Содержание к диссертации
Введение
1. Трансляционная аттенюация (трансляция лидерного пептида) 17
1.1. trp оперон E. coli и другие опероны биосинтеза аминокислот энтеробактерий 17
1.2. Экспрессия pyrBI E. coli 20
2. Регуляция с участием РНК-связывающего белка 21
2.1. РНК-связывающие белки, стимулирующие терминацию 21
2.2. РНК-связывающие белки, стимулирующие антитерминацию 25
3. T-бокс регуляция у грамположительных бактерий 28
4. Рибопереключатели 33
4.1. История открытия 33
4.2. Разнообразие рибопереключателей 36
Материалы и методы 44
Результаты и обсуждение 56
Введение 56
1. Регуляция экспрессии генов синтеза McC 58
1.1. Транскрипт mccA необходим для продукции микроцина С 58
1.2. Короткий транскрипт микроцинового оперона mccA чрезвычайно стабилен и связан с рибосомами in vivo 61
1.3. In vitro анализ терминации транскрипции в межгенном участке mccA-mccB 64
2. Трансляционная аттенюация в других mcc оперонах 74
3. Регуляция экспрессии и роль генов иммунности в синтезе McC 84
3.1. Особенности регуляции экспрессии mccF 85
3.2. Влияние инактивации белков иммунности на скорость роста клеток-продуцентов McC 87
3.3. Влияние MccF на продукцию McC з
4. Внутренние промоторы оперона mcc 95
4.1. Оперон mcc содержит внутренние промоторы 95
4.2. Картирование потенциальных внутренних промоторов оперона mcc in vivo 97
4.3. Картирование активных внутренних промоторов оперона mcc in vivo методом полнотранскриптомного секвенирования 99
4.4. Проверка активности выбранных промоторов in vitro 101
Заключение 104
Выводы 105
Благодарности 106
Список литературы 107
- РНК-связывающие белки, стимулирующие терминацию
- Результаты и обсуждение
- In vitro анализ терминации транскрипции в межгенном участке mccA-mccB
- Картирование активных внутренних промоторов оперона mcc in vivo методом полнотранскриптомного секвенирования
РНК-связывающие белки, стимулирующие терминацию
Понятие аттенюации было впервые введено Чарльзом Яновским для описания механизма регуляции триптофанового оперона E. coli [Yanofsky, 1981; Kolter, 1982], и мы начнем рассмотрение аттенюаторов именно с этой классической системы.
Оперон trpEDCBA E. coli кодирует ферменты биосинтеза триптофана. Этот биосинтетический путь является весьма энергозатратным для клетки, и используется только в случае нехватки триптофана в среде [Merino, 2008]. Экспрессия этого оперона регулируется двумя независимыми механизмами. Первый механизм – регуляция инициации транскрипции ДНК-связывающим репрессорным белком TrpR [Kelley, 1982]. TrpR также связывает триптофан. В связанной с триптофаном форме TrpR связывается с оператором, который пересекается с триптофановым промотором. Связывание репрессора физически блокирует посадку РНКП на промотор и таким образом не позволяет произойти инициации транскрипции генов trpEDCBA. В условиях избытка триптофана репрессия за счет действия TrpR приводит 80-кратному снижению уровня транскрипции trp оперона по сравнению с уровнем транскрипции, наблюдаемым в отсутствие триптофана [Yanofsky, 1984]. Тем не менее в клетках, где ген, кодирующий TrpR, удален или мутирован, все еще можно наблюдать индукцию триптофанового оперона в ответ на недостаток триптофана. Эта индукция, которая, очевидно, не связана с TrpR, происходит за счет аттенюа-ции транскрипции. Аттенюация транскрипции позволяет прекратить продолжение синтеза trpEDCBA транскриптов в присутствии триптофана, если инициация транскрипции все же произошла в то время, когда репрессор диссоциировал от оператора. Два механизма, регуляция инициации транскрипции посредством TrpR и аттенюация транскрипции, работают независимо, и эффективность каждого из них определяется концентрацией триптофана в цитоплазме. Учитывая максимальный 80-кратный уровень репрессии на уровне инициации транскрипции и 8-кратный на уровне аттенюации, совокупно клетка получает возможность обеспе 18 чить 600-кратное изменение уровня экспрессии триптофанового оперона в зависимости от внутриклеточной концентрации триптофана [Gollnick, 2002; Yanofsky, 1984].
