Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Основные аспекты адаптации организмов к неблагоприятным условиям окружающей среды
1.2. Классификация и функции БТШ
1.3. Структура и эволюция генов ТШ
1.4. Экспрессия генов ТШ и ее регуляция
1.5. Участие БТШ в адаптации к экстремальным условиям
1.6. БТШ в медицине
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы
2.1.1. Геномная фаговая библиотека
2.1.2. Насекомые, условия обитания и теплового шока
2.1.3. Штаммы E. coli
2.1.4. Ферменты рестрикции
2.1.5. Зонды
2.1.6. Линии эукариотических клеток, условия культивирования и ТШ
2.2. Методы:
2.2.1. Скрининг геномной фаговой библиотеки
2.2.2. Выделение ДНК бактериофага
2.2.3. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами
2.2.4. Электрофорез ДНК
2.2.5. Построение рестриктных карт рекомбинантных фагов
2.2.6. Включение радиоактивной метки в ДНК
2.2.7. Перенос и гибридизация по Саузерну
2.2.8. ПЦР-анализ
2.2.9. Выделение фрагментов ДНК из геля
2.2.10. Клонирование фрагментов ДНК
2.2.11. Трансформация компетентных клеток
2.2.12. Выделение плазмидной ДНК
2.2.13. Секвенирование ДНК
2.2.14. Анализ последовательностей
2.2.15. Выделение фракции лимфоцитов из крови верблюда
2.2.16. Выделение тотальной РНК
2.2.17. 5’- и 3’-RACE анализ и ПЦР с обратной транскрипцией
2.2.18. Электрофорез РНК
2.2.19. Нозерн-гибридизация
2.2.20. Двумерный электрофорез белков по О’Фарреллу
2.2.21. Диск-электрофорез белков с ДДС-Na (по Лэммли) и окрашивание гелей по Кумасси G-250
2.2.22. Идентификация белков методом пептидного фингерпринтинга
2.2.23. Экспрессия и очистка белка GAF
2.2.24. Получение белковых экстрактов
2.2.25. Анализ связывания факторов транскрипции с элементами теплового шока (EMSA)
2.2.26. Получение репортерных конструкций
2.2.27. Трансфекция плазмид и измерение интенсивности люминесценции
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Клонирование и анализ структуры кластера генов hsp70A1 у верблюда Camelus dromedarius
3.2. Дифференциальный анализ экспрессии генов hsp1A, hspA1B и hspA1L
3.3. Клонирование и анализ структуры кластера генов hsp83 у S. singularior и O. pardalina
3.4. Сравнение последовательностей генов hsp83 и hsp70 у Stratiomys singularior и Stratiomys japonica
3.5. Анализ экспрессии генов hsp83 у S. singularior и O. pardalina
3.6. Сравнительный анализ структуры промоторных областей генов группы hspA1 верблюда и других видов млекопитающих
3.7. Сравнение активности промоторов hsp70 C. dromedarius и H. sapiens в культуре клеток HEK293
3.8. Сравнительный анализ структуры промоторных областей генов hsp70 и hsp83 S. singularior и O. pardalina
3.9. Сравнение активности промоторов hsp70 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток D. melanogaster Schneider2
3.10. Эффект вставки GAGA-сайтов в промотор гена hsp70S3
3.11. Сравнение активности промоторов hsp83 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток Schneider2
Глава 4. Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы
Приложение
Благодарности
- Классификация и функции БТШ
- Насекомые, условия обитания и теплового шока
- Дифференциальный анализ экспрессии генов hsp1A, hspA1B и hspA1L
- Сравнительный анализ структуры промоторных областей генов hsp70 и hsp83 S. singularior и O. pardalina
Классификация и функции БТШ
Общепринятой является классификация БТШ по их молекулярной массе. Это обосновано тем, что электрофоретические фракции БТШ разных организмов приблизительно соответствуют друг другу по молекулярной массе. Каждое семейство БТШ является продуктом группы родственных генов, поэтому степень гомологии между отдельными представителями семейства часто весьма высока. Многие члены БТШ консервативны, однако их спектр значительно варьирует в зависимости от вида организма и от действующего фактора (Маргулис, 2000). На данный момент выделяют следующие семейства БТШ: низкомолекулярные БТШ (нмБТШ), семейство БТШ40, БТШ60, БТШ70 – самое многочисленное семейство, БТШ90, БТШ100 (Lindquist, 1986). Низкомолекулярные БТШ (нмБТШ) К нмБТШ относят БТШ с молекулярной массой от 12 до 43 кДа, -А- и -В-кристаллины. Гомология между белками этой группы составляет около 40%. Они имеют консервативный -кристаллиновый домен, который состоит из 80-100 а.