Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
Вирус простого герпеса первого типа: общая характеристика, жизненный цикл и репликация 7
Общая характеристика семейства Herpesviridae 7
Структура вириона ВПГ-1 10
Структура генома ВПГ-1 13
Жизненный цикл, экспрессия генов и репликация ВПГ-1 13
ДНК-полимераза ВПГ-1 20
Ингибиторы репликации вируса герпеса: клинические препараты и лабораторные разработки 22
Клинически одобренные антигерпетические препараты 22
Поиск новых антигерпетических препаратов 27
Материалы и методы 34
Клеточные культуры 34
Приготовление компетентных клеток Е. coli 35
Трансформация бактериальных клеток 35
Манипуляции сплазмидной ДНК 35
Выделение геномной ДНК 36
Полимеразная цепная реакция 36
Конструирование плазмид 36
Молекулярно-генетический анализ нуклеотидных последовательностей 39
Получение лабораторных клонов ВПГ-1 устойчивых к ACV (L2/R) и HpACV (1-7) .39
Экспрессия белка в клетках Е coli 40
Работа с клетками НЕК293Т 40
Трансфекция клеток НЕК293Т 40
Детекция целевой мРНК 40
Получение рекомбинантной бакмиды 41
Работа с клетками 5/9 41
Получение вирусных стоков 41
Экспрессия белка в клетках S/9 42
Очистка белка 42
Ингибирование реакции элонгации, катализируемой ДНК-полимеразой ВПГ или ОТ ВИЧ 42
Субстратная специфичность ДНК-полимеразы ВПГ 43
Субстратная специфичность ОТ ВИЧ 43
Результаты и обсуждение 43
Молекулярно-генетический анализ ДНК-полимераз и тимидинкиназ из клинических и лабораторных изолятов ВПГ-1 44
Филогенетический анализ 46
Чувствительность штаммов к антигерпетическим агентам 46
Мутации в тимидинкиназе 49
Мутации в ДНК-полимеразе 52 Экспрессия и выделение ДНК полимеразы ВПГ 59
Экспрессия ДНК-полимеразы ВПГ в прокариотических системах 60
Экспрессия и выделение ДНК-полимеразы ВПГ в бакуловируснои системе 61
Поиск новых антигерпетических препаратов 67
Антигерпетическая активность фосфонатных аналогов нуклеозидов 67
Ингибирование ДНК-полимеразы ВПГ 2Т-нуклеотидами 70
Антигерпетическая активность производных триазинов 72
Выводы 76
Список литературы 77
- Общая характеристика семейства Herpesviridae
- Трансформация бактериальных клеток
- Получение рекомбинантной бакмиды
- Чувствительность штаммов к антигерпетическим агентам
Общая характеристика семейства Herpesviridae
Вирион представляет собой сферу диаметром 186 нм, а с учётом гликопротеиновых выступов - 225 нм. Нуклеокапсид расположен не в центре вириона, а в непосредственной близости от внешней оболочки с одной стороны (проксимальный полюс) и на расстоянии 30-35 нм от неё с другой стороны (дистальный полюс). В тегументе были обнаружены структурированные части с филаментами диаметром 7 нм, примыкающими к мембране.
В состав вириона входят 40 белков как вирусного, так и клеточного происхождения, десять из которых гликозилированы; одиннадцать белков находятся на поверхности вириона.
Кор содержит двухцепочечный геном в форме тороида. Небольшое количество вирусной ДНК может находиться в кольцевой форме. Полиамины спермин и спермидин клетки-хозяина входят в состав кора и выполняют функцию нейтрализации отрицательного заряда ДНК и обеспечения её правильного фолдинга. В вирионе содержится около 70000 и 40000 молекул спермина и спермидина, соответственно. Полиамины прочно связаны с вирусной ДНК и не обмениваются при добавлении извне радиоактивномеченных полиаминов. Разрушением внешней оболочки детергентами и мочевиной можно удалить из вириона спермидин, но не спермин. В последнее время полиамины, включая модифицированные полиамины, рассматривают как потенциальные регуляторы и ингибиторы некоторых вирусных инфекций. Показано, что конъюгированные с декстраном полиамины, в частности, декстран-пропан-1,3-диамин, способны подавлять развитие ВПГ-1 в клеточной линии BS-C-1 (17).