Аттенюация триптофанового оперона происходит следующим образом. Ли-дерный транскрипт trp длиной 141 п.о. содержит четыре области (1, 2, 3 и 4), которые могут формировать три взаимоисключающие шпилечные структуры (Рис. 3): паузирующую (1:2), антитерминатор (2:3) и терминатор (3:4). Этот транскрипт также кодирует лидерный пептид длиной 14 аминокислот, содержащий два трип-тофановых остатка, расположенных друг за другом. Рамка считывания этого пептида находится перед аттенюатором и частично перекрывается с областью 1.
Вскоре после инициации на новосинтезированной РНК формируется паузи-рующая структура, образованная комплементарными областями 1 и 2 [Landick, 1985]. В паузированном комплексе сайт связывания рибосомы перед геном trpL уже синтезирован и открыт для посадки рибосомы, поэтому на нем может произойти инициация трансляции. В ходе трансляции лидерного пептида рибосома разрушает вторичную структуру 1:2, что позволяет РНКП продолжить транскрипцию, которая оказывается сопряженной с трансляцией лидерного пептида. Так как открытая рамка считывания лидерного пептида содержит два последовательно расположенных триптофановых кодона, лежащих в области 1, в зависимости от внутриклеточной концентрации триптофана возможны два варианта дальнейшего развития событий.
Если вследствие низкого уровня триптофана в клетке возникает дефицит аминоацилированной триптофановой тРНК, движение рибосомы задерживается на тандеме триптофановых кодонов. Так как РНКП продолжает элонгацию, сопряжение транскрипции и трансляции нарушается, и насцентный транскрипт за областью 1 оказывается не занят рибосомой. В результате формируется антитерминаторная структура 2:3. Эта структура сама по себе не влияет на скорость элонгации, и РНКП продолжает элонгацию и синтезирует полноразмерный транскрипт, кодирующий ферменты биосинтеза триптофана.
Если же в клетке достаточно триптофана и, как следствие, аминоацилиро-ванной триптофановой тРНК, рибосома не задерживается на тандеме триптофано-вых кодонов, а продолжает двигаться в сопряжении с РНКП до конца рамки считывания лидерного пептида. Транслирующая рибосома закрывает собой область 2, расположенную сразу за стоп-кодоном лидерного пептида, но оставляет свободной область 3, расположенную ниже по ходу транскрипции. Таким образом формирование антитерминатора 2:3 блокируется. Так как последовательность области 3 комплементарна последовательности области 4 аттенюатора, образуется шпилька 3:4, которая является частью фактор-независимого терминатора. Под действием этого терминатора транскрипцию trp оперона прекращается и, таким образом, синтезируется лишь короткая РНК, не содержащая генов биосинтеза триптофана.
Сходным образом организован контроль экспрессии многих других оперо-нов энтеробактерий, отвечающих за биосинтез аминокислот, таких как гистидин, фенилаланин, лейцин, треонин, изолейцин. Принципиально механизмы регуляции идентичны, с очевидной заменой в открытой рамке считывания лидерного пептида тандема триптофановых кодонов на несколько (до шести), расположенных подряд кодонов, узнающихся соответствующими аминоацилированными тРНК [Yanofsky, 2000]. Описанный механизм консервативен среди протеобактерий, а также встречается у некоторых грамположительных бактерий [Vitreschak, 2004
Результаты и обсуждение
Антитерминаторный белок BglG регулирует экспрессию оперона bglGFBH (-glucoside utilization) E. coli, отвечающего за использование -глюкозида. В экспериментах in vitro в отсутствие BglG 90% транскриптов терминируют на сильном терминаторе, расположенном в лидерной РНК перед геном bglG [Mahadevan, 1987]. Белок BglG имеет две формы, фосфорилированного мономера или дефосфорили-рованного димера [Rothe, 2012]. Мономер неактивен, тогда как димерная форма может связываться с участком лидерной РНК оперона, расположенным возле терминатора, стабилизируя конкурирующую структуру, антитерминатор, и обеспечивая транскрипцию всего оперона [Boss, 1999]. РНК-связывающая активность BglG регулируется транспортером -глюкозида, белком BglF. Он относится к классу PTS (фосфоенолпируват-зависимых фосфотрансфераз), сахарных пермеаз, которые фосфорилируют сахара при их транспорте внутрь клетки. В отсутствие глюкозид-ного субстрата BglF фосфорилирует BglG, используя тот же активный сайт, что и при фосфорилировании сахара [Chen, 1997]. При наличии -глюкозида в среде BglF переносит фосфатную группу с BglG на -глюкозид, а дефосфорилированный BglG димеризуется и благодаря своей антитерминаторной активности активирует транскрипцию оперона утилизации -глюкозида.