о. в С-концевой области, образующих 9 -складчатых структур (Hu, 2007). На N-конце многих нмБТШ найден консервативный SRLFDQFFG-регион, играющий большую роль в стабильности структуры - и -кристаллинов (Pasta, 2003). Взаимодействуя своими -складчатыми структурами, нмБТШ способны образовывать с соседними мономерами гомо- и гетероолигомерные комплексы с молекулярными массами 200-400 кДа, обладающие шаперонной активностью (Ganea, 2001). При повышении температуры эти комплексы диссоциируют и в виде димеров нмБТШ взаимодействуют с денатурированными белками, образуя массивные гранулы. При этом они экранируют гидрофобные участки денатурированных белков, препятствуя их от агрегации, и передают их БТШ70 (Гусев, 2002). Основной функцией нмБТШ считается стабилизация поврежденного стрессом актинового цитоскелета фосфорилированной формой белка БТШ27 (Гусев, 2002). Благодаря своей способности образовывать массивные мультимерные структуры -кристаллины формируют основу хрусталика глаза (Horwitz, 1976). Для нмБТШ характерен высокий уровень экспрессии на определенных стадиях развития и в определенных тканях (Гусев, 2002).
Конститутивно повышенный уровень синтеза нмБТШ защищает клетки от TNF-индуцированного апоптоза и окислительного стресса. Кроме того, нмБТШ способны блокировать апоптоз, индуцированный другими путями, как, например, активацией рецепторов клеточной поверхности FAS/APO-1, являющихся медиаторами апоптоза, так и ингибитором протеинкиназы С – стауроспорином (Mehlen, 1996). Считается, что основная защитная роль принадлежит БТШ22, БТШ23, БТШ26 и БТШ27. Эти белки локализованы внутри клетки следующим образом: БТШ22 – в митохондриях, БТШ23 и БТШ26 – в цитозоле, БТШ27 – в ядрах (Маргулис, 2000). Семейство БТШ40 БТШ40 относят к семейству так называемых J – белков, благодаря гомологии с белком E. coli DnaJ (Kelley, 1998). Характерной особенностью этой группы является наличие N-концевого J–домена, построенного из четырех -спиралей и содержащего консервативный трипептид HPD (Frydman, 2001). С-концевым шаперонным доменом БТШ40 могут связываться с денатурированными белками, предотвращая их агрегацию (Kampinga, 2010; Mayer, 2010). Кроме того, эти белки являются кошаперонами БТШ70, связываясь с ними посредством N-концевого J–домена. БТШ40 стимулирует АТФазную активность БТШ70 и стабилизирует его комплекс с субстратом (Chun-Yang, 2003). Различные представители семейства J-белков функционируют в цитозоле, эндоплазматической сети и митохондриях, выступая кофакторами для цитозольных БТШ70 и HSC70, эндоплазматического HSPA5/BiP и митохондриального HSPA9/GRP75 (Christis, 2008). У человека семейство БТШ40 представлено 44 белками (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/). У D. melanogaster на сегодня обнаруживаются 5 белков, имеющих в своем составе J-домен, по мере дальнейшего анализа информации, имеющейся в геномных базах данных, это число может увеличиться. Семейство БТШ60 Это семейство стрессовых белков выделяют в отдельную группу шаперонинов. Шаперонины в отличие от шаперонов формируют сложные структуры в виде стопки из двух колец, каждое из которых состоит из семи мономеров массой 60кДа (Horwich, 2006). В центре кольца между мономерами имеется внутренняя пора, в которой происходит фолдинг белков. В аминокислотной последовательности каждого из мономеров присутствует несколько остатков гидрофобных аминокислот, обращённых внутрь поры. С этими гидрофобными остатками взаимодействуют белки-субстраты, фолдинг которых требует гидролиза АТФ. Шаперонины делятся на две группы. К первой относятся белки-гомологи бактериальных БТШ60 и БТШ10, обозначающихся как GroEL и GroES соответственно. GroES выступает в роли кофактора для GroEL. У человека охарактеризованы два