Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Вирус иммунодефицита человека
1.1.1. Краткое описание генома ВИЧ-1
1.1.2. Обратная транскриптаза ВИЧ-1
1.1.3 .Схема обратной транскрипции
1.2 Анти-ВИЧ терапия
1.2.1. Блокирование стадии адсорбции
1.2.2. Ингибиторы обратной транскрипции Аналоги субстратов Ненуклеозидные ингибиторы ОТ Связывание ненуклеозидных ингибиторов с обр транскриптазой ВИЧ-1
1.2.3. Ингибиторы других этапов жизненного цикла ВИЧ-1
1.3. Глицирризиновая кислота Противовирусная активность глицирризиновой кислоты
2. Материалы и методы
2.1. Реактивы, используемые в работе
2.2. Буферные растворы.
2.3. Трансформация клеток Е.Coli
2.4. Выделение обратной транскриптазы
2.5. ПААГ SDS-электрофорез
2.6. Определение скорости реакции, катализируемой ОТ
2.7. Определение кинетических параметров реакции
2.8. Исследование противовирусной активности соединений
2.9. Фаговый дисплей
3. Результаты и обсуждение
3.1.Характеристика использовавшихся в работе вариантов обратных транскриптаз 48
3.2. Исследование ингибирующей активности ГК и ее производных в отношении ОТ ВИЧ-1 54
3.3.Исследование ингибирующей активности бетулина и его производных 70
3.4 Исследование ингибирующей активности антра- и нафтохинонов 73
3.5.Поиск сайтов связывания глицирризиновой кислоты методом фагового дисплея 79
4. Заключение 92
Выводы 96
Список литературы 98
- Ингибиторы обратной транскрипции Аналоги субстратов Ненуклеозидные ингибиторы ОТ Связывание ненуклеозидных ингибиторов с обр транскриптазой ВИЧ-1
- Глицирризиновая кислота Противовирусная активность глицирризиновой кислоты
- Исследование противовирусной активности соединений
- Исследование ингибирующей активности ГК и ее производных в отношении ОТ ВИЧ-1
Введение к работе
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) - сегодня наиболее известный представитель семейства Ретровирусов. Действительно, синдром приобретенного иммунодефицита или СПИД - болезнь, вызываемая ВИЧ, за последние десятилетия широко распространился по всей планете. По последним данным, за 20 лет, прошедшие с момента открытия вируса, в мире умерло 24 миллиона человек, то есть население Бельгии и Голландии вместе взятых. Всего за это время заразилось "чумой XX века" 40 миллионов человек, и пока эпидемия не выказывает никаких признаков затухания. В России она распространяется со стремительной скоростью. По данным 2002 г. число ВИЧ-инфицированных уже превысило 200 тысяч (и это только официальная статистика, которая отличается от действительной как минимум в 5-10 раз). Если ВИЧ будет распространяться с той же скоростью, то более 5 миллионов россиян станут ВИЧ-положительными к 2007 году (по данным ).
ВИЧ это сравнительно небольшой, достаточно просто устроенный вирус с уникальной системой репродукции. Данный вирус имеет три фермента, необходимых ему для успешной репликации - обратную транскриптазу, интегразу и протеазу. Обратная транскриптаза осуществляет синтез двухцепочечной ДНК с вирусной РНК, интеграза встраивает ДНК провируса в геном клетки-хозяина, а протеаза нарезает предшественников вирусных белков на относительно короткие полипептидные цепи, способствуя образованию новых вирионов (Katz R.A., Skalka A.M., 1994; Freed Е., 2001).
Реакция синтеза ДНК с матрицы РНК является специфической особенностью представителей семейства Ретровирусов. Поэтому обратная транскриптаза - фермент, осуществляющий этот процесс, привлекает внимание со стороны ученых, как наиболее перспективная мишень действия противовирусных препаратов.