Несистематическая группа, в которую принято объединять грамположительные бактерии с «низким GC-составом» (low-G+C Gram-positive bacteria), включает в себя Bacilli, Clostridia и Mollicutes [Wolf, 2004]. BglG относится к крупному семейству регуляторных белков BglG/SacY, которые регулируются путем фосфорилирования-дефосфорилирования сахарной пермеазой PTS. Эти антитерминаторные белки состоят из N-концевого РНК-связывающего домена, или CAT (co-antiterminator), и двух регуляторных доменов, отвечающих на сигналы от PTS системы, PRD (PTS-regulated domains) [Aymerich, 1992]. Такие белки очень характерны для грамположительных бактерий, тогда как у Е. coli пока найден всего один такой белок, BglG, прототип семейства BglG/SacY [Aymerich, 1992]. К этому семейству также относятся регуляторы bgl оперона LicT и оперона утилизации сахарозы SacY В. subtilis, LacT Lactobacillus casei и множество других регуляторных белков. У В. subtilis одновременно представлены сразу четыре таких системы, несмотря на сходство входящих в эти системы белков, обладающие высокой селективностью по отношению к соответствующим сахарам [Hbner, 2011].
Известны лишь несколько орфанных систем, где РНК-связывающие белки, стимулирующие антитерминацию, не имеют гомологии с BglG/SacY и между собой [Gollnick, 2002]. К таким орфанным бекам относится регулятор НшР, который изменяет экспрессию hut оперона В. subtilis в ответ на изменение концентрации L-гистидина. Гексамер НшР, активированный гистидином, связывается с лидерной РНК hut оперона, разрушая терминаторную структуру, в результате чего экспрес-сируются нижележащие гены, позволяющие использовать гистидин в качестве источника углерода и азота [Kumarevel, 2005].
Во всех описанных выше системах антитерминация достигалась за счет связывания какого-либо фактора с насцентным транскриптом. Однако в некоторых случаях регуляция происходит благодаря модификации самой РНКП таким образом, что изменяется ее чувствительность к сигналам терминации и паузинга на РНК.
Геном фага , заражающего клетки Е. coli, содержит два набора генов, ранние и поздние, которые экспрессируются на разных стадиях заражения. Располо 27 женный между двумя наборами р-зависимый терминатор в начале инфекции не позволяет транскрипции пройти дальше раннего региона. Одним из продуктов ранних генов является белок N, который узнает специальную nut (N utilization sequence) последовательность, представляющую собой небольшую шпильку в РНК [DeVito, 1994], расположенную недалеко от сайта терминации. Белок N связывается с РНКП, а также привлекает клеточные Nus белки. Такой комплекс РНКП с N, Nus белками и некоторыми другими факторами [Santangelo, 2011] не останавливается на р-зависимом терминаторе, и происходит экспрессия поздних генов [DeVito, 1994]. Антитерминации фага представляет собой пример системы, в которой ан-титерминаторный белок предотвращает терминацию р-зависимого терминатора. Сходный механизм с участием nut последовательности и Nus белков также задействован при регуляции экспрессии клеточных генов, кодирующих рРНК Е. СОІІ [Condon, 1995].
Еще одним оригинальным примером преодоления р-зависимой терминации может служить регуляция экспрессии генов оперона tnaCAB Е. coli, триптофаназ-ного оперона, продукты которого обеспечивают использование триптофана в качестве источника азота и углерода. Оперон содержит лидерную область длиной около 300 нт, несущую короткую открытую рамку считывания tnaC, за которой следует р-зависимый терминатор и затем структурные гены tnaAB. В обычных условиях экспрессия генов блокируется р-зависимым терминатором, расположенным перед структурными генами.