В состав тегумента входят около 26 белков, некоторые из которых участвуют в транспорте капсида к ядру клетки и другим органеллам (UL36, UL37, ІСР0) (18), проникновении вирусной ДНК в ядро (VP1-2, UL36) (19), активации транскрипции ранних вирусных генов (VP16, кодируемый геном UL48) (20), подавлении клеточного белкового синтеза и деградации мРНК (VHS, UL41) (21). Очищенные вирионы содержат клеточные и вирусные транскрипты, которые предположительно находятся в тегументе (поскольку именно там имеются три РНК-связывающих белка - US11, UL47 и UL49).
Капсид имеет форму икосаэдра и состоит из 162 элементов, называемых капсомерами (Рис. 1А), 150 из которых имеют форму шестиугольника - гексамеры, и 12 пятиугольника - пентамеры.
В инфицированной клетке могут присутствовать три формы капсида: А, В и С. В А-капсидах, которые также называют прокапсидами, отсутствует ДНК; В-капсид содержит белковый каркас для ДНК, но не содержит самого генома; С-капсид содержит вирусную ДНК (22,23).
В состав любого типа капсида ВПГ-1 входят четыре белка: основной белок капсида UL19 (VP5), капсомер-связывающий белок UL35 (VP26), а также белки UL18 (VP23) и UL38 (VP19C), функции которых до конца не определены. Каждый шестигранный капсомер содержит шесть копий белка VP5, пятигранный - пять. По шесть копий белка VP26 находятся на каждом шестигранном капсомере, образованном копиями белка VP5. Две копии белка VP23 и одна копия VP19C образуют псевдотример, каждая субъединица которого взаимодействует с двумя капсомерами, таким образом, связывая их. В центре каждого капсомера располагается канал, соединяющий внешнюю поверхность вириона с ДНК кором. Диаметр канала в гексамерах составляет четыре нанометра, в пентамерах он несколько уже, а в случае В-капсида пентамерный канал полностью закрыт. Капсид содержит также белок UL6, который образует вокруг одной из 12 осей капсида «портал» (Рис. 1А), через который предположительно упаковывается вирусный геном (24), и протеазу VP24 (UL26), разрушающую каркас в процессе упаковки.
Внешняя оболочка вириона состоит из липидного бислоя и приблизительно 11 экспонированных гликопротеинов (gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl, gj, gK), и двух погруженных гликопротеинов gL и gM (Рис. 1А) (25). Внешняя оболочка содержит также как минимум два негликозилированных мембранных белка (UL20, US9). Оболочка формируется из плазматической клеточной мембраны при выходе вириона посредством экзоцитоза. В настоящий момент активно исследуется роль гликопротеинов вирусной оболочки в проникновении вируса в клетку. Структура генома ВПГ-1
Большая часть генома ВПГ-1 (номер в базе GeneBank Х14112) (рис. 1Б) представляет собой линейную двухцепочечную GC-богатую ДНК длиной 152261 п.о. (G+C - 68%) (26). Концы генома, вероятно, соединены или расположены близко друг от друга, поскольку небольшая фракция упакованной ДНК - кольцевая или приобретает кольцевую форму в отсутствие белкового синтеза после проникновения в ядро инфицированной клетки.
Геном ВПГ-1 состоит из двух больших уникальных последовательностей, длинной (long, UL) И короткой (short, Us), разделённых инвертированными повторами. Повторы, которые окружают длинную часть генома, называют ab и а Ь , а те, которые окружают короткую, - ас и а с (Рис. 1Б).
