Введение к работе
Актуальность темы исследования. По данным организации «European Food Safety Authority» Bacillus cereus является четвертой по распространенности причиной пищевых отравлений. Вид Bacillus cereus входит в состав группы В. cereus представителями которой являются В. anthracis, вызывающий сибирскую язву; В. thuringiensis, продуцирующий параспоральные кристаллы токсина, действующего на определенные виды насекомых, и, сравнительно недавно охарактеризованный как отдельный психротолерантный вид, В. weihenstephanensis. Бактерии этой группы широко распространены в природе и часто встречаются в почве. Гены, предающие специфические свойства В. anthracis и В. thuringiensis, локализованы на макроплазмидах. Однако отдельно взятый штамм представителя группы В. cereus может синтезировать до десятка токсинов, гены которых расположены на бактериальной хромосоме. Некоторые из этих токсинов могут вызывать тяжелые отравления у людей, в том числе - со смертельным исходом. Особый интерес вызывают два пороформирующих токсина - гемолизин II и цитотоксин К. Аминокислотная последовательность гемолизина II сходна с последовательностью цитотоксина К (37% идентичности). Оба токсина относятся к семейству Р-складчатых пороформирующих токсинов. К другим представителям этого семейства относят а-гемолизин, лейкоцидины, у-гемолизин Staphylococcus aureus и Р-токсин Clostridium perfringens. Однако регуляция экспрессии генов гемолизина II и цитотоксина К осуществляется независимо. Ген цитотоксина К находится под контролем транскрипционного активатора PlcR, включающего экспрессию большинства токсинов В. cereus по механизму «чувства кворума» {«quorum sensing»), в то время как экспрессия гемолизина II репрессируется транскрипционным регулятором HlyllR.
Для того чтобы обеспечить быстрое переключение экспрессии генов в ответ на изменение условий внешней среды, активность РНК-полимеразы строго контролируется. Стадия инициации транскрипции является главным этапом контроля регуляции генной экспрессии. Изучение взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами генов и влияния на это взаимодействие транскрипционных факторов является важнейшей задачей молекулярной биологии, позволяющей определить механизмы реализации информации, заложенной в геноме организма. Большинство накопленных к настоящему времени данных, описывающих инициацию транскрипции, базируются на результатах, полученных на моделях РНК-полимераз Е. coli и Thermus thermophilus, молекулы которых имеют ряд существенных структурных и
функциональных отличий от РНК-полимераз микроорганизмов группы В. cereus. Понимание механизмов регуляции экспрессии, в особенности, генов токсинов Bacillus cereus и детальное изучение взаимодействия РНК-полимеразы с их промоторами, несомненно, представляют интерес для молекулярной биологии. Актуальность исследования регуляции генов токсинов бактерий рода Bacillus не вызывает сомнений. Более того, впоследствии, результаты исследований могут послужить основой для создания новых лекарственных препаратов используемых при терапии инфекционных заболеваний.
Цели и задачи исследования:
Целью данной работы являлось изучение особенностей механизма регуляции генов пороформирующих токсинов гемолизина II и цитотоксина К у микроорганизмов группы В. cereus. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) Оценить разнообразие и особенности распределения аллелей генов цитотоксина К,
гемолизина II и его транскрипционного регулятора hlyllR в большой популяции
штаммов В. cereus, выделенных из различных природных источников.
2) Охарактеризовать взаимодействие РНК-полимеразы с промоторами генов
гемолизина II, цитотоксина K,plcR ирарК.
3) Определить для генов цитотоксина К и гемолизина II этапы транскрипции, на
которые влияют HlyllR и PlcR.
Научная новизна работы. Впервые определены частоты встречаемости аллелей генов цитотоксина К, гемолизина II и его транскрипционного репрессора HlyllR у 40 штаммов группы В. cereus, выделенных на территории стран СНГ. На модели В. subtilis установлено что, в случае отсутствия контроля экспрессии гена гемолизина II регулятором HlyllR, гемолитическая активность, наблюдаемая в культуре клеток, увеличивается в 200 раз, что не менее чем в 5 раз превышает гемолитическую активность родительского штамма В. cereus ВКМ В-771. Впервые детально охарактеризованы комплексы, формируемые РНК-полимеразой в ходе инициации транскрипции на промоторах генов гемолизина II, цитотоксина K,plcR ирарК. Впервые определены стадии инициации транскрипции, на которые оказывают влияние HlyllR и PlcR для промоторов генов гемолизина II, цитотоксина K,plcR ирарК.
Научно-практическая значимость работы. Представленная работа является частью серии работ, направленной на исследование регуляции инициации транскрипции у грамм-положительных микроорганизмов. Используемый в данной работе метод стабилизации открытого комплекса с помощью нуклеотидов позволяет
четко отслеживать механизм инициации транскрипции для промоторов с коротким (несколько секунд) временем полураспада открытого комплекса. Предложенный вариант анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена цитотоксина К может быть использован при разработке тест-систем, позволяющих детектировать штаммы, несущие смертельно опасный для человека аллель cytKl гена цитотоксина К. При моделировании регуляции экспрессии гена гемолизина II был создан штамм В. subtilis - суперпродуцент гемолизина II, который может послужить прототипом для су пер продуцентов других пороформирующих токсинов. Полученные в ходе данного исследования результаты имеют несомненное практическое значение и могут с успехом найти применение, как в медицинской диагностике, так и послужить основой для дальнейших научных исследований регуляции экспрессии генов Bacillus cereus.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на 10-, 11-, 12-, 13- и 14-ой Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21 века», Пущино, 2006 - 2010; CSHL Meeting on Molecular Genetics of Bacteria and Phages, Cold Spring Harbor, NY, August 20-24, 2008; International Conference on Gram-positive Pathogens. Omaha, NE, October 5-8, 2008; International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld 2009), 2009; ежегодных институтских конференциях ИБФМ РАН, где в 2008 и 2009 годах была отмечена призовыми местами, и в 2009 - премией Г.К. Скрябина.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на
страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает 178 наименований. Работа содержит 18 рисунков и 5 таблиц.