Избыток триптофана, во-первых, делает возможным синтез триптофансо-держащего лидерного регуляторного пептида ТпаС, а во-вторых, приводит к длительной задержке рибосомы на терминаторном кодоне, благодаря чему рибосома физически блокирует связывание р-фактора с РНК, и делает терминацию транскрипции невозможной. Задержка происходит при совместном действии регуляторного пептида и свободного триптофана. Каким-то не совсем еще понятным, но зависимым от свойств пептида образом высокая концентрация триптофана приводит значительному замедлению отщепления ТпаС-пептидил-тРНКРго (пролиновый ко-дон предваряет терминаторный кодон в открытой рамке считывания ТпаС) от рибосомы [Gong, 2001; Gong, 2002]. Показано, что для блокирования терминации трансляции необходимо связывание свободного L-триптофана возле пептидил-трансферазного центра [Cruz-Vera, 2006; Cruz-Vera, 2008], сайт для этого связывания, судя по всему, создается благодаря взаимодействию пептида TnaC с частью выходного канала рибосомы, образованной большой субъединицей [Martnez, 2012; Martnez, 2013].
Существуют и другие примеры пептидов, регулирующих собственный синтез за счет взаимодействий в выходном канале рибосомы, однако во всех описанных случаях такие пептиды активируют механизмы устойчивости к антирибосо-мальным антибиотикам или служат сигналами мембранной транслокации/секреции содержащего такой регуляторный пептид белка. Такие пептиды действуют без участия свободной аминокислоты, необходимость свободного триптофана для остановки терминации трансляции – уникальное свойство триптофаназной системы [Tenson, 2002]. Для успешной индукции оперона триптофаном нужно, чтобы рибосома остановилась на стоп-кодоне лидерного пептида раньше, чем РНКП закончит транскрипцию лидерного участка. Синхронизацию этих процессов обеспечивает, как и во многих других аттенюаторных системах, транскрипционная пауза, расположенная в середине открытой рамки считывания tnaC, на которой РНКП приостанавливается, но продолжает движение при активной трансляции этой рамки [Gong, 2003].
In vitro анализ терминации транскрипции в межгенном участке mccA-mccB
Как описано выше, нам не удалось детектировать короткий транскрипт mccA в клетках, несущих оперон mcc с нарушенной последовательностью Шайна-Дальгарно перед открытой рамкой считывания mccA. Такой результат может наблюдаться в двух случаях: если свободный от рибосомы транскрипт крайне нестабилен либо если связывание рибосомы по какой-то причине необходимо для появления короткого транскрипта. Чтобы проверить последнюю гипотезу, мы провели ряд экспериментов по in vitro транскрипции и сопряженной транскрипции-трансляции.
Нам не удалось наблюдать терминацию транскрипции в межгенном районе mcc в экспериментах in vitro ни на линейной, ни на суперскрученной плазмидной матрице. Промотор Pmcc mcc оперона не является сильным промотором даже в присутствии активатора транскрипции cAMP-CAP. Чтобы повысить эффективность инициации, мы использовали химерную матрицу, где фрагмент, содержащий сильный фаговый промотор с модифицированной последовательностью начального транскрипта T7 A1 (-67/+30) (см. раздел Материалы и методы) слит с начальным фрагментом оперона mcc (+1+154). Полученная химерная матрица не содержит тиминов в матричной цепи до положения +35, что дает возможность получать остановленные элонгационные комплексы, используя рибонуклеотидный праймер C-1pA+1pU+2pC+3 для инициации транскрипции, ATP, GTP и 32P-CTP. При добавлении UTP или смеси четырех рибонуклеотидов в реакционную смесь элонгация остановленными комплексами может быть синхронно продолжена. Как видно из Рис. 14А (дорожка 2), при возобновлении движения остановленного комплекса добавлением смеси рибонуклеотидов синтезируется только полноразмерный транскрипт, а терминации не наблюдается. Если же элонгация остановленного комплекса проводилась в присутствии компонентов системы in vitro трансляции PURExpress, наряду с полноразмерным синтезировался и более короткий транскрипт, 3 -конец которого совпадал с определенным in vivo 3 -концом mccA (Рис. 14А, дорожка 5). Система PURExpress содержит очищенные компоненты, необходимые для трансляции белка: рибосомы, инициаторные и терминаторные факторы, а также смесь аминокислот, тРНК и аминоацил-тРНК-синтетаз. Чтобы определить, какой именно из компонентов системы PURExpress необходим для появления короткого транскрипта, мы использовали варианты системы, не содержащие либо рибосом – PURExpress Ribosomes (Рис. 14А, дорожка 3), либо аминокислот и тРНК – PURExpress (aa, tRNA) (Рис. 14А, дорожка 4). Как видно из приведенных данных, для появления короткого транскрипта необходимо присутствие рибосом, но не аминокислот или тРНК.
