Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы. Механизмы котранскрипционного сопряжения процессинга РНК .
1. Введение. «Гипотеза сопряжения». 8
2. С-концевой домен большой субъединицы РНК-полимеразы II. 13
3. КодСТО. 15
3.1. Гипотеза CTD-кода. 16
3.2. Фосфорилирование остатков серина в CTD. 18
3.3. Фосфорилирование тирозина-1 и треонина-4. 23
3.4. Динамическое фосфорилирование аминокислотных остатков CTD в транскрипционном цикле 26
3.5. Изомеризация пролинов в CTD. 27
4. Заключение. Перспективы развития. 31
II. Материалы и методы.
1. Химические реактивы. 33
2. Вода. 34
3. Нуклеиновые препараты. 34
4. Препараты белков (ферментов). 35
5. Бактериальные штаммы, компетентные клетки. Работа с бактериальными культурами и индивидуальными клонами . 36
6. Радионуклидные препараты. Введение метки в ДНК и РНК. 37
7. ДНК. 37
8. Секвенирование. 38
9. РНК. 38
10. Картирование сайтов старта транскрипции. 39
11. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). 39
12. Ядерный матрикс. Связывание фрагментов ДНК с ядерным матриксом in vitro, 40
13. Культивируемые клеточные линии человека. Трансфекция. 41
14.Определение промоторной активности по уровню экспрессии люцнферазы и «маркерного» фермента в лизатах
трансфицированных эукариотических клеток. 42
15. Компьютерные программы и электронные ресурсы. 43
III. Результаты и их обсуждение.
1. Структура гена hGHR. Функциональная карта кодирующей области и проксимальной 5'-НТО. Картирование основных элементов гена hGHR. 45
2. Анализ in silico локуса гена hGHR.
2.1. Общая характеристика и регуляторные области . 51
2.2. Характеристика структуры хроматина. 53
3. Характеристика нетранслируемых областей гена hGHR,
3.1. Характеристика 5'-НТО. Картирование 5'-нетранслируемых экзонов гена hGHR. 54
3.2. Картирование сайтов старта транскрипции в 5'-НТО. 57
3.3. Характеристика З'-НТО гена hGHR. 58
3.4. Изучение взаимодействия участков нетранслируемых областей с ядерным матриксом in vitro. 59
4. Картирование и изучение активности in vitro основных промоторов гена GHR человека .
4.1. Промотор Р1, специфический для взрослой печени. 61
4.2. Общетканевой промотор Р2.
4.2.1. Характеристика промоторной области. 63
4.2.2. Изучение влияния короткой открытой рамки считывания (кОРС), расположенной в 5'-нетранслируемом экзонс V2 гена GHR, на экспрессию репортерного гена люциферазы . 64
4.3. Другие промоторы генов GHR.
4.3.1. Картирование предполагаемого промотора РЗ. 66
4.3.2. Изучение предполагаемых промоторных районов
экзонов V5 и V9. 67
5. Нетранслируемый «экзон»
5.1. Картирование V6 в хромосоме 11 человека. 70
5.2. Клонирование хромосомного фрагмента гена hMOGAT2. 70
5.3. Анализ экспрессии V6 в тканевых и клеточных РНК. 71
5.4. Анализ экспрессии гена hMOGAT2 в некоторых тканях человека и клеточных линиях. 71
5.5. Идентификация антисмыслового транскрипта в локусе гена hMOGAT2. 73
5.6. Картирование промотора в 5'-области V6. 78
5.7. Гипотетііческий механизм образования химерного транскрипта V6 в результате глраис-сипайсиига. 79
6. Изучение экспрессии гена hGHR в некоторых человеческих тканях, культивируемых клеточных линиях и образцах опухолей . 82
6.1. 5'-иетранлсируемая область гена hGHR.
6,1 Л. Идентификация новых 5'- нетранслируемых экзонов гена hGHR. 84
6.1.2. Экспрессия 5'-нетранслируемых экзонов гена hGHR в клеточных линиях. 85
6.2. Транслируемая область гена hGHR.
6.2.1. Экспрессия мРНК hGHR в некоторых тканях и клеточных линиях. 86
6.2.2. Исследование экспрессии мРНК гена hGHR в некоторых клеточных линиях. 86
6.2.3. Анализ экспрессии форм мРНК hGHR в образцах опухолей и в клеточных линиях опухолевого происхождения. 87
6.2.4. Гипотетический механизм образования и возможная роль укороченной формы мРНК гена hGHR. 88
6.3. Изучение влияния суперэкспрессии компонентов хроматин-ремоделирующего комплекса SWI/SNF на экспрессию и альтернативный сплайсинг мРНК hGHR. 95
7. Полиморфизм и мутации в гене hGHR.
7.1. Полиморфизм области экзона 3 гена hGHR. 97
7.2. Сравнительный анализ полиморфизма экзона 3 гена hGHR
в группе пациентов с идиопатической низкорослостью (ИН).
7.3. Синдром Ларона.