В первую очередь в качестве ингибиторов обратной транскриптазы были использованы аналоги нуклеозидов (2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты (dNTP). Первым из нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы, принесшим реальный успех в лечении и профилактике ВИЧ-инфекции, был 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин (азидотимидин, АЗТ). Этот нуклеозид является производным пиримидинового нуклеозида тимидина, в положении З'-гетероцикла молекулы которого находится азидная (N3) группа (Островский, 1999).
Однако вскоре стали понятны недостатки длительного применения азидотимидина. Во-первых, уже через несколько месяцев лечения появляются варианты вируса, обладающие устойчивостью к действию препарата и лечебный эффект АЗТ исчезает (аминокислотные замены, вызывающие устойчивость к АЗТ впервые описаны Larder et al, 1989); во-вторых, это ряд сильных побочных действий препарата, заключающихся в подавлении функций многих органов. Были разработаны другие соединения, аналоги нуклеозидов - 2',3'-дидезоксицитидин (ddC), 2',3'-дидезоксиинозин (ddl), 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидин (d4T) и 2',3'-дидезокси-3'-тиоцитидин (ЗТС) и некоторые другие. В настоящее время для лечения ВИЧ-инфекции практически нигде не применяется монотерапия (лечение одним препаратом), т.к. использование двух или более соединений значительно снижает вероятность появления мутаций и не требует таких высоких концентраций препаратов (Johnson, 1996). Наиболее надежным является использование сочетания соединений нуклеозидной и ненуклеозидной природы. Если аналоги нуклеозидов блокируют синтез ДНК, встраиваясь в растущую цепь, то вещества ненуклеозидного происхождения связываются непосредственно с обратной транскриптазой, меняя ее конформацию таким образом, что дальнейшая ее активность становится невозможной (Litvak S., 1996). Препараты из группы ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ-1 обладают рядом преимуществ - более низкой токсичностью, более высоким сродством к ферменту, а в сочетании с
аналогами нуклеозидов значительно повышают активность последних (De
Clercq, 1999).
Таким образом, поиск новых ингибиторов репликации ВИЧ-1 остается актуальным в настоящее время. Для того, чтобы использовать их с наибольшей эффективностью, необходимо изучить механизмы взаимодействия новых соединений с обратной транскриптазой ВИЧ-1. Особенный интерес вызывают те соединения, о биологической активности которых уже есть данные.
Давно известно, что глицирризиновая кислота (ГК), активный компонент корня солодки (Gyicyrrhiza sps.) подавляет репликацию ВИЧ в культуре клеток (Ito et al, 1988). Позднее было показано, что глицирризиновая кислота (ГК) более активна на ранних стадиях инфекции (Плясунова О.А. и др., 1992). Кроме того, данные о противовирусной активности глицирризиновой кислоты и в отношении других вирусов -гепатита В и С, Марбург, Герпесвирусов и по последним данным, Коронавирусов (ТОРС вирус, или SARS). Это соединение обладает и другими биологическими активностями - противоопухолевой, противовоспалительной, антиаллергической и т.д. (Толстиков Г.А. и др. 1997).
Однако, несмотря на большое количество данных о противовирусной активности ГК и ее производных, на настоящий момент очень мало известно о механизмах ее действия в клетке. Есть сообщения об ингибировании ГК различных киназ, в частности, казеин киназы 2 (участвует в фосфорилировании обратной транскриптазы ВИЧ-1, тем самым повышая ее активность (Harada S. et al, 1998)) и протеин киназы С, которая фосфорилирует рецептор CD4 на поверхности Т-лимфоцитов, необходимый для связывания вируса с клеткой (Kazuhiro Н. et al, 1991). С другой стороны, из литературных данных известно, что некоторые природные тритерпены, выделенные из растений Shizcmdra sphaercmdra, Maprounea africana и других, могут служить ингибиторами обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ-1 (Matthee G. et al 1999; Vlietinick A., 1998).