Благодаря наличию инвертированных повторов L и S элементы генома могут быть по-разному ориентированы друг относительно друга. Таким образом, геном В11Г-1 состоит из 4-х линейных изомеров. Однако показано, что ни наличие, ни отсутствие инвертированных повторов, ни ориентация L и S элементов генома не влияют на жизнеспособность вируса в культуре клеток Vero (27).
Геном ВПГ-1 кодирует около 90 транскрипционных единиц, и как минимум 84 из них кодируют белки. За редким исключением один транскрипт кодирует один белок и не содержит интронов. Некоторые транскрипты не кодируют белки, из них наиболее изучены транскрипты, связанные с латентностью вируса (LAT) (28) и закодированные в участке oriS регуляторные микроРНК (29).
На разных этапах инфекции ВПГ-1 экспрессирует различные гены, которые последовательно регулируют экспрессию друг друга. По этому признаку их подразделяют на три основных класса: а - очень ранние, Р - ранние и у - поздние гены (30). Очень ранние гены а локализованы на краях L и S компонент генома. Гены а0 и а4 расположены в инвертированных повторах L и S компонент, соответственно (31).
Жизненный цикл, экспрессия генов и репликация ВПГ-1 Жизненный цикл вируса можно разделить на несколько основных этапов: проникновение в клетку, экспрессия вирусных генов, репликация, сборка вириона и высвобождение нового поколения вирусных частиц (Рис. 2А). В чувствительных к вирусу клеточных линиях этот цикл проходит за 18-20 часов. В настоящее время предложено два механизма проникновения ВПГ-1 в клетку-реципиент (Рис. 2А). Основной механизм предполагает слияние вирусной оболочки с плазматической мембраной и дальнейший транспорт вирусного капе ид а в ядро. Ключевой стадией этого процесса является взаимодействие гликопротеинов на поверхности вирусной частицы со специфическими рецепторами на поверхности клетки. Вспомогательный путь проникновения вируса в клетку основан на эндоцитозе покрытого оболочкой вириона и последующем слиянии оболочки с внутриклеточными пузырьками (везикулами) (32).
Связывание вирусной частицы с поверхностью клетки происходит за счёт образования комплексов вирусных гликопротеинов gC и gB с гликозаминогликанами клеточной поверхности, а именно с гепарансульфатом (33).
Для проникновения вируса в клетку-хозяина путём слияния внешней оболочки вируса и плазматической мембраны необходимо взаимодействие четырёх гликопротеинов: gD, gB и гетеродимера gH/gL (34,35). Гликопротеин gD может связываться с тремя видами рецепторов: нектинами 1 и 2, медиатором проникновения вируса герпеса (HVEM) и 3-О-сульфатированным гепарансульфатом (3-OS-HS), модификацию которого осуществляют 3-О-сульфотрансферазы 2-7 (3-OST) (32), что делает их привлекательными терапевтическими мишенями для создания антигерпетических препаратов (36).
Кроме связывания gD с клеточными рецепторами, он запускает процесс слияния мембран путём передачи сигнала на комплекс gB и gH/gL. Окончательный механизм и все действующие лица этого процесса не установлены, однако известно, что N-концевой участок gD взаимодействует с клеточными рецепторами, в результате чего высвобождается С-концевой домен, связывающийся и активирующий запуск слияния мембран комплексом gB и gH/gL. В несвязанном с лигандом состоянии С-концевой домен gD заблокирован (34). Интересной дополнительной функцией gD является его способность подавлять апоптоз инфицированной клетки (37). Для проникновения вируса в клетку необходимо также взаимодействие gB с парным Ig-подобным рецептором типа 2 a (PILRa). Добавление антител к этим рецепторам подавляет инфекцию в культуре клеток (38).
