Введение к работе
Актуальность темы
Вирус иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) - инфекционный агент, вызывающий Синдром Приобретенного Иммунодефицита человека (СПИД). Глобальная эпидемия СПИДа, которая распространяется вот уже более 30 лет, вовлекая в ряды инфицированных ежегодно более 2 миллионов человек, является серьезной проблемой мирового здравоохранения. По последним данным Всемирной Организации Здравоохранения, в мире число ВИЧ- инфицированных составляет около 34 млн. человек, причем количество вновь инфицированных продолжает расти и в 2010 году составило 2.7 млн., а число умерших - 1.8 млн. человек ().
В последние годы достигнуты значительные успехи в разработке новых терапевтических агентов и стратегии лечения ВИЧ-инфекции. Основными мишенями разрабатываемых лекарственных препаратов против ВИЧ-1 служат жизненно-важные ферменты вируса: обратная транскриптаза, протеаза и интеграза, — а также белки оболочки и рецепторы на поверхности Т-лимфоцитов. В период с 1987 г. по 2008 г. разрешено применение 18 лекарственных препаратов, ингибирующих обратную транскриптазу ВИЧ-1 — это нуклеозидные и ненуклеозидые ингибиторы, с 1995 по 2006 г.г. — 11 препаратов, ингибирующих протеазу, с 2003 по 2007 г.г. - 2-х препаратов, препятствующих проникновению вируса в клетку; в 2007 г. — ингибитор интегразы. В настоящее время в США официально используется около 30 различных терапевтических препаратов (. gov/oashi/aids). На начальной стадии лечения рекомендуется использовать комбинации одного или двух нуклеозидных аналогов, одного ненуклеозидого и/или одного ингибитора протеазы (. gov). Лекарственные препараты против ВИЧ-1 инфекции не могут излечить заболевание, однако существенно замедляют патологические процессы, улучшают качество жизни больных и снижают уровень смертности (Palella et al., 1998). В глобальном масштабе, постоянное расширение спектра анти-ВИЧ-1 препаратов, позволило достигнуть значительных успехов. Так, обеспечение лечением нуждающихся увеличилось с 7% в 2003 г. до 42% в 2008 г., передача вируса от матери ребенку была снижена за эти же годы с 90% до 55% ().
Несмотря на существенный прогресс в разработке и использовании лекарственных препаратов против ВИЧ-1, вызываемые ими побочные эффекты, а именно: непереносимость и токсичность при длительном применении, а также несоблюдение режима приема препаратов — сильно снижают эффективность их действия. Другая проблема связана с особенностями жизненного цикла вируса, обусловливающими высокую скорость его адаптации. Вирус
размножается в организме взрослого человека с высокой скоростью - до 10 вирусных частиц в день (Perelson et al., 1996). При этом уровень ошибок при обратной транскрипции
достигает 5х10 , - что приводит примерно к одной мутации на каждый цикл репликации (Mansky, 1996; Svarovskaia et al., 2003). Не стоит забывать, что ВИЧ-1 обладает весьма высокой частотой рекомбинации (Hu et al., 2003). Учитывая размер генома вируса (около 10000 нуклеотидов) при выполнении простых вычислений, можно предположить, что каждый день в организме взрослого пациента могут генерироваться все возможные точечные мутации, и в присутствии противовирусного препарата неизбежно произойдет отбор лекарственно- устойчивых вариантов вируса (Coffin, 1995). Дополнительные трудности в борьбе с инфекцией возникают из-за трансмиссии лекарственно-устойчивых штаммов ВИЧ, причем в отдельных регионах 10-20% вновь инфицированного контингента заражено именно такими штаммами (SPREAD Programme, 2008).
