Введение к работе
Актуальность проблемы
Рак представляет собой одну из наиболее серьезных проблем медицины: он занимает второе место по смертности в мире и, по прогнозам, имеет перспективу перейти на первое. Генная терапия рака, в основе которой лежит доставка генов в опухоль, вызывающих ингибирование роста или гибель клеток опухоли, в настоящее время - одно из наиболее активно развивающихся направлений. Одной из важных стратегией генной терапии злокачественных новообразований является терапия с использованием, так называемых, генов-убийц (генная хирургия). Генная хирургия направлена на уничтожение опухолевых клеток, путем использования их свойств, которые характерны для всех раковых клеток, например, повышенная скорость митотических делений. Подход заключается в доставке в раковые клетки генов-убийц, кодирующих фермент, как правило, вирусного или бактериального происхождения, который в клетках, где он экспрессируется, модифицирует свой субстрат, превращая его из нетоксичного пролекарства в токсичный для клетки метаболит.
Генная хирургия является двустадийной. На первом этапе в опухолевые клетки вводится ген-убийца с требуемой системой экспрессии (Рис.1), на втором вводят пролекарство, которое под действием фермента, образующегося в результате экспрессии гена-убийцы, превращается в токсин внутри раковых клеток, что резко уменьшает токсичность терапии. Токсин может высвобождаться из клетки, экспрессирующей ген-убийцу, и проникать в соседние клетки, вызывая их гибель, что многократно усиливает терапевтический эффект. Данное явление получило название «эффекта свидетеля» (bystander effect). «Эффект свидетеля» заключается в том, что опухолевые клетки, не получившие ген-убийцу, но соседствующие с таковыми, оказываются подверженными цитотоксическому эффекту со стороны высвобождающегося токсина. Наиболее перспективными в настоящее время являются две системы ген-убийца/пролекарство, обладающие «эффектом свидетеля» и достигшие поздних стадий клинических испытаний: тимидинкиназа вируса простого герпеса (HSVtk)/raHUH^OBHp(GCV) и цитозиндезаминаза/5-фторцитозин.
Эффективность системы HSVtk/GCV для лечения широкого спектра опухолей была показана в экспериментах на животных. Однако в клинических испытаниях на пациентах пока получают худшие результаты, чем на животных. В значительной степени это связано с недостаточно высокой специфичностью экспрессии терапевтических генов в раковых клетках и с недостаточно высоким уровнем «эффекта свидетеля» при проведении испытаний на пациентах. «Эффект свидетеля» может быть дополнительно усилен за счет работы иммунной системы, поскольку гибель раковых клеток и высвобождение из них опухолевых антигенов
активируют способность иммунной системы уничтожать раковые клетки, которые не экспрессируют ген-убийцу.
Таким образом, эффективность действия системы ген-убийца/пролекарство можно повысить, стимулируя противоопухолевый иммунный ответ, например, с помощью цитокинов. В ряде работ показано, что регрессия опухоли значительно возрастает при совместном использовании гена-убийцы и отдельно вводимого в виде белка цитокина, в частности, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ или GM-CSF). В некоторых исследованиях продемонстрировано развитие специфического противоопухолевого иммунитета после совместной экспрессии двух отдельных генов HSVtk и GM-CSF в клетках опухоли. Предполагается, что совместная экспрессия гена-убийцы и GM-CSF в клетках опухоли будет приводить к уничтожению раковых клеток и высвобождению из них опухолевых антигенов, которые будут эффективно представляться ГМ-КСФ-активированными антиген-представляющими клетками Т-клеткам иммунной системы, обеспечивая активацию специфического противоопухолевого иммунитета, в результате чего возрастет гибель опухолевых клеток и снизится вероятность возникновения метастазов.
Одним из важных элементов успеха генной терапии рака является система контроля экспрессии терапевтических генов. В генных противораковых препаратах, предназначенных для внутривенного введения, экспрессия терапевтического гена должна контролироваться опухолеспецифичным промотором. В идеальном случае опухолеспецифичный промотор должен обеспечивать максимально тканеспецифичную и достаточно сильную экспрессию трансгена, чтобы с одной стороны обеспечить безопасность, а с другой - эффективность системы. Обычно используемые для этих целей природные опухолеспецифичные промоторы значительно слабее, чем конститутивные промоторы, такие как промоторы цитомегаловируса (CMV) или вируса SV40. Они активны в ограниченном числе типов раковых клеток, и их активность сильно варьирует в разных опухолях, затрудняя подбор доз пролекарства и снижая терапевтический эффект. Например, сравнительно сильные опухолеспецифичные промоторы с достаточно широким спектром активности, такие как промотор гена BIRC5 (hSurv), кодирующего ингибитор апоптоза сурвивин и промотор гена обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT) проявляют ее не во всех раковых клетках. При этом наблюдается значительная вариабельность относительной активности данных промоторов в различных опухолевых клеточных линиях. Так активность промотора гена сурвивина человека варьирует в пределах от 0,3 до 16% от активности промотора CMV, а эффективность работы промотора hTERT может различаться до 20 раз в зависимости от типа раковых клеток.
Для увеличения эффективности опухолеспецифичных промоторов описано два подхода: 1) использование систем регулируемой экспрессии трансгенов, 2) использование гибридных промоторов. Гибридные промоторы могут включать в себя комбинации известных промоторов друг с другом или с отдельными гетерологичными регуляторными элементами с целью увеличить силу и специфичность экспрессии в раковых клетках. Как правило, исследователи при создании гибридных промоторов идут по пути максимального увеличения эффективности и специфичности экспрессии в определенном типе раковых клеток. Использование строго специфичных к опухоли определенного типа промоторов и других регуляторных элементов имеет в качестве преимущества максимальное снижение побочных эффектов за счет снижения экспрессии трансгенов в нормальных тканях. Однако, недостатком таких подходов является их неуниверсальный характер и связанная с этим вероятность инактивации промотора в метастазах, поскольку нет строгой гарантии, что узкоспецифичный промотор, хорошо работающий в первичной опухоли, сохранит эту способность во всех ее метастазах.