Трансформация бактериальных клеток
При лечении больных, инфицированных ВПГ-1, используют ряд препаратов, из которых наиболее известен ацикловир (см. Обзор литературы). Однако при длительном применении этого лекарственного препарата даже у пациентов со здоровым иммунитетом возникают резистентные к нему штаммы (113), и тогда медикаментозное лечение пациентов становится неэффективным. У иммунодефицитных пациентов, в том числе инфицированных ВИЧ или перенесших пересадку костного мозга, устойчивые к ACV изоляты ВПГ-1 встречаются гораздо чаще (7-30%) (8,114). Количество ACV-устойчивых штаммов постоянно растет.
Механизм действия ACV основан на его фосфорилировании вирусной тимидинкиназой с образованием соответствующего ACVMP и последующем фосфорилировании клеточными киназами до ACVTP. ACVTP является субстратом вирусной ДНК-полимеразы, которая включает ACVMP в цепь синтезируемой вирусной ДНК и терминирует ее синтез (115). Устойчивость к антивирусным препаратам связана с однонуклеотидными или протяжёнными делециями, инсерциями и другими мутациями в генах ключевых ферментов метаболизма препаратов, которые могут приводить к аминокислотным заменам и мутантным формам белка. Результатом этого, в свою очередь, является одно из следующих событий, либо их сочетание: (а) полная потеря активности вирусной тимидинкиназы (116), изменение субстратной специфичности или понижение уровня экспрессии вирусной тимидинкиназы (117); (б) понижение активности вирусной ДНК-полимеразы или изменение её субстратной специфичности (118). В 95% случаев устойчивость ВПГ-1 к ACV обусловлена мутациями в гене тимидинкиназы и только в 5% - мутациями в гене ДНК-полимеразы (119). Существуют вирусы, в которых мутированы оба гена (9).
Одним из методов выявления причин потери антивирусной активности препарата является картирование мутаций в генах ДНК-полимераз и тимидинкиназ впг.
В генах тимидинкиназы и ДНК-полимеразы штаммов ВПГ, резистентных к ацикловиру и другим препаратам, выявлено огромное количество мутаций, которые вместе или по отдельности ответственны за возникновение лекарственной устойчивости. Целью первой части нашей работы являлось выявление причин резистентности ряда клинических и лабораторных изолятов ВПГ-1 к ACV, Н-фосфонату ацикловира (HpACV), фоскарнету (ненуклеозидному ингибитору репликации ВПГ) и другим антигерпетическим препаратам путём анализа мутаций в генах ДНК-полимераз и тимидинкиназ (рис. 10 (Ь)). фосфонат ацикловира был выбран для анализа из-за его необычных свойств. Как указывалось в литературном обзоре, это соединение подавляет как ACV-чувствительные, так и штаммы с дефектной тимидинкиназой, являющиеся ACV-резистентными при этом его концентрация была всего в два раза выше, чем в случае ацикловир-чувствительных изолятов (в аналогичных экспериментах концентрация ацикловира, ингибирующая эти изоляты, увеличивалась почти в 500 раз) (120). Таким образом, его действие не зависит от вирусной тимидинкиназы. При этом появление резистентных к HpACV изолятов отмечалось через восемь пассажей, в то время как резистентность к ацикловиру была обнаружена через четыре пассажа, причем диапазон применяемых концентраций веществ для получения резистентных штаммов составлял для HpACV 100 - 800 мкг/мл, а для ACV 2,5 - 100 мкг/мл. Кроме того, соединение понижало вероятность летального исхода для инфицированных ВПГ лабораторных животных (95). Соединение интересно также и тем, что подобно ацикловиру проявляет синергидный эффект в комбинации с интерфероном а (121). Эти результаты показывают, что резистентность к HpACV возникает существенно медленнее и при более высоких концентрациях по сравнению с ACV, что указывает на отличный от ацикловира механизм подавления ВПГ-1. Эти данные заинтересовали нас, и мы решили сравнить мутации, возникающие в ДНК-полимеразе и тимидинкиназе ВПГ-1 при пассировании вируса в присутствии HpACV с мутациями, появляющимися при пассировании в присутствии ACV.