Заключение.
Выводы.
Список литературы.
- Динамическое фосфорилирование аминокислотных остатков CTD в транскрипционном цикле
- Бактериальные штаммы, компетентные клетки. Работа с бактериальными культурами и индивидуальными клонами
- Общая характеристика и регуляторные области
- Изучение влияния короткой открытой рамки считывания (кОРС), расположенной в 5'-нетранслируемом экзонс V2 гена GHR, на экспрессию репортерного гена люциферазы
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Значительные достижения геномики на рубеже XX-XXI веков, особенно результаты секвенирования геномов различных организмов, составляют основной потенциал для развития новых областей молекулярной биологии — «транскриптомики» и «протеомики». Результатом сравнения геномов разных биологических видов стал вывод об усложнении регуляции экспрессии генома при переходе от «низших» видов к «высшим», а не увеличение числа генов, как предполагали ранее. Экспрессия эукариотического генома — сложнейший многоуровневый процесс, одним из наиболее важных этапов которого является транскрипция. В настоящее время на смену представлениям о процессинге, транспорте, редактировании и запрограммированной деградации мРНК как посттранскрипционных процессах выдвинута «гипотеза сопряжения» о тесной взаимосвязи всех этапов метаболизма РНК между собой и их котранскрипционном протекании. Предполагается, что процессинг, модификация, транспорт и деградация РНК происходят одновременно с процессом элонгации, то есть существует разветвлённая «сеть» «молекулярных машин», работающих согласованно. Стержнем этой системы, как полагают, является С-концевой домен (CTD) РНК- полимеразы II, однако до настоящего времени не идентифицирован «регуляторный каркас», управляющий столь сложной структурой. Исследования именно этого аспекта, по-видимому, могут обеспечить достаточные доказательства правоты «гипотезы сопряжения».
Изучение регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции и сопряженных процессов метаболизма РНК может иметь и прикладное значение, например, для более глубокого понимания природы РНК-доминантных заболеваний (RNA-dominant diseases), связанных с транскрипцией «токсических» некодирующих РНК. Попытки применения препаратов микроРНК (microRNA), киРНК (siRNA), PIWI-ассоциированных РНК (piRNA) и антисмысловых РНК для коррекции аберрантных продуктов транскрипции и метаболизма РНК, как в отдельных клетках, так и в живых организмах, позволяют говорить о развитии «антисмысловых» технологий для фундаментальных и прикладных исследований и закладке основ «антисмысловой» терапии и «микрогеномной» медицины.
Цель и задачи работы.
Цель работы состоит в изучении регуляции экспрессии сложной единицы транскрипции - гена рецептора гормона роста человека (hGHR). Основное следствие «гипотезы сопряжения» - вывод о существовании единой согласованной системы регуляции экспрессии генов, включающей транскрипционный и «посттранскрипционный» аппараты клеточного ядра, поэтому логично говорить о «котранскрипционной» регуляции экспрессии.
Для достижения поставленной цели необходимо решить общую задачу - исследовать «профиль» транскрипции гена hGHR в РНК из человеческих тканей, фактически, необходимо решить ряд конкретных задач:
-
построить физическую карту гена hGHR;
-
картировать функциональные элементы гена: потенциальные промоторы, 5'- нетранслируемые экзоны, кодирующие экзоны;
-
исследовать функции потенциальных промоторов in vitro;
-
охарактеризовать 5'-нетранслируемую область (5'-НТО) гена: картировать сайты стартов транскрипции, оценить представленность основных 5'-нетранслируемых экзонов (вариантов первого некодирующего экзона гена hGHR) в РНК из человеческих тканей;
-
охарактеризовать 3'-НТО гена;
-
изучить экспрессию кодирующей части гена hGHR в человеческих тканях.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Построена карта кодирующей и проксимальной части 5'-НТО (район промотора Р1, специфического для взрослой печени) гена hGHR общей протяженностью около 200 т.п.н..
Впервые установлена нуклеотидная структура GC-богатого участка, содержащего дистальный кластер 5'-нетранслируемых экзонов (V2(1B)-V9-V3(1C)).
Экспериментально in vitro и in silico показана потенциальная возможность ассоциации с ядерным матриксом транскрипционно активных участков 5' - и 3' -НТО гена hGHR.
Исследовано влияние короткой открытой рамки считывания (кОРС) в «общетканевом» промоторе Р2 (дистальная 5'-НТО) на экспрессию репортерного гена люциферазы in vitro. Установлено различное влияние элементов основного «общетканевого» экзона 1В на экспрессию кОРС, расположенной ниже (в 3'-направлении).
Идентифицированы четыре новые изоформы мРНК гена hGHR, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга 5'-НТО, экспрессирующиеся ткане- и стадиеспецифически.
Идентифицирована укороченная форма мРНК, не содержащая трансмембранного и внутриклеточного доменов рецептора гормона роста, предложен гипотетический механизм ее образования за счет использования альтернативного сайта полиаденилирования в интроне 7/8 гена hGHR.