Цель работы
Целью данной работы являлось создание эффективной противоопухолевой генно-терапевтической системы, содержащей гены HSVtk и GM-CSF. Работа проводилась в двух направлениях: 1) создание конструкций, несущих терапевтические гены HSVtk и GM-CSF под контролем одного промотора с последующим исследованием их цитотоксического эффекта в экспериментах in vitro, ex vivo и in vivo, 2) конструирование и тестирование двойных опухолеспецифичных промоторов для экспрессии терапевтических генов в широком спектре опухолей.
В ходе работы были поставлены следующие задачи:
-
Создать экспрессионные конструкции, содержащие гены HSVtk и GM-CSF мыши или человека под контролем одного промотора.
-
Провести оценку экспрессии и биологической активности HSVtk и GM-CSF в составе полученных конструкций в экспериментах in vitro.
-
Оценить противоопухолевый эффект полученных конструкций в экспериментах ex vivo и in vivo на животных.
4. Сконструировать двойные тандемные промоторы на основе модифицированных
промоторов генов обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT) и сурвивина человека
(hSurv) и мыши (mSurv).
5. Провести анализ активности и специфичности созданных двойных тандемных промоторов на панели клеточных линий человека и оценить эффективность наиболее активного промотора в терапевтической системе ex vivo на мышах.
Научная новизна и практическая значимость работы
Настоящая работа была направлена на создание и тестирование генно-терапевтических конструкций, несущих под контролем одного промотора ген-убийцу HSVtk и ген цитокина GM-CSF, а также на создание эффективных универсальных опухолеспецифичных промоторов, активных в широком спектре раковых клеток вне зависимости от их типа. Были созданы и охарактеризованы генные конструкции, содержащие гены HSVtk и GM-CSF как по отдельности, так и в составе одного вектора. Цитотоксическая активность полученных конструкций была продемонстрирована в экспериментах in vitro на панели раковых клеточных линий человека и мыши. В экспериментах ex vivo и in vivo на животных было показано, что бицистронная конструкция, содержащая два терапевтических гена HSVtk и GM-CSF, обладает более сильным противоопухолевым эффектом, чем конструкции, несущие одиночные гены HSVtk и GM-CSF. На основе бицистронной конструкции был создан генно-терапевтический противоопухолевый препарат с коммерческим названием «АнтионкоРАН-М», его безопасность и эффективность были доказаны в ходе доклинических испытаний, проводимых на базе Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А.Герцена, Москва.
С целью создания универсальных опухолеспецифичных промоторов, активных в широком спектре раковых клеток, впервые были сконструированы искусственные двойные тандемные промоторы PhSurv-PhTERT (PhST) и PhTERT-PhSurv (PhTS) на основе модифицированных промоторов генов hTERT и BIRC5 QiSurv) человека. Было показано, что транскрипция в тандемных промоторах PhST и PhTS инициируется только с прилежащего к гену (проксимального) промотора. Транскрипция с дистального промотора подавляется. Данный тип промоторной интерференции обнаружен и описан впервые. Предложен и экспериментально подтвержден возможный механизм возникновения промоторной интерференции в двойных Spl-богатых промоторах. На панели раковых клеточных линий человека показано, что активность созданного двойного промотора PhTERT-PhSurv269 (PhTSurv269) превосходит активность одиночных PhTERT, PhSurv, PhSur269 и двойных PhTS, PhST промоторов, при этом промотор PhTSurv269, в отличие от одиночных, сохраняет стабильный уровень активности во всех исследованных клеточных линиях. В экспериментах in vitro и ex vivo показана противоопухолевая эффективность конструкции, несущей терапевтические гены HSVtk и GM-CSF под контролем промотора PhTSurv269.
Полученные в работе результаты имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. В рамках работы были впервые получены двойные тандемные опухолеспецифичные промоторы. Был описан новый вид промоторной интерференции, выдвинута и подтверждена гипотеза ее возникновения. Были созданы генно-терапевтические конструкции, на основе одной из них был разработан новый генный противоопухолевый препарат «АнтионкоРАН-М». Препарат будет использован для клинических исследований с перспективой внедрения в производство и клиническую практику. Также, полученные в работе данные могут быть использованы для рационального дизайна противоопухолевых генно-терапевтических препаратов нового поколения.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: Научная конференция, посвященная 25-летнему юбилею Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН: «Химическая биология - Фундаментальные проблемы бионанотехнологии» (Новосибирск, 2009), Международный форум по нанотехнологиям (Москва, 2009), FEBS Advanced Lecture Course (Спецес, Греция, 2010); 14-я Международная школа молодых учёных (Пущино, 2010); The 4th International FMBG Conference for young scientists "Molecular Biology: Advances and Perspectives" (Киев, Украина, 2011); Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва, 2011); XXIV Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2012); XXV Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2013); FEBS CONGRESS 2013 "Mechanisms in Biology" (Санкт-Петербург, 2013); 21st Int. Symp. "Nanostrucrures: Physics and Technology" (Санкт-Петербург, 2013).
Объём работы
Диссертационная работа изложена на ... страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка литературы из .... наименований. Диссертация содержит ... таблицы и ... рисунков.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ и получен патент РФ на изобретения.