Институтом вирусологии им. Д. И. Ивановского для анализа мутаций нам были любезно предоставлены лизаты следующих штаммов ВПГ-1: чувствительного к ацикловиру штамма L2, который используют в качестве эталонного на территории РФ (122), лабораторного клона Ьг/R, глубоко резистентного к ацикловиру, полученного пассированием инфицированных вирусом клеток в присутствии ACV, четырёх клинических изолятов, устойчивых к ACV (Avd, Tot, Sha, Che), и семи лабораторных клонов ВПГ, полученных пассированием в присутствии HpACV. Из лизатов мы выделяли геномы, амплифицировали с помощью ПЦР гены ДНК-полимеразы и тимидинкиназы, клонировали их в вектор pGEM, секвенировали и анализировали нуклеотидные и аминокислотные замены в ДНК-полимеразах и тимидинкиназах. Филогенетический анализ
С помощью программы Blast и Clustal W2 (123) был проведён филогенетический анализ и установлена степень гомологии клинических изолятов и лабораторных клонов со штаммом Z H описанными в литературе штаммами ВПГ-1 17, F, Kos и Angelotti, чувствительными к ACV. Консервативные участки гена ДНК-полимеразы штамма L-2 полностью гомологичны аналогичным структурам из описанных ранее штаммов 17, F, Kos и Angelotti. Филогенетическое древо демонстрирует минимальное изменение нуклеотидной последовательности изолятов Tot, Avd, Sha и Che относительно штамма L-2, то есть нуклеотидные последовательности ДНК-полимераз из клинических изолятов ближе к лабораторному штамму ВПГ-1 L-2, чем к какому-либо из изученных штаммов (рис. 10). В дальнейшем положения мутаций в этих штаммах определяли относительно штамма L-2.
Получение рекомбинантной бакмиды
Характеристики белка совпадали с описанными в литературе. Молекулярный вес белка составлял 136 кДа, фермент катализировал реакцию полимеризации на активированной ДНК в присутствии высокой концентрации соли (150 мМ (NH SC ), при которых активность других ДНК-полимераз ингибируется. Также для подтверждения свойств ДНК-полимеразы вируса герпеса в реакцию вносили ACVTP. Соединение эффективно ингибировало реакцию полимеризации (ECso 3 мкМ).
Аналогичные исследования были проведены с делетированным мутантом. Однако, когда фермент был экспрессирован, была опубликована работа (75), в которой для очистки фермента был использован гексагистидиновый фрагмент, предложенный нами ранее (153) и было показано, что наличие концевого фрагмента необходимо для полноценной репликации вируса in vivo, предположительно в связи с ассоциацией ДНК-полимеразы с репликативной вилкой за счёт взаимодействия с третьим, неизвестным, партнёром. Пре-ІМНг-домен не оказывает влияния на 5 -3 -полимеразную активность ДНК-полимеразы ВПГ или на ассоциацию с фактором процессивности UL42 in vitro. В связи с этим дальнейшая работа по изучению функций делетированной полимеразы ВПГ была приостановлена.
Таким образом, показано, что выход ДНК-полимеразы вируса герпеса при экспрессии в прокариотическои системе даже при использовании самых современных методик невысок. В бакуловирусной системе белок выделяется с достаточным выходом ( 10 мкг из 1x10 клеток), а использование гексагистидинового тэга, предложенное нами (153), позволяет существенно упростить методику выделения белка и уже используется другими научными лабораториями для получения мутантных форм ДНК-полимеразы ВПГ-1 (75).