Чтобы определить место связывания рибосомы, мы провели тоупринт-анализ (toeprint) – картирование положения рибосом на РНК. При тоупринт-анализе после связывания рибосомы с РНК проводится удлинение меченого праймера, гибриди-зованного с РНК ниже по ходу трансляции. В отсутствие рибосомы обратная транскриптаза доходит до конца РНК-матрицы, синтезируя полноразмерную кДНК. Связанная рибосома является препятствием для обратной транскриптазы, вызывая ее преждевременную остановку и образование укороченного продукта обратной транскрипции (тоупринт), по расположению которого можно определить положение рибосомы. Даже при удлинении праймера в отсутствие рибосом обратная транскриптаза останавливалась в нескольких точках РНК mccA (Рис. 14Б, дорожка 1), что может свидетельствовать о высокой структурированности этой моле 66 кулы. Этот эффект усиливался в присутствии компонентов системы PURExpress Ribosome (Рис. 14Б, ср. дорожки 1 и 2).
Рибосомы стимулируют терминацию транскрипции в межгенном участке mccA-mccB in vitro. А. Остановленные элонгационные комплексы РНКП формировали на ДНК-матрице, состоящей из Т7 А1 промотора, слитого с фрагментом оперона mcc (+1+154). Элонгацию возобновляли добавлением смеси рибонуклеотидов (дорожка 2) или смеси рибонуклеотидов с системой PURExpress Ribosome (дорожка 3), PURExpress (aa, tRNA) (дорожка 4) или полной системой PURExpress (дорожка 5). Представлена авторадиограмма электрофоретического разделения продуктов реакции in vitro транскрипции. ПП – полноразмерный продукт, ПТ – продукт терминации, ЭК34 – РНК остановленного 34-нт элонгационного комплекса. Б. РНК mccA смешивали с компонентами системы PURExpress в условиях, идентичных условиям эксперимента А, и проводили реакцию обратной транскрипции с праймером, комплементарным 3 -концу РНК. Продукты реакции разделяли в денатурирующем полиакриламидном геле рядом с продуктами реакции секвенирова-ния ДНК mcc(+1+154), проведенной с тем же праймером. Реакция, нанесенная на дорожку 5, также содержала 50 мкМ тиострептона. Полноразмерный (ПП) и укороченные продукты реакции обозначенный +17/20, соответствует рибосоме, P-сайт которой связан на первом (+17) или втором (+20) ко-донах открытой рамки считывания mccA [Orelle, 2013b]. В. Условия эксперимента идентичны описанным в А, но остановленные элонгационные комплексы формировали на матрице, содержащей mcc без мутаций (wt), с заменой в старт-кодоне mccA (ATG1 - TAA) либо с заменами удлинения праймера обозначены стрелками. 3 -конец синтезированных продуктов кДНК, обозначенный +17/20, соответствует рибосоме, P-сайт которой связан на первом (+17) или втором (+20) ко-донах открытой рамки считывания mccA [Orelle, 2013b]. В. Условия эксперимента идентичны опи 67
санным в А, но остановленные элонгационные комплексы формировали на матрице, содержащей mcc без мутаций (wt), с заменой в старт-кодоне mccA (ATG1 - TAA) либо с заменами в последовательности Шайна-Дальгарно (SD). Г РНК mcc(+1+154) без мутаций (wt) или несущие мутации (ATG1 - TAA или SD) использовали для тоупринт-анализа в присутствии системы PURExpress (aa, tRNA). Д. Открытая рамка считывания mccA и начало межгенного участка. Кодоны обозначены вертикальными линиями. Розовый, зеленый, фиолетовый и черный кружки показывают положения P-сайта рибосомы, которым соответствуют продукты тоупринт-анализа, обозначенные такими кружками на панелях Б и Г. Черный кружок соответствует расположению P-сайта рибосомы на рамке считывания +1.
