Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время активно изучаются возможности иммунотерапии раковых заболеваний. Описано большое количество раковых антигенов; в крови больных обнаруживают антитела к онкобелкам, что говорит о возможности распознавания опухолевых клеток. Иммунизация с использованием раковых антигенов позволяет получить хороший протективный ответ в мышиных моделях неоплазии, однако эффективность ее применения у раковых больных низка и составляет не более 10-15%. Низкая противоопухолевая эффективность терапевтической вакцинации раковых больных объясняется формированием механизмов опухолевой устойчивости, а также общей иммуносупрессией, наблюдаемой на поздних стадиях болезни. В этой связи превентивная вакцинация предрасположенных к развитию неоплазии людей представляется более перспективной. Формирование клеточного ответа до начала трансформации дает наибольшие шансы иммунной системе контролировать заболевание.
Превентивная вакцинация показала высокий уровень протекции в трансплантируемых моделях опухолевого роста, однако эти модели физиологически сильно отличаются от реальной ситуации онкогенеза. Модели спонтанного роста опухолей являются более близкими условиям нормального развития неоплазии. Использование именно спонтанной модели развития неоплазии наиболее хорошо имитирует естественную ситуацию развития опухоли - длительное формирования, развитие в результате трансфорации единичных клеток, естественный процесс коэволюции опухоли и иммунных механизмов контроля.
Существующие данные по превентивной противоопухолевой вакцинации получены исключительно в генетически-модифицированных мышах и сильно различаются от модели к модели от полной противоопухолевой протекции до небольшого увеличения латентного периода заболевания. Эти модели также не лишены недостатков, затрудняющих оценку перспективности превентивной вакцинации у человека.
Существует острая необходимость в мышиных моделях спонтанного онкогенеза, соответствующих реальной ситуации развития опухоли, что подразумевает экспрессию аутологичного антигена в нормальном генетическом окружении и длительное формирование опухоли. Анализ противоопухолевого эффекта превентивной вакцинации в таких моделях позволит правильно оценить перспективность иммунизации человека.
В качестве антигена в данной работе использован муцин 1, мембранный гликопротеин, играющий важную роль в физиологии нормальных и трансформированных эпителиальных клеток. Гиперэкспрессия муцина детектируется практически во всех аденокарциномах человека, включая более 90% карцином молочной железы, поджелудочной железы, яичников, легких, желудка. В клетках карциномы молочной железы наблюдается более чем 10-кратное повышения количества мРНК муцина 1. Высокий уровень экспрессии в раковых клетках и непосредственное участие муцина 1 в трансформации, метастазировании, выживании трансформирванных клеток в условиях стресса делают его хорошей мишенью для иммунотерапии. Вакцины на основе Муцина 1 человека широко изучаются в моделях роста опухоли на мышах и считаются перспективными для иммунотерапии злокачественных болезней человека.
Цель работы - разработка ДНК-белковой вакцины на основе мышиного муцина 1 и оценка противоопухолевого эффекта превентивной иммунизации в трансплантируемой и спонтанной моделях рака молочной железы у мышей.
В рамках работы были поставлены следующие задачи:
1. Клонировать фрагменты мышиного гена муцинаї в плазмидный вектор для
экспрессии в тканях млекопитающих.
Получить рекомбинантные белки на основе клонированных фрагменов муцинаї.
Разработать протокол индукции ответа на муцин 1 у мышей различных линий и сравнить эффективность активации гуморального и клеточного ответа при иммунизации ДНК и комплексом ДНК-белок.
Оценить противоопухолевый эффект ДНК-вакцины на основе муцина 1 в трансплантируемой модели рака молочной железы у мышей.
Оценить противоопухолевый эффект превентивной иммунизации ДНК-белок вакциной в спонтанной модели рака молочной железы у мышей.
Изучить влияние локального воспаления, вызванного введением бактериальных антигенов в места формирования опухоли, на частоту возникновения опухолей и выживание мышей, иммунизированных ДНК-белок вакциной.
Научная новизна
Впервые была создана комбинированная ДНК-белковая вакцина на основе муцина 1.