Установлено соответствие одного из потенциальных нетранслируемых вариантов 1 экзона (V6) хромосоме 11 человека, а не хромосоме 5, как полагали ранее. Экспериментально показана транскрипция некодирующей цепи ДНК в локусе гена моноацилглицерат-О-ацилтрансферазы 2 человека (hMOGAT2). Предложен гипотетический механизм образования химерной РНК в результате транс-сплайсинга двух дискретных транскриптов.
Исследована частота геномного полиморфизма области экзона 3 гена hGHR. Установлено достоверное различие частот генотипа делеция/делеция (d/d) в группе пациентов с идиопатической низкорослостью (ИН) по сравнению с контрольной группой.
У пациента с задержкой роста обнаружена мутация R43X в экзоне 4 гена hGHR, подтверждающая диагноз «синдром Ларона».
Апробация работы.
Основные результаты работы представлены на II съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), III съезде Биохимического общества РАН (С-Петербург, 2002), ежегодных итоговых конференциях Федеральной целевой научно-технической подпрограммы «Геном человека» (Черноголовка, 1998, 1999), международном симпозиуме «Current problems of molecular genetics and cell biology» (Москва, 2000), III съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Москва, 2004), на международных семинарах "Coupling between transcription and RNA processing" (Baeza, Spain, 2004) и "RNA-protein interactions in development and cancer" (Baeza, Spain, 2009), лабораторных коллоквиумах лаборатории молекулярной эндокринологии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.
Структура и объём работы.
Диссертация изложена на страниц , содержит рисун , таблиц и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложение результатов и их обсуждение, заключения, выводов, благодарностей и списка цитированной литературы ( наименовани ).
Динамическое фосфорилирование аминокислотных остатков CTD в транскрипционном цикле
Обзор литературы посвящен краткому рассмотрению предпосылок возникіїовеиия «гипотезы сопряжения» и современным исследованиям котранскрипциоиного сопряжения. В основной части обзора, посвященной коду CTD, рассмотрены модификации аминокислотных остатков в составе CTD, механизмы модифицирования, роль модифицированных аминокислотных остатков в качестве «сигнальных меток» в котранскрипционном сопряжении и регуляторные механизмы «чтения» CTD-кода. Опубликованные данные по структуре и экспрессии гена hGHR рассмотрены в главе III. Результаты и их обсуждение.
В качестве предпосылок «гипотезы сопряжения» можно рассматривать результаты ряда работ, в которых биохимическими или микроскопическими методами установлены связи между транскрипцией и «посттранскрипционными» процессами. Показано, что транскрипция гена дистрофина человека, содержащего 79 экзонов и имеющего протяженность, по крайней мере, 2 300 000 п.н., занимает около 16 часов. Проанализировав профиль накопления промежуточных и конечного транскриптов указанного гена в культуре клеток мышц, авторы пришли к выводу о котранскрипционном протекании сплайсинга пре-мРНК (Tennyson C.N., Klamut H.J., Worton R.G., 1995). Ранее сообщалось как о котранскрипционной инициации сплайсинга пре-мРНК, на основании электронно-микроскопических исследований транскрипции хроматина D. melanogaster (Beyer A.L., Osheim Y.N., 1991), так и об ассоциации факторов сплайсинга и формирования 3 -конца транскрипта. Вероятно, одной из ключевых предпосылок для формулирования гипотезы можно считать открытие белка, сходного с факторами сплайсинга SR-семейства (serine/arginine-rich), связывающегося с С-концевым участком (С terminal domain, CTD) большой субъединицы РНК-полимеразы II (РНКП2) (YuiycvA.etaL, 1996).
Идея о возможной согласованности транскрипции и процессинга РНК обсуждалась и раньше (Greenleaf АХ., 1993), но обосновать взаимосвязь транскрипции и посттранскрипционных, согласно классическим представлениям, этапов процессинга РНК стало возможно только благодаря экспериментальным доказательствам ассоциации факторов расщепления/полиаденилирования CPSF/CstF и факторов сплайсинга с РНКП2. Функциональные и биохимические взаимодействия этих факторов между собой к тому времени уже были установлены. Экспериментальные доказательства взаимодействия указанных факторов не только между собой, но и, посредством белок-белковых взаимодействий, с РНКП2 и позволили, собственно, сформулировать гипотезу сопряжения транскрипции, сплайсинга и расщепления/полиаденилирования, опосредованную CTD большой субъединицы РНКП2 (McCracken S. et aL, 1997). Показано, что делеция CTD блокирует сплайсинг, полиаденилирование и терминацию транскрипции, но не влияет на инициацию (McCracken S. et al., 1997). Сборка столь сложного белкового комплекса, как полагают, происходит на промоторе. Образное сравнение с «фабрикой мРНК», где машины транскрипции, сплайсинга и расщепления/полиаденилирования взаимодействуют друг с другом через CTD, получило дальнейшее развитие и в ряде более поздних работ (Maniatis Т., Reed R., 2002). Авторы последней цитированной работы развили «первичную» гипотезу и убедительно показали, что сопряжение «экспрессионных машин» имеет нелинейный характер. Предполагается, что в клетке существует мощная разветвленная согласованно работающая сеть многокомпонентных «машин» или «фабрик» генной экспрессии.