Целью настоящей работы являлось изучение молекулярных механизмов анти-ВИЧ активности глицирризиновои кислоты и ее производных, в том числе способность этих соединений ингибировать рекомбинантную ОТ ВИЧ-1. Также нашей целью являлось исследование ингибирзтощей активности в отношении ОТ ВИЧ-1 ряда производных бетулина, другого природного тритерпена, и новых синтетических производных хинонов. Для определения возможных мишеней действия ГК в клетке была использована технология фагового дисплея.
Таким образом, перед настоящим исследованием стояли следующие задачи:
проверить ингибирующую активность ГК и ее производных в отношении рекомбинантной ОТ ВИЧ-1 и ее мутантных форм, несущих аминокислотные замены, обусловливающие устойчивость к АЗТ;
выяснить характер взаимодействия ГК и ее производных с АЗТ и невирапином при совместном ингибировании;
проверить ингибирующую активность бетулина и его производных в отношении рекомбинантной ОТ ВИЧ-1 и АЗТ-устойчивых форм ОТ;
исследовать ингибирующую активность ряда производных хинонов в отношении ОТ ВИЧ-1;
применив метод фагового дисплея, описать возможные мишени противовирусного действия ГК.
Ингибиторы обратной транскрипции Аналоги субстратов Ненуклеозидные ингибиторы ОТ Связывание ненуклеозидных ингибиторов с обр транскриптазой ВИЧ-1
Рентгеноструктурный анализ показал, что ненуклеозидный ингибитор невирапин (рис. 1.13) связывается в кармане около основания большого пальца и может ограничивать движения этого домена (Mui et al, 1992). На рисунке 1.14 схематично изображено связывание ОТ и невирапина. При сравнении структур ОТ и комплекса ОТ/ненуклеозидный ингибитор становится видно, что при связывании с ингибитором субдомен «большого пальца» рбб субъединицы изгибается к матричной щели и тем самым затрудняет связывание с ДНК при обратной транскрипции.
Ингибиторы других стадий жизненного цикла ІЇІ1Ч-1. После образования двухцепочечной ДНК в цитоплазме при участии обратной транскриптазы, интеграза транспортирует ее в ядро, где она интегрируется в геном клетки-хозяина. Интеграза так же ответственна и за 3 -процессинг вирусной ДНК. Благодаря своей уникальности, интеграза служит заманчивой мишенью для действия анти-ВИЧ препаратов, но, к сожалению, на настоящий момент основным препятствием для получения набора специфических ингибиторов интеграции является как недостаток достоверных данных о строении и функциях интегразы, так и отсутствие надежной тест-системы для оценки интегразной активности (De Clercq, 1995; Pluymers W. et al, 2001).
Интеграза состоит из трех субдоменов. N - концевой домен содержит в своем районе так называемые «цинковые пальцы», отвечающие за связывание с ДНК. С-концевой домен отвечает за димеризацию и белок-белковые взаимодействия. Средняя часть фермента содержит каталитический центр. Наиболее активной формой фермента является тетрамер, но есть также данные о действии интегразы и в виде димера и октамера (Dyda et al, 1994).
В качестве ингибиторов интегразы в последнее время были предложены дикетовая кислота, ряд антисмысловых олигонукледитов, динуклеотиды, некоторые природные соединения на основе хинонов (Chen I.J. et al, 2002; Debyser Z. et al, 2002; Nair V., 2002). Куркумин (диферулоилметан, выделенный из корней куркумы Curcuma spp) и некоторые метаболиты низших грибов или водорослей (эквизетин, фомасетин, отеромицин и интегринновая кислота) могут ингибировать интегразу ВИЧ (Lau A.F. et al, 1993; De Clerq, 2000). Ряд секститерпенов и алкалоидов, выделенных из растения рода binder-а, также обладает ингибирующей активностью в отношении интегразы (Zhang C.F. et al, 2000); а флаваноиды и флавоны из растения Thevetia peruviana подавляют активность как интегразы, так и обратной транскриптазы ВИЧ (Tewtrakul S. et al, 2002).