белка (гомолог GroEL и HSPE - гомолог GroES), кодируемых единичными генми HSPD, которые функционируют в митохондриях. Белки, относящиеся ко второй группе, обозначаются как CCT или TRiC, функционируют в цитозоле эукариот (а также у архей) и формируют олигомеры из 8-и субъединиц, каждая из которых кодируется собственным геном. Они имеют 30% гомологию друг с другом и 15 – 20% гомологию с GroEL, что говорит об их общем эволюционном происхождении (Brackley, 2009). Тогда как система GroEL-GroES работает у бактерий и в митохондриях, CCT обнаружен у архей и в цитозоле эукариот. У последних он участвует в фолдинге основных компонентов цитоскелета, актина и тубулина, а также некоторых белков, участвующих в регуляции клеточного цикла (Brackley, 2009). Для взаимодействия белков-субстратов с ССТ необходимо их предварительное взаимодействие с белком-переносчиком, получившим название префолдин, который маркирует субстраты ССТ (Vainberg, 1998). В отличие от GroEL, CCT не имеет кофакторов, подобных GroES. Закрытие центральной полости, формируемой октамером CCT, происходит за счет изменения конформации апикальных частей субъединиц самого CCT (Mayer, 2010). Семейство БТШ70
Это семейство является главным элементом защитного аппарата клетки. Молекула БТШ70 состоит из N-концевого консервативного домена молекулярной массой 44кДа, обладающего АТФ-связывающей и (в присутствии БТШ40) АТФ-азной активностью (Flaherty, 1990). C-концевой вариабельный домен является субстрат-связывающим участком и имеет молекулярную массу 18 кДа (Frydman, 2001). Этот домен состоит из двух -спиралей, узнающих гидрофобные области денатурированных белков. Субстрат-связывающий участок БТШ70 по структуре очень напоминает пептид-связывающий домен молекул MHC, в особенности MHC II, но характеризуется более «открытой» структурой, что позволяет ему взаимодействовать с более длинными полипептидами (Flajnik, 1991). Было высказано предположение, что гены MHC дивергировали из генов БТШ70 на ранних этапах эволюции позвоночных. N- и C-домены разделены короткой последовательностью, в которой расположен сайт узнавания белка протеолитическими ферментами (Маргулис, 2000).
Семейство БТШ70 включает в себя множество членов, выполняющих различную роль в отдельных клеточных компартментах. В клетке млекопитающих в цитозоле обнаружены белки БТШ68, БТШ72, БТШ73, а также конститутивный БТШ70 (HSC70) (Morimoto, 1990); в митохондриях постоянно присутствует гомолог БТШ70 – Grp75 (glucose-regulated protein 75); в ЭР – Grp78, или BiP (белок, связывающий тяжелые цепи иммуноглобулинов, Immunoglobulin heavy chain binding protein); а в лизосомах – конститутивный Hsc73 (Terlecky, 1992). В бактериях имеется всего один ген семейства БТШ70, кодирующий белок массой 69,1 кДа – DnaK (Ульмасов, 1993). Впервые подробно изучено было взаимодействие шаперонов семейства БТШ70 с субстратом на DnaK. Пептид-связывающий сайт содержит впадину, в которой и происходит связывание полипептида в неправильной конформации. БТШ70 узнает линейные полипептидные последовательности, богатые гидрофобными аминокислотами, которые в норме должны находиться внутри белковой глобулы (Frydman, 2001).
Весь процесс носит циклический характер. DnaK, находясь в АТФ-связанной форме, взаимодействует с белком-субстратом. Потом с DnaK связывается белок DnaJ, стимулирующий гидролиз АТФ и стабилизирующий комплекс DnaK-субстрат. Сродство DnaK к продукту реакции – АДФ – выше, чем к АТФ, поэтому для диссоциации АДФ требуется фактор обмена нуклеотидов. У E. coli им является белок, называемый GrpE. После диссоциации комплекса DnaK-АДФ происходит высвобождение субстрата и присоединение новой молекулы АТФ. Как правило, фолдинг белков с участием DnaK и БТШ70 требует нескольких циклов присоединения – диссоциации с гидролизом АТФ. Некоторые белки приобретают с участием DnaK или БТШ70 только промежуточную конформацию и для формирования конечной структуры они должны провзаимодействовать с другими БТШ (Houry, 2001).