Данные независимых исследований о роли фосфорилирования CTD в регуляции транскрипции (Kim Е. et al., 1997) и сплайсинга (Du L., Warren SX., 1997) уточняют и развивают предложенную гипотезу сопряжения. На основании ранее опубликованных данных показано, что нефосфорилированный CTD соответствует пре-инициированному транскрипционному комплексу, фосфорилирование CTD связано с переходом пре-инициированного комплекса в транскрипциошю активное состояние и, собственно, с инициацией транскрипции, но для процесса транскрипции фосфорилирование CTD не является необходимым условием (Kim Е, et al, 1997), что подтверждается ранее опубликованными данными. Биохимическими методами, с использованием мощного ингибитора CTD-киназы Н8, показано, что основной процесс транскрипции протекает без фосфорилирования CTD.
Ранее установлено, что гиперфосфорилирование большой субъединицы РНКП2 связано со стадией элонгации, установлена ассоциация гиперфосфорилировашюй РНКП2 со «сплайсинговыми» комплексами in vitro (Mortillaro M.J. et al., 1996). Экспериментально (методом СЫР) доказана ассоциация гиперфосфорилированного CTD с факторами сплайсинга семейства Sm (класс малых ядерных рибонуклеопротеидов, snRNPs) и белками SR-семейства (Yuryev A. et aL, 1996), даже в отсутствие цепи пре-мРНК в транскрипционном комплексе (Kim Е. et al., 1997). При этом гиперфосфорилирование CTD РНКП2 слабо коррелирует с транскрипционной активностью. Таким образом, показана ассоциация факторов сплайсинга именно с гиперфосфорилированным CTD и связь сплайсинга со стадией элонгации РНК. Дальнейшие исследования позволили установить роль длины CTD (количества гептадных повторов) в регуляции сплайсинга «in vivo». Ранее полученные данные о летальности делеций, затрагивающих более половины CTD РНКП2 у Drosophila, дрожжей и млекопитающих, свидетельствовали о необходимости проксимальной части CTD («5 -половины») для выживаемости клеток, а добавление повторов к «минимальному CTD» вызывало инкрементное увеличение генной экспрессии и жизнеспособности клеток. Для изучения молекулярной природы наблюдаемого эффекта полученный набор конструкций «интегрированного» белка р-галактозидазы с вариантами СТО: 1-52 (CTD52), 1-32 (CTD32), 1-26 (CTD26), 1-13 (CTD13), 1-6 (CTD6), 1-3 (CTD3) и 1 (CTD1) экспрессировали в клетках HeLa (Du L., Warren S.L., 1997). Установлено фосфорилирование CTD-интегрированных белков и их локализация в ядрах, даже в случае удаления сигнала ядерной локализации. Вариант CTD52 вызывает селективное перемещение факторов сплайсинга из отдельных ядерных доменов в нуклеоплазму и блокирует накопление сплайсированных транскриптов р-глобина (но не влияет на несплайсированные). Установлена прямая зависимость степени разрушения сплайсинговых комплексов и, как следствие - ингибирование сплайсинга, от количества гелтадных повторов в интегрированном белке. Полученные данные свидетельствуют о функциональном взаимодействии CTD с аппаратом сплайсинга.
Параллельно исследуют взаимодействия CTD с факторами кэпирования мРНК. Ранее было известно, что кэпирование происходит вскоре после инициации транскрипции и предшествует сплайсингу и полиаденщшрованию. Предприняты попытки исследования физического взаимодействия аппаратов кэпирования и транскрипции, имеющие целью фундаментальное изучение механизмов сопряжения указанных процессов. Показано, что кэпирующий фермент не ассоциирован с основным аппаратом транскрипционных факторов и с собственно холоферментом РНКП2, в связи с чем высказано предположение о специфическом взаимодействии кэпирующего фермента с фосфорилированным CTD (Cho E.J. et al., 1997). Экспериментально доказано, что подобное взаимодействие возникает в инициированном транскрипционном комплексе только после фосфорилирования CTD. Ингибитор CTD-киназы Н8 блокирует не только фосфорилирование CTD, но и сборку кэпирующих ферментов на инициированном комплексе. Таким образом, именно фосфорилированный CTD играет здесь ключевую роль (Cho EJ. et ah, 1997). В независимом исследовании более детально изучен как процесс взаимодействия ферментов кэпирования с CTD, так и собственно регуляция фосфорилированным CTD данного взаимодействия
Бактериальные штаммы, компетентные клетки. Работа с бактериальными культурами и индивидуальными клонами
В реакциях ПЦР, опосредованных обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), для амплификации фрагментов на матрице кДНК применяли набор реагентов Recombinant Taq DNA Polymerase (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом и рекомендациями производителя.