Впервые был изучен противоопухолевый эффект превентивной иммунизации мышей вакциной на основе муцина 1 мыши.
Впервые в исследованиях по противоопухолевой вакцинации была использована BYRB линия мышей, для которой характерно спонтанное формирование множественных карцином молочных желез, по многим параметрам воспроизводящих семейных рак молочной железы человека.
Впервые изучали совместный эффект индукции локального воспаления и иммунизации вакциной на основе муцина 1 на формирование опухолей в спонтанной модели карциномы молочной железы.
Практическая значимость
Нами показано, что двухкомпонентная вакцина, включающая ДНК и белковые фрагменты муцина 1, оказывается более эффективной в индукции как гуморального, так и клеточного звеньев иммунного ответа по сравнению с иммунизацией ДНК. ДНК-белковая вакцина является перспективной для иммунотерапевтических исследований.
Обнаружено, что индукция иммунного ответа на раковый антиген (муцин 1) на стадии, предшествующей неоплазии, приводит к значительному ускорению формирования опухолей у животных (2-х кратному у мышей, иммунизированных с 2 месяцев), в спонтанной модели карциномы молочной железы. Проканцерогенный
эффект иммунизации значительно возрастает в сочетании с дополнительной индукцией воспаления в месте трансформации клеток. Эти данные свидетельствуют о том, что противоопухолевая вакцинация, как профилактическая, так и терапевтическая, может иметь обратный эффект. Индукция иммунного ответа у предрасположенных к раку пациентов может привести к увеличению риска развития неоплазии.
В работе обнаружено исчезновение популяции антиген-специфичных ИНФ-гамма продуцирующих Т клеток и поляризация гуморального ответа по Тх2 типу по мере развития неоплазии в спонтанной модели канцерогенеза.
Одним из направлений развития современной иммунотерапии рака является поиск механизмов усиления иммунного ответа на раковые антигены. Данная работа показывает, что одной из основных причин описанной низкой эффективности потивоопухолевого иммунного ответа является анергизация опухоль-специфичных CD8 Т-клеток в процессе развития опухоли. Низкий уровень ответа на лечение свидетельствует, скорее всего, о необходимости принципиального изменения подходов в иммунотерапии рака от получения и поддержания пула антиген-специфичных цитотоксических лимфоцитов к стимулированию их миграции в опухолевую среду и обеспечению устойчивости к супрессирующим их активность опухолевым механизмам.
Долгий период наблюдения (15 месяцев) в используемой нами спонтанной модели канцерогенеза позволил оценить влияние индукции иммунного ответа к собственному белку на жизнеспособность мышей. Наблюдалось значительное ухудшение выживания иммунизированных мышей и признаки аутоиммунного процесса (непроходимость кишечника, морфологические изменения печени и почек). Апробация работы и публикации
Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Отдела
иммунологии ИБХ РАН, на Всероссийской конференции с международным участием
«Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2003 и 2004, зимней молодежной научной
школе «Перспективные направления физико-химической биологии и
биотехнологии», 2004 и 2005, 7th John Hamphrey advanced summer programme in
immunology, 2005, 16th European Congress of Immunology, Paris, 2006, 2-d European Immunology Congress, 13-16 September, 2009, Berlin.
По теме диссертации опубликовано 14 научных работ в центральной печати и материалах российских и зарубежных научно-практических конференций и съездов. Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, 5 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на 92 страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков, 4 таблицы. Список литературы включает 147 источников, из которых 143 иностранные.
Животные. В исследовании использовали мышей линий BALB/cJCitMoise (далее В/с), CBRB-Rb(8.17)llem (CBRB), BYRB-Rb(8.17)llem (BYRB), полученных в ИБХ РАН.
Клонирование фрагментов муцина 1. Для синтеза кДНК использовали суммарную РНК, выделенную из опухолевых клеток. РНК транскрибировали М-MuLV ревертазой (Бионем, Москва) с помощью олиго-dT праймера 1 час при 37С. Полученную кДНК использовали для постановки ПЦР с тисі специфичными праймерами, включающими сайты рестрикции для ВатШ и Xhol рестриктаз. Нами было клонировано два участка тисі, соответствующих экзонам 2-4 (тис234) и 4-6 (тис456). Оба фрагмента бьши клонированы по сайтам BamHI и Xhol в вектор pET22b(+) (Novagen). Последовательности были переклонированы в вектор pBK-CMV (Stratagene).