Насекомые, условия обитания и теплового шока
В работе использовались три вида: S. singularior, личинки которого обитают в прибрежной зоне соленых озер Крыма, где летом происходит сильное нагревание окружающей среды, и O. pardalina, личиночная стадия у которой проходит в холодных пресных родниковых водах Ленинградской области. Температура среды обитания личинок S. singularior составляет 15-30 C в мае-августе, но может быть выше летом и ниже зимой, в то время как развитие S. japonica и O. pardalina происходит при 30–40 C и 4–10 C, соответственно. Детальные условия обитания данных видов были изучены и описаны (Garbuz, 2008, Garbuz, 2011). Личинки были подвергнуты тепловому шоку как описано у (Garbuz, 2008) с небольшими модификациями. Для O. pardalina температура контроля составляла 4 C (температура обитания личинок) (Garbuz, 2008). По аналогии для контроля у S. singularior была взята температура в 25 C. Тепловой шок для S. singularior и O. pardalina составлял 43 C и 40 C, соответственно. Для размножения бактериофага использовался штамм MRA-. Для трансформации и получения плазмидной ДНК использовался штамм DH5 и Sure2. Для рестрикции геномной и фаговой ДНК использовались рестриктазы BamHI, EcoRI, HindIII, NotI, SacI, SalI, XbaI, XhoI производства компаний «MBI Fermentas» и «Promega». 2.1.5. Зонды Для скрининга библиотеки C. dromedarius был использован ПЦР-фрагмент гена HSPA1A человека, а для библиотек S. singularior и O. pardalina фрагмент гена hsp83 родственного вида S. japonica. Для Саузерн-анализа использовался фрагмент гена hspA1A C. dromedarius, для S. singularior и O. pardalina фрагменты генов hsp83 Клетки линии HEK293 культивировали в среде DMEM/F12 с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (“HyClone”) и L-глутамина при 37С, ТШ - 43С в течение 45мин. Клетки D. melanogaster Schneider 2 культивировали в среде Schneider s Insect Medium (“Sigma”) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (“HyClone”) при 25С. ТШ вызывали, инкубируя клетки в водяном термостате при 37.5С в течение 45 мин.
Фаг выращивали на клетках E. coli (штамм MRA-). Клетки растили на среде LB с добавлением 10 мМ MgSO4. Культуру в логарифмической фазе (с оптической плотностю 0,5 – 0,6 ОЕ) концентрировали в 5 раз в среде SM (0,05М Трис-HCl рН 7,5, 0,12М NaCl, 0,08М MgSO4). Отбирали аликвоты по 100 мкл и смешивали с суспензией фаговых частиц (104 – 105 БОЕ бактериофага). Адсорбцию фага на клетках проводили в течение 15 минут при 37С, после чего суспензию инфицированных бактерий высевали на чашки Петри, как описано в (Маниатис, 1984). Чашки инкубировали при 37С в течение ночи. Для отбора рекомбинантных фагов с чашек снимали реплики на фильтры Hybond N+, Обработку фильтров, предгибридизацию, гибридизацию и отмывку проводили, как описано в пункте «Перенос и гибридизация по Саузерну». Фильтры экспонировали на рентгеновскую плёнку. Радиоавтограф сопоставляли с фаговыми бляшками на чашках Петри. Фаговые бляшки переносили уколом в пробирку с 0,5 мл среды SM. Для выделения индивидуальных фаговых клонов скрининг повторяли 3 раза, уменьшая титр фага.
Бактериофаг высевали в концентрации, при которой достигался полный лизис клеток на чашке Петри. После этого чашки с фагом качали в растворе SM около 5 часов. Раствор фага отбирали и добавляли в него хлороформ до 1%, инкубировали 15 минут при 37С и центрифугировали при + 4С при 6000g 15 минут. Супернатант переносили в чистую пробирку, добавляли ДНКазу и РНКазу до концентрации 1 мкг/мл и инкубировали 1 час при 37С. Затем добавляли NaCl до концентрации 1М, инкубировали ночь при + 4С и центрифугировали при 6500rpm 10 минут. Супернатант переносили в чистую пробирку, добавляли полиэтиленгликоль (М = 6000) до концентрации 10% (масса/объём) и инкубировали на льду в течение 1 часа, после чего центрифугировали при + 4С и 6500rpm 15 минут. Супернатант сливали, осадок растворяли в среде SM. После растворения осадка добавляли 1 объём хлороформа, перемешивали и центрифугировали при 1600g в течение 10 минут. Отбирали супернатант, добавляли ДДС-Na до концентрации 0,5%, ЭДТА до концентрации 20мМ и протеиназу К до концентрации 50 мкг/мл и инкубировали при 65С в течение 1 часа. Затем проводили последовательную экстракцию фенолом, смесью фенол/хлороформ и хлороформом. ДНК осаждали изопропиловым спиртом, промывали 70% этанолом и растворяли в стерильной деионизованной воде.