Для высокоэффективных и точных ПЦР использовали набор реагентов Expand High Fidelity PCR System (Roche Applied Science, США), используя в качестве матрицы как плазмидные, так и кДНК, а также геномную ДНК человека, в соответствии с протоколами и рекомендациями производителя. Для получения длинных фрагментов (более 10 т.п.н.) на матрице геномной ДНК человека использовали набор реагентов Expand Long Template PCR System (Roche Applied Science, США), в соответствии с протоколами и рекомендациями производителя. ПЦР проводили в прецизионных термоциклерах GeneAmp 2400 (Perkin-Elmer, США), GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, США) и Veriti (Applied Biosystems, США). об/мин. 30 с при 4С, осадок ядерного матрикса дважды промывали 1 мл буфера MWB, а затем суспендировали в 10 мкл буфера MWB. Добавляли хромосомную ДНК Exoli (компетитор) до конечной концентрации 50-200 мкг/мл (с шагом 50 мкг/мл), по 2 нг радиоактивно меченых фрагментов ДНК до конечной концентрации 20 нг/мл. Доводили объемы до 90 мкл водой, добавляли 10 мкл суспензии промытого ядерного матрикса и перемешивали . Реакционные смеси инкубировали 3 часа при 23-25 С со скоростью качаний 190 об/мин. После инкубации к пробам добавляли по 400 мкл охлажденного буфера МАВ (50 мМ NaCl, 10 мМ Трис НС1 рН 7.4, 2 мМ EDTA, 0.25 М сахароза, 0.25 мг/мл BSA), перемешивали, ядерный матрикс осаждали центрифугированием 1 мин. при 12000 об/мин при 4С. Супернатант переносили в отдельные пробирки, добавляли по 3 мкг ДНК Е.соН (соосадитель), осаждали 2 объемами 96% этанола в течение ночи при -20С. Центрифугировали 10 мин. при 12000 об/мин., промывали 75%-ным этанолом, подсушивали на воздухе, растворяли в 10 мкл воды. Осадок ядерного матрикса промывали 1 мл їх МАВ, осаждали центрифугированием при 12000 об/мин., 4С, 1 мин., инкубировали в 20 мкл 0.5% SDS с лротеиназой К (0.4 мг/мл) в течение 16 часов при 37С. Добавляли по 5 мкг хромосомной ДНК Е.соН (соосадитель), экстрагировали равным объемом смеси фенол-хлороформ, осаждали 3 объемами 96% этанола, центрифугировали при 12000 об/мин., 4С, 10 мин., промывали 75% этанолом, осадки подсушивали при комнатной температуре и суспендировали в 10 мкл воды. Полученные препараты наносили на агарозный гель, электрофорез вели при токе 40-50 мА. По окончании разделения гель помещали на ДЕАЕ-бумагу и высушивали в течение часа при 80С под вакуумом. Высушенный гель экспонировали с рентгеновской пленкой и усиливающими экранами в течение 3-8 суток при -50С.
Культивируемые клеточные линии человека. Трансфекция. Клеточные линии, использовавшиеся на разных этапах работы, перечислены в главе III, с указанием источника. Культивирование клеточных линий вели в условиях, рекомендуемых Американской коллекцией клеточных культур (ATCC-LGC). Котрансфекция клеток линий HepG2 и Huh7 конструкциями, содержащими фрагменты промоторных областей гена hGHR и плазмидой pCMV-LacZ (экспрессирует «маркерный» фермент р-галактозидазу), выполнена асп. Д.С. Ивановым (лаборатория биологии клетки ИМБ РАН) кальциево-фосфатным методом. В экспериментах по изучению промоторной области V6 котрансфекция клеток линии HeLa конструкциями (в pGL3-Basic Vector) и плазмидой с геном люциферазы Renilla («маркерный» фермент) проведена липофектином (Invitrogen, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Каждая промоторная конструкция трансфицирована не менее чем в трех параллельных повторах. Котрансфекция клеток линий MCF-7 и MCF-7/HTB-22 конструкциями, экспрессирующими субъединицы хроматин-ремоделирующего комплекса SWI/SNF и контрольными конструкциями, с плазмидой pCMV-LacZ, выполнена Е. Batsche (Institut Pasteur, Париж, Франция). Каждая конструкция трансфицирована в трех параллельных повторах. Использовали реагент jetPEI (Polyplusransfection SA, Франция) в соответствии с рекомендациями производителя. Эффективность трансфекции оценивалась по активности р-галактозидазы («сине-белый тест») и достигала значения 70%. Для выделения РНК использовали весь пул выросших клеток.