В присутствии PURExpress (aa, tRNA) наряду с полноразмерным продуктом наблюдалась четкая полоса, соответствующая расстоянию 17/20 нт от начала открытой рамки считывания mccA (Рис. 14Б, дорожка 3), что соответствует расположению рибосомы на первом и втором кодонах mccA, соответственно [Orelle, 2013b]. Также наблюдались дополнительные точки остановки обратной транскрип-тазы вплоть до позиции +31 нт от старт-кодона mccA, соответствующие сканированию рибосомой вниз по РНК матрице. С полной системой in vitro трансляции (Рис. 14Б, дорожка 4) наблюдалось изменение набора продуктов обратной транскрипции: в дополнение к продуктам, соответствующим рибосоме, связанной с началом открытой рамки считывания mccA, появляются дополнительные продукты в положении +36 относительно старт-кодона, соответствующие рибосоме, находящейся на последнем кодирующем кодоне рамки считывания. Добавление антибиотика тиострептона, ингибирующего транслокацию [Orelle, 2013a], к реакциям с полной системой PURExpress приводило к накоплению продукта +17 нт, соответствующего рибосоме, находящейся на инициаторном кодоне, и исчезновению нижележащих полос (Рис. 14Б, дорожка 5).
Для дальнейшего подтверждения идеи о достаточности связывания рибосомы для стимуляции терминации транскрипции мы провели серию экспериментов на матрицах, содержащих мутации в области инициации трансляции открытой рамки считывания mccA. Использованные матрицы содержали замену старт-кодона на стоп-кодон (ATG1- TAA) либо мутации в последовательности Шайна-Дальгарно (SD). Терминация транскрипции в присутствии полной системы PURExpress не зависит от мутации старт-кодона (Рис. 14В, ср. дорожки 4 и 5), но значительно падает на матрице с мутацией в SD-последовательности (Рис. 14В, дорожка 6). В последнем случае наблюдалась также диффузная полоса чуть выше полноразмерного продукта. По всей видимости, эта полоса соответствует нуклео 68 литической деградации полноразмерного продукта в присутствии компонентов системы PURExpress, так как полоса такого же размера наблюдалась при инкубации очищенного продукта транскрипции с компонентами полной системы PURExpress (Рис. 15, ср. дорожки 2 и 3).
Картирование активных внутренних промоторов оперона mcc in vivo методом полнотранскриптомного секвенирования
При анализе библиотеки «+TEX» было найдено 7 возможных промоторов в прямом и 6 в обратном направлении. Большая часть найденных точек транскрипционного старта совпадала с точками старта определенными в эксперименте с определением активности GalK. Совокупно на основании данных dRNAseq и скрининга по активности GalK были выбраны 13 потенциальных промоторов для дальнейшей проверки активности в опытах in vitro.