Около половины всех лекарственных препаратов против ВИЧ-1 ингибируют полимеразную активность обратной транскриптазы. Разработка лекарственных препаратов, направленных на специфическое блокирование активности вирусной РНКазы, продолжается не один год, но до сих пор не увенчалась успехом из-за их высокой токсичности (Schultz and Champoux, 2008). Используемые ингибиторы обратной транскриптазы подразделяют на две группы: нуклеозидные аналоги (NRTI), и ненуклеозидые аналоги (NNRTI).
Интенсивные исследования механизмов лекарственной устойчивости к ингибиторам обратной транскриптазы начались в 1987 году вскоре после внедрения первых антиретровирусных препаратов в клиническую практику. К началу данной работы было описано два основных механизма лекарственной устойчивости к нуклеозидным аналогам - дискриминация (Gao et al., 2000; Sarafianos et al., 1999) и фосфоролиз (Arion et al., 1998; Meyer et al., 1998). В соответствии с механизмом дискриминации лекарственно-устойчивые мутации образуют пространственные препятствия для включения трифосфорилированной формы ингибитора, NRTI-TP, в растущую ДНК-цепь. В соответствии с механизмом фосфоролиза лекарственно-устойчивые мутации обратной транскриптазы способствуют удалению 3'- терминирующего NRTI в присутствии физиологических концентрациий пирофосфата или ATP, который служит акцепторным субстратом реакции.
Несмотря на то, что описанные механизмы лекарственной устойчивости представляли обоснованную теоретическую и практическую базу, все предыдущие исследования
ограничивались только N-концевым участком фермента, содержащим его полимеразный домен. С-концевой район фермента при этом оставался мало изученным с этой точки зрения. Отчасти это было обусловлено ограничениями коммерческих генотипических и фенотипических тест-систем, не включающих этот район в стандартные тесты (Petropoulos et al., 2000; Shafer et al., 2001; Tural et al., 2002), вследствие чего исследователям была доступна весьма ограниченная информация о последовательности этого района обратной транскриптазы. Таким образом, для прогнозирования результатов лечения и развития антивирусных препаратов нового поколения, которые позволят значительно усовершенствовать стратегии лечения ВИЧ- инфицированных, необходимо понимание функционирования обратной транскриптазы как единого целого, поэтому более углубленное исследование свойств обратной транскриптазы и механизмов, лежащих в основе лекарственной устойчивости, является актуальной задачей.
Цель и задачи исследования
Настоящая работа посвящена изучению свойств обратной транскриптазы ВИЧ-1, обеспечивающих высокую адаптогенность вируса, а именно способности генерировать мутации и активно рекомбинировать, а также исследованию механизмов лекарственной устойчивости ВИЧ-1 к нуклеозидным и ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы, позволяющих вирусу избегать воздействия лекарственных препаратов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные
задачи:
Разработать ПЦР анализ, позволяющий определять количество копий специфической цепи ДНК вируса, реплицирующегося в культуре клеток и первичных лимфоцитах человека.
Проанализировать с его использованием ранее недоступные для анализа параметры обратной транскрипции ВИЧ-1: скорость синтеза «минус»-цепи вирусной ДНК, переноса «минус»- и «плюс»-цепи ДНК, инициации синтеза «плюс»-цепи ДНК.
Проанализировать влияние ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ-1 на синтез «минус»- и «плюс»-цепи ДНК.
Разработать новые тесты для определения частоты смены матрицы и частоты мутирования обратной транскриптазой ВИЧ-1 на культуре клеток.
Сконструировать мутантные вирусы и выявить функциональные и структурные детерминанты изменения частоты смены матрицы и частоты мутирования.
Исследовать влияние мутаций С-концевого района обратной транскриптазы на лекарственную устойчивость ВИЧ-1.
Сравнить лекарственную устойчивость референс-формы ВИЧ-1, принадлежащего подтипу В и CRF01_AE.
Сконструировать вирусы, содержащие обратную транскриптазу из вирусов пациентов, прошедших антиретровирусную терапию и наивных относительно лечения.