Протеаза ВИЧ-1 ответственна за расщепление предшественников полипротеидов для получения зрелых форм белков. Это симметричный гомодимер, его структура схожа с таковой для других аспартиловых протеаз семейства пепсина (Wlodawer et al, 1989). Поиск ее ингибиторов сначала велся в направлении конструирования «пептидомиметиков», затем стали разрабатываться производные пенициллина и некоторых других соединений.
Ингибиторы протеазы, проникая в инфицированные вирусом клетки, блокируют активность фермента, препятствуют распаду длинных цепей полипептидов на короткие звенья - пептиды и ферменты, необходимые ВИЧ для образования новых копий. Без них вирус дефектен и не может инфицировать клетку. Ингибиторы протеазы более мощно тормозят репликацию вируса, чем ингибиторы обратной транскриптазы и за 1 мес. лечения снижают вирусную нагрузку на 99%, в силу чего наступает ремиссия болезни, повышается уровень CD4+ лимфоцитов. Поскольку протеаза ВИЧ отличается от протеазы человека, ингибиторы вирусной протеазы действуют избирательно, не блокируя функцию фермента клеток человека. Но к этим препаратам и быстрее формируются устойчивые клоны вирусов (Katz R.A., Skalka A.M., 1994). Среди недостатков использования ингибиторов протеазы можно выделить короткий период полураспада в организме, высокую гидрофобность данных соединений, что затрудняет их использование в лекарственных формах и высокую токсичность (Kuritzkes D.R., 2002).
Существуют и другие классы возможных ингибиторов репродукции ВИЧ-1. Это прежде всего различные антисмысловые олигонуклеотиды и олигодиоксинуклеотиды, направленные как на блокирование процесса обратной транскрипции, так и транскрипции с провирусной ДНК и трансляции (De Clercq, 1995).
В последнее время практически не применяется использование только одного препарата в лечебной практике. Длительное лечение одним препаратом приводит к возникновению мутаций, которые обеспечивают устойчивость вируса к его действию. Давно показано, что комбинационная терапия - сочетание двух или более соединений, блокирующих разные участки одного фермента или разные ферменты, приносит максимальный эффект при противовирусной терапии, например, использование одного аналога нуклеозида, ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы и ингибитора вирусной протеазы. Такой подход позволяет значительно снизить эффективные концентрации лекарственных средств (и тем уменьшить их токсичный эффект), а также уменьшить или исключить вероятность возникновения мутаций, обусловливающих устойчивость к анти-ВИЧ терапии (de Jong et al, 1995; Johnson, 1996). 1.3. Глнцирризиновая кислота.
Глицирризиновая кислота Противовирусная активность глицирризиновой кислоты
Антивирусная активность ГК явилась предметом повышенного внимания клиницистов, поскольку было показано, что как ГК, так и ее моно аммониевая соль полностью ингибируют репродукцию ДНК и РНК содержащих вирусов: Vaccinia, Herpes simplex, Varicella zoster, Vesicular stomatitas, и др. (Fujisawa Y. et al, 2000; Sekizawa T. et al, 2001; Bean P., 2001; Crance J.M. et al, 2003). По последним данным глицирризин эффективно подавляет репликацию вируса ТОРС (тяжелый острый респираторный синдром - или SARS) в культуре клеток (Cinatl J. et al, 2003). Очень важным свойством ГК и ее производных является способность ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека (Ito et al, 1987; Sasaki H. et al, 2002). Предварительными клиническими исследованиями показано, что при введении больным СПИД ГК в дозе до 1,6 г в день увеличивается число Т4 лимфоцитов, и снижается содержание вирусного антигена. Были предложены различные лекарственные формы, содержащие ГК, эффективные при пероральном и парентеральном применении (Ito et al, 1988). Накоплена довольно солидная статистика успешного клинического использования препарата SNMC, представляющего собой раствор 0.2% ГК, 0.1% цистеина, 2% глицина и 5% глюкозы.
