для выработки устойчивости к антибиотику. Далее бактерии высевали на чашки Петри с соответствующей селективной средой и растили в течение ночи. 3.5.2 Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК Для выделения аналитических количеств плазмидной ДНК одиночную бактериальную колонию переносили в 5 мл среды LB, содержащей соответствующий антибиотик. Бактерии культивировали в течение ночи при 37С и встряхивании 150 - 200 об/мин. Плазмидную ДНК выделяли из 1.5 мл культуры с Материалы и методы помощью набора для выделения плазмид RPM (Bio 101) в соответствии в протоколом производителя. Для рестриктного анализа использовали 5 цл полученного раствора ДНК. 3.5.3 Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК Для выделения препаративных количеств плазмидной ДНК бактерии выращивали в объёме 100 мл. Культуру инкубировали в течение ночи при 37С и встряхивании 150 - 200 об/мин. Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора Qiagen MIDI в соответствии в протоколом производителя. Полученный осадок ДНК растворяли в 100 цл НгО. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически. Для плазмид, использующихся для трансфекции, последний этап проводили в стерильных условиях. 3.5.4 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей Для выделения фрагментов ДНК из агарозных гелей использовались наборы GeneCleanll и QiaexII.
Сиквенирование и анализ промотора
Полученные результаты указывают на наличие дополнительного механизма регуляции активности промотора MUC2 определяющего разницу в экспрессии MUC2 в исследованных клеточных линиях. Одним из возможных механизмов является метилирование ДНК. Эта химическая модификация молекулы ДНК играет важную роль в регуляции экспрессии генов [104] и, кроме того, была показана важность метилирования ДНК в формировании тканеспецифичного паттерна экспрессии генов [105]. Учитывая положение гена MUC2 на хромосомном участке 11р15, являющемся горячей точкой гиперметилирования при человеческих неоплазиях [81] логично предположить участие метилирования ДНК в регуляции экспрессии MUC2. Поэтому на следующем этапе работы была исследована возможная корреляция активности промотора MUC2 со статусом метилирования соответствующего участка ДНК. Результаты 71
Метилирование ДНК промотора MUC2 в клеточных линиях с различным уровнем экспрессии MUC2 было проанализировано Саузерн блот гибридизацией, выполненной частично Е. Риде. Этот метод основан на свойствах некоторых рестриктаз различать метилированные и неметилированные последовательности ДНК. НраІІ, например, не способен гидролизовать ДНК в случае метилирования внутреннего цитозина в его сайте узнавания CCGG. В то же время активность фермента Mspl не зависит от статуса метилирования сайта узнавания. Поэтому Mspl используется параллельно с НраІІ для подтверждения наличия анализируемого сайта рестрикции.
Анализ экспрессии MUC2 в клеточных линиях колоректальных карцином. А: Норзерн блот гибридизация с пробой SMUC41. В: Агарозный гель, Результаты демонстрирующий одинаковое количество нанесённой РНК. (Норзерн блот был приготовлен У.Кобальц.)
Для анализа были выбраны 7 клеточных линий: 3 муцинозных - 5583-S, NCI-Н498, и LS174T; 3 немуцинозных - СС07, COLO 205 Troja 2 и одна клеточная линия со средней экспрессией - Т84. Экспрессия мРНК MUC2 была проанализирована Норзерн блот гибридизацией с пробой SMUC41 (Рис 14).
Метилирование на участке промотора размером 495 Ьр, а так же внутри первого экзона и части первого интрона анализировали Саузерн блот гибридизацией. Геномную ДНК обрабатывали рестриктазой BamHI (Рис. 15, дорожка 1), для получения фрагмента размером 900Ьр, и далее рестриктазой НраІІ (Рис. 15, дорожка 2) или Mspl (Рис. 15, дорожка 3). Полученные образцы разделяли в 1.2% агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану. Гибридизацию проводили с пробой к промотору MUC2 размером 497 Ьр (Рис. 15 С) или с пробой к интрону размером 245 Ьр (Рис. 15 С). Результаты показали, что ДНК муцинозных клеточных линий, как правило, свободна от метилирования. Слабый банд размером около 700 Ьр обнаруживаемый в образце клеточной линии 5583-S при гибридизации с пробой к промотору (Рис. 15А, дорожка 2) и интрону (Рис. 15В, дорожка 2) указывает на наличие незначительного метилирования в сайтах #1 и #3. Разрешающая способность геля не позволила различить эти два сайта. В образцах клеточной линии NCI-H498 в случае обеих проб был обнаружен банд размером 900 Ьр (Рис. 15А, В, дорожка 2) что говорит о полном метилировании всех исследованных сайтов. В образцах клеточной линии LS174T при гибридизации с пробой к интрону обнаруживался банд размером 500 Ьр указывающий на частичное метилирование сайта #8. ДНК всех немуцинозных клеточных линий была Результаты полностью метилирована на участке промотора. Банд размером около 700 Ьр обнаруживаемый обеими пробами в случае клеточных линий СС07 и COLO 205 указывает на частичное метилирование CpG сайтов #21/22. ДНК клеточной линии Troja 2 была полностью метилирована во всех проанализированных сайтах. Анализа клеточной линии Т84, экспрессирующей MUC2 на среднем уровне, выявил банды всех возможных размеров при гибридизации с обеими пробами (Рис. 15А, В, дорожки 2). Такой сложный паттерн метилирования является результатом поликлональности клеточной линии приобретённой в процессе культивирования.