Проанализировать эти вирусы на чувствительность к ингибиторам обратной транскриптазы и провести сравнительный анализ последовательности обратной транскриптазы.
Идентифицировать мутации С-концевого района обратной транскриптазы из вирусов пациентов, ответственные за усиление лекарственной устойчивости.
Провести теоретическое обоснование механизма лекарственной устойчивости, обеспечиваемое новыми мутациями обратной транскриптазы.
Проверить основные положения предложенного механизма лекарственной устойчивости в экспериментах на культуре клеток и биохимических экспериментах.
Научная новизна и практическая значимость работы
Разработан новый ПЦР анализ для определения количества копий специфической ДНК цепи, представляющий собой уникальный подход к анализу репликации ВИЧ-1. С его использованием впервые определена скорость синтеза «минус»-цепи ДНК для ВИЧ-1 в культуре клеток и первичных CD4+Т клетках, а также скорость переноса «минус»- и «плюс»- цепи ДНК и инициации синтеза «плюс»-цепи ДНК; впервые показано ex vivo, что инициация «плюс»-цепи ДНК ВИЧ-1 осуществляется на множественных сайтах. Впервые показано влияние ингибиторов обратной транскриптазы на кинетику синтеза «минус»-цепи ДНК.
Впервые исследованы структурные детерминанты обратной транскриптазы ВИЧ-1, отвечающие за изменение частоты смены матрицы и частоты мутирования. Показано, что замедление полимеризации как путем воздействий химическими соединениями, так и при мутации определенных участков фермента, участвующих в связывании с субстратом, приводит к увеличению частоты смены матрицы; снижение активности РНКазы снижает частоту смены матрицы. Показана корреляция между изменением частоты смены матрицы и частоты мутирования.
Предложен и обоснован новый механизм лекарственной устойчивости к нуклеозидным и ненуклеозидным аналогам, обусловленный мутациями С-концевого района обратной транскриптазы, который отражает важную роль в лекарственной устойчивости ВИЧ-1 баланса между деградацией РНК-матрицы и NRTI-фосфоролизом /NNRTI-диссоциацией.
Впервые идентифицированы мутации в коннекторе обратной транскриптазы из вирусов пациентов, проходящих антивирусную терапию, которые обладают лекарственной устойчивостью как к NRTI, так и к NNRTI. Показано, что мутации коннектора ответственны за различия в лекарственной устойчивости референс-форм вируса, принадлежащего подтипу В и CEF01_AE.
Новый механизм лекарственной устойчивости прошел тестирование и подтверждение на культуре клеток с использованием модельных мутаций вируса, мутаций, идентифицированных в обратной транскриптазе от вирусов пациентов, а также на биохимическом уровне.
Положения, выносимые на защиту:
Новый ПЦР анализ позволяет определять количество копий специфической цепи ДНК ВИЧ-1, реплицирующегося в культуре клеток и первичных лимфоцитах человека.
Скорость синтеза «минус»-цепи вирусной ДНК ex vivo составляет 68-70 нуклеотидов в минуту, перенос «минус»-цепи ДНК - 4 минуты, инициации синтеза «плюс»-цепи ДНК на полипуриновом тракте - 9 минут, и перенос «плюс»-цепи ДНК - 26 минут.
Инициация синтеза «плюс»-цепи ДНК ВИЧ-1 осуществляется на множественных сайтах.
Ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 замедляют синтез «минус»-цепи ДНК.
Созданные нами новые тесты на культуре клеток позволяют определять частоту смены матрицы и частоту мутирования обратной транскриптазы ВИЧ-1.
Замедление полимеризации как путем воздействий химическими соединениями, так и при мутации определенных участков фермента, участвующих в связывании с субстратом, приводит к увеличению частоты смены матрицы; снижение активности РНКазы снижает частоту смены матрицы.