К препаратам, эффективно ингибирующим репродукцию ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в культуре клеток МТ-4, относятся глицирам, пента-0-никотинат ГК и мононатриевая соль ГК (Плясунова О.А. и др., 1992). Получены композиции ГК с азидотимидином, обнаружившие синергическое действие при анти-ВИЧ терапии на модели хронической инфекции в моноцитах человека U937 при длительном «лечении» (Покровский А.Г. и др, 2001), АЗТ и глицирама при хронической и острой ВИЧ-инфекции в клетках (Плясунова О.А. и др., 1992).
Сообщается о получении комплексов ГК с фенольными компонентами солодкового корня - ликохалкоином А, изоликофлавоном, гликокумарином, подавляющими пролиферацию вируса СПИДа. Среди веществ, перспективных в качестве анти-ВИЧ-агентов, оказалась динатриевая соль кислого сукцината глицирретовои кислоты, широко применявшаяся для лечения язвенной болезни (Nakashima Н., 1987).
В работе были использованы следующие реактивы и материалы: dTTP, IPTG, агароза, акриламид, («Медиген», Новосибирск); Ы -метилен-бис-акриламид («ICN Pharmaceuticals», США); персульфат аммония, дитиотреитол, бромфеноловый синий, Трис, дитиотреитол, хлорид магния, глицерин, ТЕМЕД, ЭДТА, SDS («Sigma», США); бактотриптон, б акто дрожжевой экстракт, бактоагар, («Difco», США), [3H]dTTP «Amersham», Великобритания, [33P]dATP «Изотоп», Санкт-Петербург, Ni-NTA агароза «Qiagene», США. Остальные реактивы были марки х.ч. или о.с.ч. отечественного производства.
Клетки. Для оценки цитотоксичности и противовирусной активности исследуемых соединений использовали перевиваемую линию лимфоцитов человека МТ-4, высоко чувствительную к ВИЧ. Клетки культивировали на среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы фирмы "ICN", 0.06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина, с посевной концентрацией 5x105 клеток/мл в присутствии препаратов (экспериментальные образцы) либо в их отсутствии (контроль) в культуральных планшетах фирмы "Costar" при температуре 37С в течение 4 суток. В конце каждого пассажа определяли концентрацию и долю жизнеспособных клеток в образце с помощью камеры Горяева после окрашивания клеток 0.4% раствором трипанового синего. Вирусы. В работе использовали штамм ВИЧ-1/ЭВК (депонирован в Государственной коллекции вирусов № 4005), полученный из Института вирусологии, Москва (Карамов Э.В. и др., 1986; Руднева И.А. и др., 1993).
Клетки штамма BL-21(DE-3)pLysS, плазмида pBRP-HR и ее варианты для выделения обратной транскриптазы дикого типа и мутантных форм, любезно предоставлены проф. С. Н. Кочетковым (ИМБ им. В. А. Энгельгарда РАН, Москва) Препарат Невирапин (Viramun, Boehringer Ingelheim) любезно предоставлен Новосибирским областным центром профилактики и борьбы со СПИДом.
Азидотимидин трифосфат (АЗТ-ТР), используемый в качестве нуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы ВИЧ-1, синтезирован в Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН (г.Москва).
Препарат глицирризиновой кислоты (1а) со степенью чистоты 98% был предоставлен Институтом органической химии СО РАН, лабораторией лесохимии и природных соединений. Моноаммониевая соль ГК (глицирам, 16) и пента-О-никотинат ГК (пента-О-никотинат ГК, 1в) синтезированы в Институте органической химии УНЦ РАН (г. Уфа). Структуры исследуемых соединений приведены на рисунке 2.1 и на схемах в главе 3.