Поиск новых антигерпетических препаратов Мы проанализировали три класса новых соединений, которые ранее не рассматривались, как потенциально подавляющие развитие вируса герпеса. Это фосфонатные аналоги нуклеозидов, производные 1,2,4-триазолазина, 2 -фторпроизводные нуклеозидов. Мы исследовали подавление репликации вируса в клеточной системе Vero, а также взаимодействие трифосфатов и дифосфатов фосфонатов нуклеозидов с ДНК-полимеразой вируса герпеса.
Антигерпетическая активность фосфонатных аналогов нуклеозидов В настоящее время в клинике используется три фосфонатных производных ациклических нуклеозидов, которые активируются в клетке, минуя стадию первичного фосфор илирования: аналог цитидина сидофовир, используемый для лечения цитомегаловирусной инфекции, и аналоги аденина адефовир и тенофовир, применяемые в терапии гепатита В и ВИЧ, соответственно. Таким образом, и антигерпетическое действие фосфонатных производных ACV и других нуклеозидов представляет определенный интерес.
Ранее в нашей лаборатории была исследована способность ДНК-полимеразы ВПГ-1 утилизировать различные модифицированные нуклеотиды, в том числе ациклические и модифицированные по а-фосфатной группе (154). В лаборатории были синтезированы фосфонатные (Z)- и (Е)-изомеры 9-[3-(фосфонометоксипроп)-1-ен-1-ил] аденина и карбоциклический аналог гуанозина (рис. 20) (155).
Совместно с институтом вирусологии им. Д. И. Ивановского было показано, что ациклические фосфонатные аналоги аденина (рис. 20, а и Ь) ингибировали репликацию ВПГ-1 в культуре клеток Vero. Z-изомер являлся эффективным ингибитором репликации ВПГ. Ингибирующая доза на клетках Vero составляла 95 мкМ. Хотя концентрация Z-изомера (а), подавляющая развитие вируса на 50% (ICso), была ниже концентрации ACV, он подавлял развитие ACV-резистентного штамма. Интересным свойством этого соединения была способность подавлять репликацию вируса иммунодефицита человека в культуре клеток при концентрациях более низких, чем концентрации известного ингибитора ВИЧ РМЕА ({[2-(6-амино-9і7-пурин-9-ил)этокси] метил }фосфоновая кислота), который проходил клинические испытания как анти-ВИЧ препарат. Активность Е-изомера (Ь) в аналогичных экспериментах была существенно ниже (таблица 7).
Оба изомера подавляли резистентные к ацикловиру штаммы вируса, дефицитные по тимидинкиназе, так как для их активации не требуется первой стадии фосфорилирования.
Соединение Антигерпетическая активность в клетках Vero, мкМ Анти-ВИЧ активность CEMss, ВПГ-1/Ь2 впг-1/ACVR мкМ CD50 ID50 ID50 CD50 ID50 Z-изомер (а) 3100 95 106 3300 81 Е-изомер (Ь) 3100 387 437 3300 660 Вещество (с) Не активно ACV 2200 1.7 530 Не активен РМЕА 344 80 77 2860 182 CD50 - цитотоксическая доза - концентрация соединения, вызывающая гибель 50% клеток, ID50 - ингибирующая доза - концентрация соединения, уменьшающая индуцированный вирусом цитопатический эффект на 50%. Следует отметить, что оба соединения проявляли токсичность в 1,5 и 10 раз меньшую, чем ацикловир и РМЕА, соответственно, что делает их привлекательными в качестве потенциальных антигерпетических препаратов. Для установления механизма действия и причин низкой токсичности этих соединений в нашей лаборатории были синтезированы и изучены в качестве субстратов ДНК-полимеразы ВПГ, обратной транскриптазы ВИЧ и