Определение промоторной активности по уровню экспрессии люциферазы и «маркерного» фермента в лизатах трансфицированных эукариотических клеток. В экспериментах с фрагментами гена hGHR (линии HepG2 и Huh7) активность люциферазы светлячка определяли с помощью набора реагентов Luciferase Assay System (Promega, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Активность р-галактозидазы («маркерного» фермента) определяли по классической методике (Миллер Д., 1976). Расчет среднеквадратического отклонения производили вручную по стандартной формуле. Результаты представлены в графическом виде (глава III, п.4.1., п.4.2.). В экспериментах с фрагментами 5 -области V6 (линия HeLa) активность люциферазы светлячка и люциферазы Renilla («маркерного» фермента)
Общая характеристика и регуляторные области
В однонаправленной ПЦР амшшфицировали 5 - и 3 -геномные области V6. В качестве матрицы использовали любезно предоставленную Г.ФЛОдиной (ИБХ РАН) систему геномной ДНК человека, фрагмеитированной эндонуклеазами рестрикции и дотированных адаптерных последовательностей. Установили концевые нуклеотидные последовательности наиболее длинных фрагментов; в 5 -направлении от V6 - фрагмент рестриктазы Sspl, в 3 направлении — фрагмент рестриктазы Dral. С помощью олигонуклеотидов, комплементарных концевым участкам, на геномной ДНК человека амплифицировали фрагмент длиной 4.9 т.п.н., содержащий V6. Клонировали полученный специфический продукт, провели частичное рестриктазное картирование данной области и субклонирование в плазмидных векторах, частично секвенировали и охарактеризовали вставки в субклонах. Сравнение установленных нуклеотидных последовательностей данной геномной области после опубликования фрагментов нуклеотидной последовательности генома человека позволяет установить комплементарность V6 второму кодирующему экзону гена моноацилглицерат О-ацилтрансферазы 2 человека (hMOGAT2). Последовательность V6 короче экзона 2 hMOGAT2 на 31 п.н. с 5 -конца и 24 п.н. с З -конца. Таким образом, изучаемый фрагмент относится к хромосоме 11 человека. Схематическое изображение геномного фрагмента, содержащего V6, представлено на Рис. 17.
5.3. Анализ экспрессии V6 в тканевых и клеточных РНК. Амплификация химерного транскрипта У6-экзон 2 hGHR на кДНК, синтезированных на препаратах суммарных и полиаденилированных РНК из некоторых человеческих тканей и клеточных линий (указаны в п. 5.4.), затруднена в силу незначительной представленности указанной изоформы мРНК hGHR в транскриптомс. Попытки детектировать специфический фрагмент в человеческих тканях не дали однозначного результата. Достаточное для анализа первичной структуры количество фрагмента удалось получить только для клеточной линии ТЕ671. Наличие химерного транскрипта «V6-hGHR» подтверждено секвенированием.
Анализ экспрессии гена HMOGAT2 е некоторых тканях человека и клеточных линиях. Экспрессию гена hMOGAT2 исследовали методом ОТ-ПЦР, амплифицируя фрагменты «экзоны 2-3» (пара праймеров 398/402) и «экзоны 3-4» (альтернативно сплайсирующийся интрон 3/4) (пара праймеров 401/403) (Табл. 2, Рис. 17) на РНК из некоторых человеческих тканей: взрослая печень, 400 4(2 фетальная печень, плацента, кора надпочечника, ободочная (толстая) кишка, молочная железа, яичник, поджелудочная железа, тимус, скелетные мышцы, сердце, тестикулы, легкое, спинной мозг; периферические клетки крови, из первичной культуры хондроцитов и на РНК из клеточных линий: HepG2, Huh7, HeLa, MDA-MB436, ВТ474, ТЕ671, НЕК293.
Из опубликованных данных известно о высоком уровне экспрессии гена hMOGAT2 в ткани печени, почки, ободочной (толстой) кишки, тонкого кишечника, простаты, желудка и в жировой ткани (Lockwood LF. et al., 2003; Yen C.L., Farese R.V. Jr., 2003), об экспрессии в фетальной печени, линии HepG2, в ткани молочной железы и клеточных линиях ОМЖ ранее не сообщалось. Следует отметить пониженный, по сравнению с взрослой печенью, уровень экспрессии hMOGAT2 в фетальной печени и повышенный уровень экспрессии hMOGAT2 в клеточных линиях, происходящих из опухолей молочной железы (ОМЖ), по сравнению с тканью молочной железы.
.Идентификация антисмыслового транскрипта е локусе гена hMOGAT2. В данном параграфе и далее «антисмысловыми», некодирующими, комплементарными (антипараллельными) названы транскрипты, кДНК, РНК, цепь ДНК - по отношению к направлению транскрипции гена HMOGAT2. Для удобства изучаемые области соотнесены с функциональными элементами гена hMOGAT2, прежде всего - с кодирующими экзонами, учитывая, что данные элементы могут присутствовать в антисмысловой РНК, но без сохранения функций, присущих им в мРНК hMOGAT2,
Анализируя «транскрипционный профиль» области V6 в суммарных и полиаденилированных РНК из человеческих тканей и клеточных линий, обнаружили интересный эффект: в кДНК, праймированных oligo-dT, детектируются некоторые интронные последовательности гена hMOGAT2 человека. Помимо интрона 3/4, альтернативный сплайсинг которого установлен ранее (Lockwood IF. et al., 2003; Yen C.L., Farese R.V. Jr., 2003) для РНК из взрослой печени, детектируется фрагмент интрона 1/2. Предполагая, что интроны гена могут присутствовать в антисмысловом транскрипте, транскрибирующемся в данному локусе, получили ряд антисмысловых кДНК, праймируя реакции ОТ олигонуклеотидами 398, 241,242, 243, 244, лежащими в 3 -области V6 (Табл. 2, Рис. 17).