Для проверки активности потенциальных внутренних промоторов кластера mcc in vitro использовались соответствующие ПЦР фрагменты, 70-холофермент РНКП E. coli и динуклеотидмонофосфат, соответствующий позициям -1+1 или +1+2 определенных in vivo точек старта. Стартовые точки полученных in vitro транскриптов картировали при помощи реакции удлинения праймера на in vitro синтезированной РНК. Из протестированных 13 промоторов шесть проявили активность in vitro (три прямых: 4377, 7091, 7854 и три обратных: R5612, R6931, R9164). Также была подтверждена активность показанного ранее in vivo промотора PmccF. Результаты картирования указанных точек старта транскрипции in vitro и последовательности промоторов показаны на Рис. 30. Два антисенс-промотора находятся внутри mccABCDE оперона, они расположены в начале гена mccE – PR6(6931) и в начале гена mccD – PR7 (R5612). Обнаружен также дополнительный сильный промотор PR5 (R9164) в начале гена mccF, в то время как в опытах по удлинению праймера на РНК, выделенной из клеток-продуцентов детектировался единственный промотор PmccF (R9243) [А. Тихонов, неопубликованные данные]. Три активных сонаправленных с Pmcc промотора, P2 (4377), P3 (7091) и P4 (7854), обнаружены внутри оперона mccABCDE. Ни один из них не расположен непосредственно перед генами устойчивости. Промотор P4 находится близко к 3 -концу mccE и не может обеспечивать устойчивость к McC. Слабый промотор P2 находится в начале гена mccC. С РНК, инициированной с промотора P2, могла бы синтезироваться укороченная форма MccC. Возможность функционирования укороченной формы MccC в качестве экспортной помпы для McC не исключена, однако требует экспериментальной проверки. Данные dRNAseq также продемонстрировали наличие в выращенных с добавлением глюкозы клеток транскрипта mccE, иницирован-ного с одного из двух промоторов, расположенных в начале mccE (6535 или 6361, Рис. 29) и укороченного транскрипта mccE, инициированного с P3.
Рис. 30. Промоторы микроцинового оперона: сводные данные in vivo и in vitro картирования. А. Картирование стартов транскриптов. Б. Последовательности найденных промоторов и методы детекции. В последних трех столбцах показаны результаты детекции промоторов всеми тремя использованными методами. Числа обозначают координату старта транскрипции промотора, антисенс промоторы обозначены буквой «R». В нижней строке таблицы показана консенсусная последовательность 70 промотора. Ниже таблицы показана структура основного промотора оперона Pmcc. В. Схема расположения подтвержденных внутренних промоторов микроцинового оперона.
Из перечисленных промоторов 6361 и P3 имеют близкую к консенсусу -10 последовательность (Рис. 30Б). Тем не менее, только P3 был активен в транскрипции in vitro с 70-холоферментом РНКП. Возможно, для активности промоторов 6535 и 6361 требуются дополнительные транскрипционные факторы либо альтернативный -фактор. С укороченного транскрипта mccE, инициированного с промоторов P3, 6535 или 6361 мог бы транслироваться укороченный вариант МccE, содержащий ацетилазный домен, которого должно быть достаточно для обеспечения иммунности к McC [Novikova, 2010]. На возможную активность подобных внутренних промоторов указывают также результаты ранних опытов лаборатории Морено [Novoa, 1986]. В этих экспериментах клетки, несущие плазмиды, содержащие фрагменты от 3 -конца гена mccB до 3 -конца гена mccF или от 3 -конца гена mccB до середины mccE приобретали полную или частичную устойчивость к McC. Весьма вероятно, что инициированные с расположенных в этих фрагментах внутренних промоторов транскрипты обеспечивали устойчивость клеток в McC. В клетках, несущих все гены mcc такие транскрипты могли бы обеспечивать иммунность клеток к McC на ранних стадиях роста в отсутствие активного MccF.
В данной работе было подробно исследовано, каким образом регулируется экспрессия различных компонентов системы синтеза микроцина С. Мы задались вопросом, каким образом в системе, где субстрат и модифицирующий его фермент кодируются генами одного оперона, возможна эффективная продукция антибиотика. Наши данные продемонстрировали, что эффективность продукции обеспечивается коротким моноцистронным транскриптом, содержащего лишь рамку считывания структурного гептапетида mccA. Также был показан механизм трансляционной аттенюации, обеспечивающий образование этого транскрипта, и показана эволюционная консервативность этого механизма.
Вторая часть работы посвящена ответу на вопрос, каким образом обеспечивается своевременная устойчивость клеток к антибиотику, который они синтезируют. Проанализировано влияние белков иммунности MccE и MccF на скорость роста клеток-продуцентов микроцина С и их влияние на эффективность продукции антибиотика. Было впервые показано наличие нескольких внутренних промоторов в составе кластера mcc, обеспечивающих устойчивость клеток к микроцину С на ранних стадиях роста. Полученные нами данные расширяют знания о способах регуляции продукции токсичных для клетки веществ.