ДНК-полимеразы а из плаценты человека их дифосфаты. Выбор ферментов определялся следующими обстоятельствами. Во-первых, ВПГ, как указывалось ранее, в 70-90% случаев сопровождает ВИЧ-инфекции и осложняет лечение пациентов, поэтому лекарственные препараты, подавляющие оба вируса, весьма привлекательны. Во-вторых, взаимодействие 5 -трифосфатов нуклеозидных аналогов с ДНК-полимеразами клетки, в частности с ДНК-полимеразой а, часто является причиной их токсичности. На рис. 20 представлено включение дифосфатов синтезированных соединений в 3 -конец праймера в праймер-матричной системе ДНК-полимеразой ВПГ-1, ДНК-полимеразой а человека (А) и обратной транскриптазой (ОТ) ВИЧ (Б). Видно, что соединения (а) и (Ь) были субстратами, как ОТ ВИЧ, так и ДНК-полимеразы вируса герпеса, включались в З -конец праймера и терминировали дальнейшую элонгацию (рис. 21). Сравнение интенсивности полос, расположенных выше праймера, при одинаковой концентрации субстратов показывает, что дифосфат соединения (а) более эффективный субстрат по сравнению с дифосфатом (Ь) для обоих вирусных ферментов, но не является субстратом ДНК-полимеразы а человека. Эти данные хорошо коррелируют с результатами, полученными на клеточных культурах (Таблица 7). Дифосфат соединения (с) не являлся субстратом ДНК-полимеразы ВПГ и не ингибировал синтез ДНК. Полосы, находящиеся ниже праймера, в случае ДНК-полимеразы ВПГ появляются в результате 3 -5 -экзонуклеазной активности фермента (153). Таким образом, механизм действия данных соединений заключается в их фосфорилировании до дифосфатов фосфонатов, которые избирательно включаются в цепи ДНК вируса герпеса и ВИЧ и терминируют их синтез.
Чувствительность штаммов к антигерпетическим агентам
Полученные соединения являются одним из немногих описанных в литературе примеров соединений, которые одновременно подавляют репликацию, как ВИЧ, так и вируса герпеса и не оказывают влияния на развитие клеток-хозяев. Важным преимуществом этих соединений является также подавление резистентных к ацикловиру штаммов ВПГ-1.
Ингибирование ДНК-полимеразы ВПГ 2Т-нуклеотидами В литературе описано огромное количество производных нуклеозидов, содержащих в различных положениях атом фтора. Многие из них обладают противовирусной и противораковой активностями. В терапии ВИЧ широко используется 5-фторламивудин, в нескольких работах описаны 2 -фтор-Р-0-арабинонуклеозиды, которые обладают активностью против вирусов гепатита С, ВИЧ и герпеса (156,157). Ранее сообщалось, что 2 F-C, подавляет рост ВПГ-1 в культуре клеток, но с меньшей эффективностью, чем ACV. Однако авторам не удалось показать включение 2 F-C в цепь вирусной ДНК, катализируемое ДНК-полимеразой ВПГ. но но но
Фторпроизводные NTP исследованы как ингибиторы включения [a- P]dATP в активированную ДНК в реакциях, катализируемых ОТ ВИЧ и ДНК-полимеразой ВПГ-1. Мы показали, что 2 F-ATP (рис. 22а) ингибирует реакцию элонгации, катализируемую ДНК-полимеразой ВПГ-1 с ЕСад =15 мкМ и ОТ ВИЧ с ЕС50 более 100 мкМ (рис. 23).
Фторпроизводные нуклеозидтрифосфатов как ингибиторы вирусных полимераз. Концентрационные зависимости ОТ ВИЧ и ДНК-полимеразы ВПГ-1 включения [а- Р]АТР в активированную ДНК от концентрации 2 F-ATP.
Нами была протестирована способность ДНК-полимеразы ВПГ-1 утилизировать 2 F-NTP в качестве субстрата.