В серии ПЦР, «специфических к направлению транскрипции» (СНТ-ПЦР), с парами праймеров 400/398 и 395/241 (Рис. 17) па препаратах антисмысловых кДНК взрослой печени амплифицируются специфические фрагменты ожидаемой длины. Фрагмент длиной 520 п.н. (пара праймеров 400/398) соответствует непрерывной последовательности фрагмента интрона 3/4 (от праймера 400) и сплайсированным экзонам 2 и 3 гена hMOGAT2. Продукт амплификации длиной 400 п.н. (пара 395/241) соответствует непрерывной последовательности экзона 2 гена hMOGAT2 (V6) и фрагмента прилежащего интрона 1/2.
ПЦР на тех же препаратах антисмысловых кДНК с использованием пары 398/402 дает фрагмент - 320 п.н., по размеру соответствующий сплайсированным экзонам 2 и 3 гена hMOGAT2. Использование пар праймеров 398/403 и 401/403 дает крайне незначительное количество ожидаемых продуктов (отсутствие экзона 4 гена MMOGAT2 в антисмысловых кДНК). Интрон 2/3 не детектируется ни в смысловых, ни в антисмысловых кДНК.
Изучение влияния короткой открытой рамки считывания (кОРС), расположенной в 5'-нетранслируемом экзонс V2 гена GHR, на экспрессию репортерного гена люциферазы
Экспрессия экзона VI0а и «новой» части V3d установлена позднее в независимом исследовании, в адипоцитах, вместе с другими нетранслируемыми экзонами VC и VE, о которых будет сказано далее (Wei Y. et al., 2006). VlOa назван авторами VA, a V3d - VB. В последнем случае авторами установлена только новая нуклеотидная последовательность, включающаяся в идентифицированный нами экзон V3d (Рис. 23). На расстоянии примерно 3,5 т.п.н. в 5 -направлении от экзона V3d/VB в линии фибробластов легкого (NHLF) отмечена высокая транскрипционная активность (п. 2.2.), сам экзон лежит в районе средней транскрипционной активности (Рис. 16). В 3 -области от экзона V3d/VB идентифицирован повтор L1PA4 семейства L1 (Рис. 16). Далее следует блок нетранслируемых экзонов VE-VC-V10-VA (Wei Y. et аЦ 2006), в 3 -направлении от которого отмечается пик маркера H3K4mel (маркер энхансера, обычно следует за стартом транскрипции) в линии NHEK (в остальных линиях пики существенно ниже). Модификация H3K4mel соответствует «ДНКазным кластерам» (открытый хроматин), состоянию транскрибируемого хроматина и наличию энхансеров в указанной области для линий эпителиальных клеток молочной железы (НМЕС) и фибробластов легкого (NHLF) (Рис. 16). Прослеживается определенная связь между маркерами активного хроматина, транскрипционной активностью и регуляцией сплайсинга. Нельзя исключить, что на установление данной связи оказывают влияние LINE- и SINE-повторы, идентифицированные в изучаемой области (см. п. 6.3.).
Исследован профиль экспрессии нетранслируемых экзонов гена hGHR в РНК взрослой печени (контроль) и клеточных линий HeLa, HepG2, Huh7, HEK293,TE671,MCF-7.
Полученные результаты согласуются с опубликованными данными независимых исследований о ткане- и стадиеспецифической экспрессии большинства нетранслируемых экзонов. Специфичные для взрослой печени экзоны V7, VI, V4, V8 не экспрессируются в перечисленных выше клеточных линиях, но экспрессируется новый экзон V7a (возможно и V7b), а в линии MCF-7 детектируется экзон VI (1 А) (см. также п. 6.3.). V10 не детектируется ни в одной стадиеспецифичиости. Экзон V2 (IB) проявляет широкий спектр тканевой экспрессии (п. 4.2Л.) как и экзон V3, который детектируется в гепатобластомах и гепатоцеллюлярных карциномах, а также в фетальной печени (Zogopoulos G, et al., 1996), но в эмбриональной почке (линия НЕК293) V3 не экспрессируется. Экзон V5, образующийся по принципу «задержавшийся интрон», также проявляет широкий спектр тканевой экспрессии и детектируется практически во всех клеточных линиях (см. также п. 2.2., п. 4.3.2., п. 6.3.).