Мутации в захватывающем праймер участке РНКазы ВИЧ-1 не меняют частоту мутирования за исключением позиции Q475A (увеличение частоты мутирования в 2 раза), в то время как четыре аминокислотные замены (S557A, A558V, Q559L и Y586F) в обратной транскриптазе другого ретровируса - вируса лейкемии мыши (MLV), увеличивают частоту мутирования от 2.1 до 5.4 раз.
Мутации каталитически важных аминокислотных остатков РНКазы, а также захватывающего праймер участка РНКазы существенно снижают чувствительность вируса к ингибиторам обратной транскриптазы; сочетание этих мутаций с классическими лекарственно-устойчивыми мутациями ТАМ полимеразного домена приводит к кооперативному эффекту в увеличении лекарственной устойчивости к NRTI.
Мутации коннектора обратной транскриптазы селектируются в ответ на лечение NRTI и NNRTI и усиливают лекарственную устойчивость.
Мутации коннектора отвечают за различия в уровне лекарственной устойчивости референс-формы вируса подтипа В и CRF01_AE.
Мутации коннектора обратной транскриптазы обуславливают перекрестную устойчивость к разным классам ингибиторов обратной транскриптазы.
Молекулярный механизм лекарственной устойчивости к нуклеозидным и ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы, обусловленный мутациями С-концевого района обратной транскриптазы, отражает важную роль в лекарственной устойчивости ВИЧ-1 баланса между деградацией РНК-матрицы и NRTI-фосфоролизом/NNRTI-диссоциацией.
Апробация работы
Представленные в диссертации результаты были доложены на различных конференциях и симпозиумах, в том числе на: Международных симпозиумах HIV DRP Symposium on Antiviral Drug Resistance (США, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008), International HIV Drug Resistance Workshop: Basic Principles & Clinical Implications (США, Испания 2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009); 5th International Workshop on HIV Transmission (2009, Cape Town, South Africa); 13 th HIV Dynamics and Evolution Meeting (2006, Woods Hole, MA, USA); Международных конференциях Cold Spring Harbor Retroviruses Meeting (США 2002, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009), 47th InterScience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2007, Chicago, IL, USA), The Eleventh East Coast Retrovirus Meeting (2004, Palm Spring, CA, USA).
Работа выполнена в 2001-2011 годах в Национальном Институте Рака Национальных Институтов Здоровья США в рамках научного обмена и по грантам государственных научно- технических программ, а также в отделе биоинженерии ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». На разных этапах ее выполнения в ней приняли участие как научные консультанты V.K. Pathak, заведующий подразделением вирусных мутаций (Chief of Viral Mutation Section, HIV Drug Resistance Program, National Cancer Institute), J.M. Coffin, академик, профессор, советник директора программы лекарственной устойчивости ВИЧ-1 (Special Advisor to Director, Center for Cancer Research, National Cancer Institute), S.H. Hughes, директор программы лекарственной устойчивости ВИЧ-1 (Director, HIV Drug Resistance Program National Cancer Institute), а также K.A. Delviks-Frankenberry, Е.С. Сваровская, D.A. Thomas, J.L. Mbisa, Е.А. Воронин, R. Barr, R. B. Lengruber и другие сотрудники, которым автор приносит искреннюю благодарность. По материалам диссертации опубликовано 20 работ в научных журналах, две из которых были названы в числе 5 ключевых публикаций в данной области исследований (PLOS Мedicine, 2007 V 4(12), e346, p.2). Настоящая работа была отмечена дважды как выдающаяся Комитетом Национального Института Здоровья в 2007 и 2008 годах (Fellows Award for Research Excellence in Recognition of Excellence in Biomedical Research, National Institutes of Health), а также завоевала награды за лучшую презентацию в 2006 и 2007 годах (10th and 11th Spring Research Festival, NCI-Frederick, 2006 and 2007).
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из семи разделов: «Общая характеристика работы», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 182 станицах машинописного текста и включает 68 рисунков, 13 таблиц и список литературы, содержащий 308 ссылок.