Глицирретовая кислота (1г) синтезирована по (Shibata Sli. et al, 1987). Бетулин (Па) был выделен из коры березы по (Pettit G.R. et al, 1960). Бетулоновая кислота (Пб) получена окислением бетулина по (Darrick S.H. et al, 1997). Синтез аминокислотных производных глицирретовой кислоты (Ід, Іе) описан в (Петренко Н.И. и др., 2000). Аминокислотные производные бетулоновой кислоты (Ив, Иг) получали по аналогии. Синтез функционализированных нафто (соединения Ша, Шб)- и антрахинонов (соединения Шв, Шг, Шд, Ше, Шж) основан на реакции Дильса-Аль дера 1-арилсилоксибутадиенов с различными хинонами (Толстиков Г. и др., 1990; Шульц Э. и др., 1998).
Исследование противовирусной активности соединений
Цитотоксичность исследованных препаратов и их противовирусная активность в отношении ВИЧ-1 была оценена сотрудниками лаборатории ретровирусов Проняевой Т.Р. и Плясуновой О.А. Оценка цитотоксичности препаратов. Цитотоксичность исследуемых препаратов изучали на культуре перевиваемых Т лимфоцитов человека (линия МТ-4). Исследуемые препараты растворяли в ДМСО, затем готовили последующие 10-ти и 2-у кратные разведения. Аликвоты (1/100 конечного объема) соответствующих растворов препаратов вносили в суспензию клеток (посевная концентрация составляла при этом 0.5x10 клеток/мл). Клетки культивировали в культуральных флаконах на среде RPMI-1640 с добавками, как описано выше. По окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания клеток 0.4% раствором трипанового синего. Строили дозозависимую кривую и определяли концентрацию соединений, вызывающую гибель 50% клеток - CD5o. Оценка анти-ВИЧ активности препаратов. Оценку анти-ВИЧ активности исследуемых препаратов проводили по двум схемам, отличающимся временем внесения препаратов в суспензию клеток: а) одновременно с вирусом и б) после адсорбции вируса. Клетки МТ-4 с концентрацией 2x106 клеток/мл инфицировали стоком вируса с множественностью заражения 0.1 - 0.5 инфекционных единиц на клетку. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 ч. при 37С.
По окончании адсорбции суспензию инфицированных клеток разводили полной ростовой средой до посевной концентрации и вносили рабочие разведения препарата (по три повтора на каждое разведение) до конечной концентрации 0.00001 до 1 мкг/мл. Далее экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата; без вируса) образцы инкубировали, как описано выше и на 4-ые сутки культивирования учитывали долю жизнеспособных клеток в пробах и оценивали анти-ВИЧ активность препарата по снижению уровня накопления вирусного антигена р24 по сравнению с контролем. На основании полученных результатов строили дозозависимые кривые и рассчитывали количественные характеристики ингибирования репродукции ВИЧ-1 (Svinarchuk F.P. et al, 1993): ID5o - концентрацию соединения, на 50% подавляющую продукцию вируса; IS - индекс селективности - отношение токсичной дозы соединения CD50 к его эффеКТИВНОЙ ДОЗЄ Ш50- Уровень вируспродукции в экспериментальных и контрольных образцах оценивали путем количественного определения вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом (Покровский АГ. и др., 2001). Селекция фагов проводилась сотрудником института Биоинженерии ГНЦ ВБ «Вектор» Тумановой О.Ю. В работе использовали штамм E.Coli К91Кан и фаговые пептидные библиотеки fuse5-15mer и f88-4/15, любезно предоставленные Дж.Смитом, университет Миссури, Коламбия, США (Smith G.P., Petrenko V.A., 1997). Фаговые пептидные библиотеки содержали всевозможные пептиды длиной 15 аминокислот, которые были экспонированы на поверхности бактериофагов в составе минорного белка оболочки рШ (библиотека tuse5-15mer) и основного белка оболочки pVIII (f88-4/15).