Было также показано, что 2 F-NTP являются субстратами ДНК-полимеразы ВПГ и ОТ ВИЧ. В случае ОТ ВИЧ синтез ДНК может продолжаться в присутствии 2Т-производных до образования полноразмерных продуктов. Включение 2 F-dNTP в праймер-матричный комплекс, катализируемое ДНК-полимеразой ВПГ показано на рис. 24. ДНК-полимераза ВПГ-1 включает 2 F-CMP (рис. 22Ь) в праймер-матричный комплекс, хотя и с меньшей эффективностью, чем dCMP (треки 3-5 и 1-2, соответственно). После включения 2 F-CMP цепь может элонгироваться природным dGMP (треки 6-7). Однако после включения второго 2 F-CMP согласно контексту матрицы синтез ДНК практически останавливается (трек 9). Синтез ДНК в присутствии четырех природных dNTP показан на треке 8 (158).
Рис. 24. Катализируемое ДНК-полимеразой ВПГ-1 включение 2 F-NTP в 3 -конец праймера. Реакционная смесь содержит: 5 или 20 мкМ dCTP (дорожки 1 и 2); 5, 20 или 50 мкМ 2 F-CTP (дорожки 3-5); элонгация 2 F-CMP на 3 -конце праймера при добавлении 20 или 40 мкМ dGTP (дорожки 6 и 7); элонгация праймера при добавлении четырех dNTP (дорожка 8); элонгация 2 F-CMP на 3 -конце праймера при добавлении dATP, dGTP и ТТР (25 мкМ каждого; дорожка 9). Положение 19-членного праймера показано на дорожке 10.
Антигерпетическая активность производных триазинов В литературе описаны 6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7(4Н)-оны, обладающие широким антивирусным действием. Например, нуклеозидные аналоги имидазоло[2,1-с]пиримидин-5-онов обладали активностью против гепатита В, а 1,2,4-триазоло[1,5-с][1,2,4]триазины были активны против некоторых штаммов вируса гриппа А и Б, а 6-арилазоло[1,5-с]пиримидин-7-оны были запатентованы как эффективные агенты против гепатита С (159). Однако антигерпетические свойства этих соединений не были описаны. Достоинством этих соединений является устойчивость и в щелочных, и в кислых средах, что существенно для синтеза соответствующих трифосфатов.
Совместно с Институтом органического синтеза им. И. Я. Постовского (Екатеринбург) нами были изучены ациклические производные 1,2,4-триазоло[1,5 а]пирмидин-7-онов как ингибиторы репликации ВПГ-1 в культуре клеток Vero (160), а некоторые их трифосфаты как ингибиторы ДНК-полимеразы ВГП. Структурные формулы соединений приведены на рис. 25.
Трифосфат соединения Зс (рис. 25), несущий метилтио-группу, наиболее эффективно ингибировал включение радиоактивномеченного dAMP в 3 -конец праймер-матричного комплекса с IC50 =100 мкМ (таблица 9). Данные коррелируют с результатами экспериментов на клеточной культуре. Ингибирующая способность производных триазолоазина была сопоставима с таковой стандартных ингибиторов герпесной ДНК-полимеразы ацикловира и фоскарнета (160).
На основании полученных результатов можно предположить, что одной из мишеней этих соединений является герпесвирусная ДНК-полимераза. Неизвестно, являются ли они ингибиторами нуклеозидного типа и связываются с активным центром фермента, или ненуклеозидного и связываются с ферментом вне активного центра. Испытанные соединения представляют собой новый перспективный тип ингибиторов вируса герпеса.
Таким образом, нами были исследованы несколько групп интересных соединений, некоторые из которых проявляли выраженную антигерпетическую активность на культурах клеток, а их трифосфаты подавляли синтез ДНК, катализируемый не только ДНК-полимеразой ВПГ-1, но и ОТ ВИЧ. Существенно, что некоторые из синтезированных соединений были активны против резистентных штаммов ВПГ-1. Таким образом, они могут рассматриваться, не только как потенциальные антигерпетические препараты, но и как противовирусные препараты комбинированного действия.