Выделение плазмид. Для выделения плазмид использовали Wizard Plus Minipreps DNA purification System (Promega, Madison, USA).
Экспрессия гена muc234 в E.Coli.
Экспрессию белков MUC234 и MUC456 в штамме Е. Coli BL-21 провели по стандартному протоколу (PET system manual). Рекомбинантные белки очищали на Ni-
агарозе (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя. Полученные белки диализовали против PBS, разливали на аликвоты и хранили на - 20С.
Гель-электрофорез. Для определения гомогенности выделенных препаратов, а также для определения молекулярной массы белков использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле в соответствие с методикой (Coligan et al., 1994)
Инактивированные бактерии. Грам-положительные бактерии Micrococcus lyzodeikticus (ML) наращивали в LB среде, дополненной 2% глюкозой при 28С до достижения плотности культуры ОП600=0,6. Инактивировали при 60С, 30 мин. Отмывали в фосфатном буфере (ФБ), растворяли в прежнем объеме. Мышам вводили 50 мкл такой суспензии подкожно.
Иммуно-ферментный анализ. Определение IgGl и IgG2a, специфичных к MUC1, проводили по стандартной методике (Pharmingen). Смесь MUC234 и MUC456 по 2 мкг/мл каждого в ФБ наносили на планшеты (Costar) на ночь. Все дальнейшие инкубации выполнены в 1% бычьем сывороточном альбумине (БСА) в ФБ при комнатной температуре. Между инкубациями планшеты отмывали в 0.05% растворе Tween 20 в ФБ. Использовали биотинированные изотип-специфичные антитела, конъюгат ExtrAvidin-пероксидаза (Sigma Со, USA). Реакцию проявляли ортофенилендиамином и оценивали на ридере планшетов Multiscan МСС/340. Данные представлены как оптические плотности.
Окраска внутриклеточных цитокжов. Спленоциты после гипотонического шока в 0,83% NH4C1, инкубировали при 37С и 5% СОг в течение 18 ч в RPMI-1640 (Sigma Со.) с 10% фетальной телячьей сывороткой (ФС) (BioClot Ltd, Germany), 300мкг/мл L-глютамина, 50 мМ меркаптоэтанола и антибиотиками (Sigma Со.) в присутствии смеси MUC234 и MUC456 по 5мкг/мл каждого. В последние 6 ч инкубации добавляли брефелдин A (Sigma) по 50мкг/мл. Клетки отмывали в ФБ, содержащем 4% ФС и 0,1% NaN3 (ФБ-цито), и метили анти-СБ4 or CD8 антителами, конъюгированными с FITC (Caltag, USA), в течение часа. После отмывки свободные FcR блокировали 10% мышиной сывороткой в течение 30 мин, отмывали и фиксировали в 1% параформальдегиде в ФБ-цито в течение 30 мин при 37С. После
отмывки клетки обрабатывали свежеприготовленным 0.2% сапонином (Sigma Со.) в течение 1 ч. После однократной отмывки клетки метили антителами к ИФН-у мыши, конъюгированными с фикоэритрином в течение 2 ч при 4С. В качестве изотипического контроля использовали смесь мышиных IgG] и IgG2a антител, меченных FITC и РЕ. После окончания инкубации клетки отмывали в ФБ с 1 тМ EDTA и переносили в пробирки для дальнейшего анализа на цитометре.
Цитофлюорометрия. Анализ субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-клеток, продуцирующих IFN-y оценивали на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson, USA) с использованием программы CELLQuest. В работе использовали антитела: aHTH-CD3-FITC, -CD220-FITC, -CD4-FITC, -CD8-FITC, -ИФН-у-фикоэритрин (РЕ), и изотипический контроль (Caltag, San Francisco, Calif).
Статистический анализ проводили с использованием пакета MS Office Excell по t-критерию Стьюдента.
