Введение к работе
Актуальность работы. Крупнейшая часть живых организмов в биосфере представлена бактериями, поэтому большая часть генетической информации -бактериальная (Whitman et al., 1998). Главной основой эволюционного развития бактерий является горизонтальный перенос генов (Holmes et al., 2003; Lawrence, 2001; Jain, 2002; Gogarten, 2002). Среди процессов, контролирующих перенос генов, одну из центральных ролей играет действие систем рестрикции-модификации.
К настоящему времени открыто несколько тысяч систем рестрикции-модификации в бактериях и архебактериях (Roberts et al., 2007). Наибольший интерес вызвало изучение систем рестрикции-модификации типа II, которые состоят из двух ферментов, узнающих одинаковую последовательность ДНК, но имеющих разное действие — эндонуклеазы рестрикции и метилтрансферазы. Эндонуклеаза вносит двухцепочечный разрыв в («модифицированной ДНК (например, вирусной ДНК во время инфицирования бактериальной клетки бактериофагом), а метилтрансфераза защищает хозяйскую ДНК от действия эндонуклеазы рестрикции, модифицируя основания ДНК в сайте узнавания. Таким образом, система рестрикции-модификации образует примитивную иммунную систему бактериальной клетки. Однако системы рестрикции-модификации обеспечивают не только сохранность генетической информации бактериальной клетки-хозяина, но и способствуют горизонтальному переносу генов, что обеспечивает бактериальной популяции постоянное эволюционирование и адаптацию к новым экологическим условиям. Несомненно, что интерес к изучению систем рестрикции-модификации типа II был обусловлен использованием эндонуклеаз рестрикции этого типа в качестве одного из главных инструментов научных исследований в молекулярной биологии. Но и кроме прикладного аспекта, системы рестрикции-модификации типа II представляют собой хорошую модель для изучения взаимодействия биологических макромолекул. Благодаря разнообразию структурной организации таких систем, они очень удобны для исследования регуляции экспрессии генов, так как экспрессия обоих генов должна быть строго регулирована, чтобы сохранять баланс между этими антагонистичными ферментативными активностями в бактериальной клетке. Поскольку исследование молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов является одной из фундаментальных задач молекулярной биологии, то использование систем рестрикции-модификации типа II в качестве модельных объектов трудно переоценить.
До настоящего времени основное внимание уделялось изучению регуляции систем рестрикции-модификации типа II на уровне транскрипции, где основными регуляторами экспрессии генов являются метилтрансферазы или С-белки. Однако оставалась группа систем рестрикции-модификации типа II, о регуляции которых известно крайне мало, поскольку в них не были обнаружены регуляторы транскрипции, типичные для систем рестрикции-модификации типа II. В эту группу
входит система рестрикции-модификации Eco29kI (СРМ Eco29kI), регуляция которой была исследована в данной работе.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование регуляции экспрессии генов СРМ Eco29kI. Для достижения указанной цели ставились следующие задачи:
-исследовать организацию регуляторных элементов в СРМ Eco29kI;
-определить роль каждого из найденных регуляторных элементов в регуляции экспрессии генов СРМ Eco29kI;
-предложить модель регуляции СРМ Eco29kI;
Данная работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина РАН и в лаборатории проф. Северинова К.В. института микробиологии Ваксмана, университет Ратгерс штата Нью-Джерси, США.
Научная новизна. Впервые получены данные о регуляции экспрессии генов СРМ Eco29kI, которая относится к группе так называемых "линейных" систем рестрикции-модификации типа II.
Продемонстрировано, что перед геном эндонуклеазы рестрикции находятся два промотора, с которых происходит синтез бицистронных мРНК, кодирующих оба фермента СРМ Eco29kI. Установлено, что в структурной части гена эндонуклеазы рестрикции находится промотор гена метилтрансферазы, с которого транскрибируется моноцистронная мРНК, кодирующая только метилтрансферазу. Показано, что в структурной части гена эндонуклеазы находятся два промотора, транскрипция с которых конвергентна транскрипции гена эндонуклеазы рестрикции. Показано, что активность антисенс-промоторов негативно влияет на экспрессию гена эндонуклеазы на пост-транскрипционном уровне.
Практическое значение работы. Выявление механизмов регуляции экспрессии генов является одной из задач фундаментальных исследований в молекулярной биологии. Однако результаты этих исследований позволяют применять накопленные знания на практике. Регуляторные механизмы обнаруженные в системах рестрикции-модификации, могут с успехом применяться для создания искусственных молекулярных переключателей генной экспрессии. В частности, природный механизм подавления экспрессии токсичного для бактериальной клетки гена эндонуклеазы в системе рестрикции-модификации Eco29kI, может быть применен для создания искусственных антисенс-РНК-ингибиторов генной экспрессии. Это позволяет применять данный способ регуляции экспрессии генов, как в научных исследованиях, так и в практической деятельности.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Материалы диссертации были представлены на следующих российских и международных конференциях: на 11-ой Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пушино, 2007), на международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию
со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), на 5-ом международном конгрессе "5th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification, Wills Hall" (Bristol UK, 2004), на международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008), на международной конференции "Meeting on Molecular Genetics of Bacteria & Phages" (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 2008) и на международной конференции "Sensory and regulatory RNAs in prokaryotes" (Berlin, 2009)
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает "ґ_ > источника. Работа содержит J <С рисунков и _; таблицы.