Наработка индивидуальных клонов, титрование фагов проводили по схеме, описанной Смитом (Scott J.K., Smith G.P., 1990). Синтез коньюгатов ГК с бычьим сывороточным альбумином (БСА) Синтез конъюгатов ГК-БСА и иммуноферментный анализ проводился сотрудником лаборатории ретровирусов Федюк Н.В. (Федюк Н.В. и др., 2001). Для активации ГК к 45 мг кислоты добавляли 15 мг EDAC HC1 (N- этил-К диметиламинопропил-карбодиимид гидрохлорид), после этого проводили реакцию с 10 мг N-оксисукцинилимида в 0,5 мл диметил сульфоксида с образованием оксисукцинимида. Инкубировали 35 мин при комнатной температуре при перемешивании. К полученному раствору добавляли 40 мг БСА в 2,5 мл NaHC03 (0ДМ) и инкубировали 4 часа при 4 С. Затем реакционную смесь диализовали в течение 10 часов в КЬО, после чего лиофилизировали. Соотношение молекул БСА и ГК в конъюгате составило 1 к 11. Аффинную селекцию из библиотеки 88-4/15 с биотинилированным коньюгатом ГК с БСА проводили по руководству (Smith G.P., 1992). Было проведено четыре раунда селекции. Селекцию пептидной библиотеки fuse5-15mer и коньюгата ГК-БСА проводили в соответствии со схемой, описанной (Motti С. et al, 1994). Проводили два раунда аффинной селекции без амплификации между раундами. После каждого из раундов селекции получали фаговые колонии, которые использовались для наработки одноцепочечной ДНК и фагов для ИФА.
Исследование ингибирующей активности ГК и ее производных в отношении ОТ ВИЧ-1
Поскольку в литературе упоминается о тритерпенах, обладающих ингибирующей активностью в отношении ОТ, нам представлялось интересным проверить, может ли глицирризиновая кислота или ее производные также обладать такой активностью. Это позволило бы расширить знания о молекулярных механизмах анти-ВИЧ активности ГК.
Для этого исследования были выбраны: ГК (1а), ее аммонийная соль (глицерам) (16), пента-О-никотинат ГК (пента-О-никотинат ГК)(1в) и агликон ГК - глицирретовая кислота (1г), а также два ее аминокислотных производных (Ід, 1е) (Схема 1). В таблице 5 приведены концентрации исследованных соединений, блокирующих обратную транскрипцию, катализируемую ОТ дикого типа на 50% (15о).
Из данных, приведенных в таблице видно, что среди всех производных ГК наиболее эффективным ингибитором ОТ является пента-О-никотинат ГК (1в). Также высокую ингибирующую способность показали аминокислотные производные глицирретовой кислоты. Глицирретовая кислота (1г) и глицирам (16) тоже довольно активные ингибиторы хотя ингибируют ОТ в более высоких концентрациях. Как оказалось, ГК (1а) тоже оказывает действие на ОТ, хотя и самое слабое в этом ряду исследованных соединений. Тем не менее, т.к. раннее не было данных, что ГК может ингибировать ОТ ВИЧ-1, эти результаты оказались достаточно интересными.
Для дальнейшего исследования взаимодействия с ОТ были выбраны глицирретовая кислота и ее производные, а также пента-О-никотинат ГК. В таблице 6 приведены константы ингибирования данных соединений для различных форм ОТ. Полученные результаты показали, что глицирретовая кислота не ингибировала мутантные формы ОТ. Зато ее аминокислотные производные ингибировали все формы ОТ по неконкурентному типу.
Необходимо отметить, что исследование активности ОТ с использованием поли (гА)-олиго (dT) в качестве матрицы-праймера является не очень чувствительным методом из-за большого количества сайтов инициации транскрипции на матрице поли(гА). Однако это наиболее быстрый и эффективный способ определения ингибирующей активности соединений. Поэтому величины констант ингибирования азидотимидина для АЗТ-устойчивых форм ОТ отличаются не так сильно, как можно было ожидать, но это согласуется с литературными данными (Похолок и др., 1997). Исходя из этого факта, сравнение констант ингибирования лента-О-никотинат ГКа для обратной транскриптазы «дикого» типа и для ее мутантных форм показало, что пента-О-никотинат ГК более эффективно ингибирует АЗТ-устойчивые формы фермента с заменой в 215 позиции и с заменами в трех позициях. При этом константы ингибирования аминокислотных производных глицирретовой кислоты для ОТ дикого типа и ее мутантных форм не отличались.или были выше в случае АЗТ-устойчивых вариантов ОТ.