Транслируемая область гена hGHR. 6.2.1. Экспрессия мРНК hGHR в некоторых тканях и клеточных линиях. Методом ОТ-ПЦР (амплификация фрагмента внеклеточного домена hGHR - экзоны 4-6 в суммарных РНК из некоторых человеческих ттсаней: взрослой и фетальной печени, плаценты, коры надпочечника, ободочной (толстой) кишки, молочной железы, яичника, почки, поджелудочной железы, тимуса, скелетных мышц, сердца, тестикул, легкого, спинного мозга, из периферических клеток крови, из первичной культуры хондроцитов, из культивируемых клеточных линий HepG2, Huh7, HeLa, MCF-7, MDA-MB436, BT474, HEK293, TE671) установлен относительный уровень мРНК hGHR. Наиболее высокий уровень экспрессии hGHR наблюдается во взрослой печени и в молочной железе.
Исследование экспрессии мРНК гена hGHR в некоторых клеточных линиях. Для более детальной качественной оценки экспрессии гена hGHR на транскрипционном уровне в клеточных линиях, методом ОТ-ПЦР амплифицировали фрагменты «экзоны 4-6» (внеклеточный домен) и «экзоны 8-Ю» (трансмембранный/внутриклеточный домены). В линии Huh7 детектируется только внеклеточный домен, а в клеточных линиях НЕІС293 и ТЕ671 детектируются участки как внеклеточного, так и трансмембранного/внутриклеточного доменов, но результаты не соответствуют ожидаемому соотношению 1:1. Полученные данные позволяют предположить, что в клеточных линиях Huh7, НЕК293 и ТЕ671 экспрессируется укороченная форма мРНК hGHR, не содержащая участков, соответствующих трансмембранному (экзон 8) и внутриклеточному доменам (экзоны 9-10).
Сравнительный анализ экспрессии мРНК гена hGHR методом ОТ-ПЦР в образцах тканей молочной железы, опухолей молочной железы (ОМЖ) и культивируемых клеточных линий ОМЖ (MCF7, MDA-MB436, ВТ474) позволил установить корреляцию между экспрессией укороченной формы мРНК hGHR и экспрессией альфа-эстрогеиового рецептора (ERa): в гормонозависимых (по наличию экспрессии ERa) образцах детектируются участки всех доменов hGHR, в гормононезависимых - только участок внеклеточного домена. Можно предполагать, что установленная корреляция свидетельствует о прямом (на уровне инициации транскрипции/выбора промотора) и/или опосредованном (через молекулы сигнального каскада) влиянии ERa на экспрессию укороченной мРНК hGHR. Высокий уровень экспрессии ERa наблюдается лишь образцах гормонозависимых ОМЖ, в тканях взрослой печени и молочной железы, клеточной линии MCF7 и MCF7/HTB-22 (в последнем образце экспрессия гена hGHR незначительна) (п. 6.3.).
Изучена экспрессия предполагаемой укороченной мРНК в 5 попарных (опухоль/«нормальная» ткань, прилежащая к опухоли) образцах опухолей печени (суммарные РНК любезно предоставлены зав. лабораторией механизмов прогрессии эпителиальных опухолей Н.Л. Лазаревич, РОНЦ РАМН), 15 попарных образцах опухолей ободочной (толстой) кишки (суммарные РНК любезно предоставлены Д.Н. Пеньковым, Факультет фундаментальной медицины МГУ), 4 опухолях молочной железы и образце аденомы простаты (образцы суммарных РНК ОМЖ и ткань аденомы простаты любезно предоставлены ТА. Щелкуновой, Биологический факультет МГУ), образце ткани молочной железы при гигантомастии, клеточных линиях, происходящих из опухолей печени (2), ободочной (толстой) кишки (4), молочной железы (4), простаты (3), нейробластомы (14) и в соответствующих нормальных тканях человека. В ряде опухолей и клеточных линий экспрессируется только укороченная форма (2 гормононезависимые ОМЖ и клеточные линии гормоноиезависимых ОМЖ MDA-MB436 и ВТ474, 7 опухолей толстой кишки), в некоторых образцах hGHR не экспрессируется (2 опухоли печени и линия HepG2, 2 опухоли и 3 клеточные линии из опухолей толстой кишки). В остальных образцах детектируется полная форма мРНК hGHR.
В линиях нейробластомы человека IGR-NBO, SK-N-BE(2), SK-N-AS, LAN-5, SKNSH, CLBpe, IGR331, SNS KCN, SH-SY5Y, IMR32, LAN-1, IGR-N-91, IGRN-B8 экспрессии не hGHR наблюдается. В коре надпочечника, из которого развивается нейробластома, наблюдается незначительный уровень экспрессии hGHR, значительный уровень экспрессии укороченной формы мРНК hGHR детектируется в линии СНР212. Линии нейробластомы человека любезно предоставлены S. Douc-Rasy, Institut de cancerologie Gustave Roussy, Вильжуиф, Франция.