Таким образом, среди всех производных ГК, пента-О-никотинат ГК -самый активный ингибитор ОТ ВИЧ-1 и ее мутантных форм. Интерес к этому препарату обусловлен еще и тем, что пента-О-никотинат ГК является эффективным индуктором интерферона-гамма (Покровский А.Г. и др., 2003), что может существенно усилить его терапевтический потенциал при лечении ВИЧ-инфекции.
Противовирусная активность ГК и ее производных на культуре клеток. Более ранние исследования (Плясунова и др., 1992) продемонстрировали эффективность анти-ВИЧ действия в культуре клеток целого ряда производных ГК. Однако наиболее перспективным с точки зрения разработки отечественного препарата для лечения ВИЧ-инфекции, оказался пента-О-никотинат ГК. В сравнительных экспериментах при острой ВИЧ-инфекции в клетках МТ-4 было показано, что пента-О-никотинат ГК обладает более выраженными ингибирующими свойствами, чем уже известные ингибиторы ВИЧ - глицирризиновая кислота и моноаммонийная соль ГК.
Из данных, приведенных в таблице 7 видно, что концентрация пента-О-никотината ГК, вызывающая 50% подавление накопления вирусспецифического белка р24 (Ю5о) равна 9,64 мкМ, что существенно ниже, чем для самой ГК и моноаммонийной соли ГК. Несколько выше и индекс селективности (18=57), определяемый как отношение цитотоксической дозы (CD5o) к эффективной (ГЕ 5о). Важно подчеркнуть, что приведенные результаты касаются противовирусного действия данных соединений в эксперименте, когда препарат вносится уже после адсорбции вируса, то есть через час после инфицирования. Естественно, что те соединения, которые блокируют ранние этапы жизненного цикла ВИЧ, будут гораздо более эффективны при одновременном внесении с вирусом, как это показано для ГК, глицирретовой кислоты и ее производных (Плясунова и др., 1992).
Если сравнить данные таблиц 5 и 7, где приведены величины Ш50 для глицирама и пента-О-никотината ГК, то становится видно, что значения, полученные на культуре клеток и на изолированном ферменте для глицирама и пента-О-никотината ГК вполне сравнимы. Для глицирама значения Ш50 на культуре клеток 57 мкМ и Ізо для ОТ 60,4 мкМ. Для пента-О-никотината ГК 9,6 и 5,3 мкМ соответственно. Совместное ингибирование обратной транскриптазы ВИЧ-1 пента-О-никотинатом ГК и азидотимидином. Как упоминалось выше, комбинационная терапия приобретает все большее значение для лечения ВИЧ-инфекции. Для того чтобы правильно подобрать концентрации препаратов, используемых в комбинационной терапии, необходимо оценить природу взаимодействий между соединениями. В исследованиях на изолированном ферменте совместное действие препаратов нуклеозидной и ненуклеозидной природы, или двух ненуклеозидных ингибиторов ОТ может сильно отличатся от действия одного препарата. Термины «антагонизм», «суммация» или «синергизм» уже много лет употребляются в фармакологии и имеют несколько значений. В последнее время их употребляют при описании действия совместного ингибирования. Для корректного использования данных терминов необходимо найти способ выражать результаты количественно, в противном случае употребление специальных терминов будет неуместно. Считается, что антагонизм имеет место в тех случаях, когда два соединения оказывают меньший эффект, чем можно было ожидать на основании индивидуального действия каждого из них. Аналогичным образом синергизм определяется, когда эффект совместного действия двух ингибиторов оказывается больше ожидаемого.
Похожие диссертации на Изучение механизмов АНТИ-ВИЧ активности производных высших тритерпенов и хинонов