Разделение фрагментов ДНК проводили методом горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле, приготовленном на буфере ТАЕ (40мМ Трис-HCl, pH 7,6; 5мМ ацетат натрия, 2мМ ЭДТА) с добавлением бромистого этидия до концентрации 1 мкг/мл. Пробы ДНК наносили в количестве 1 – 5 мкг. Для нанесения использовали буфер состава 0,3% бромфеноловый синий и 50% раствор глицерина в ТАЕ. В качестве маркера использовали 1 kb Ladder и 100bp Ladder производства «MBI Fermentas». После завершения электрофореза гель фотографировали в ультрафиолетовом свете.
Использовали эндонуклеазы рестрикции, указанные в разделе «Материалы». Рестриктные карты строили на основе анализа длин фрагментов ДНК, получаемых в результате обработки комбинациями эндонуклеаз рестрикции в паре и каждой в отдельности. Фрагменты ДНК после рестрикции разделяли электрофорезом в агарозном геле. Длину фрагментов определяли по их электрофоретической подвижности, сравнивая с подвижностью фрагментов маркера. Окончательный вариант рестриктной карты получали после гибридизации с зондами к различным участкам генов hsp70 и межгенных последовательностей, а также получения результатов секвенирования переклонированных фрагментов.
Использовали метод стохастической гексануклеотидной затравки c большим фрагментом ДНК-полимеразы I E. coli (фрагмента Клёнова). Для проведения реакции использовали готовый набор реактивов фирмы «Amersham». На пробу брали 100 нг фрагмента ДНК и 1 – 2 мкг смеси гексануклеотидов из ДНК тимуса телёнка в 10 – 15 мкл воды. Фрагмент денатурировали при 100С в течение 5 минут, после чего добавляли по 1 – 2нМ «холодных» дНТФ, 10 – 15пМ дАТФ с 32Р в -положении (производства ИМБ РАН), реакционный буфер и 4 единицы активности фрагмента Клёнова. Реакцию проводили в течение 1 часа при 37С. От невключившейся метки зонд очищали гель-фильтрацией на колонках с сефадексом G-50 производства «Amersham» по инструкции производителя.
После электрофореза и фотографирования ДНК в геле денатурировали двукратной отмывкой в растворе 1,5М NaCl/0,5М NaOH по 20 минут каждая. Затем гель нейтрализовали двукратной отмывкой в растворе 1,5М NaCl/0,5М Трис-HCl pH 7,5 по 20 минут каждая. Перенос осуществляли по стандартной методике в 6Х SSC на мембрану Hybond N+ («Amersham»). После переноса ДНК прижигали к фильтру облучением ультрафиолетовым светом в течение 1 минуты. Фильтры инкубировали 3 – 4 ч при 65С в предгибридизационном растворе (0,1% БСА, 0,1% фикола, 0,1% поливинилпирролидона, 4Х SSC, 0,2% ДДС-Na). Гибридизацию проводили в течение 12 – 18 ч в растворе того же состава, что и для предгибридизации, но с добавлением денатурированного ДНК-зонда, меченого 32Р. Температура гибридизации и отмывки фильтров подбиралась, исходя из гомологии зонда с фрагментом ДНК. После отмывки фильтр подсушивали, заворачивали в плёнку Saran Wrap и экспонировали с рентгеновской пленкой Kodak при -70С.
Дифференциальный анализ экспрессии генов hsp1A, hspA1B и hspA1L
Для качественного анализа экспрессии генов hspA1A/B и hspA1L была проведена ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR – reverse transcription polymerase chain reaction) с праймерами к данным генам. Материалом для исследования служила тотальная РНК, выделенная из двух фракций лимфоцитов и сердечной мышцы верблюда. Первая фракция была взята в качестве контроля при температуре 37С. Лимфоцитам второй пробы был дан тепловой шок (43С в течение 20 мин).
При RT-PCR с тотальной РНК, полученной из обеих фракций лимфоцитов и сердечной мышцы, подтверждается транскрипция как гена hspA1L, так и хотя бы одного из генов hspA1A и hspA1B (рис. 5А,B). После теплового шока обнаруживается дополнительный фрагмент длиной 1252 п.о. Секвенирование показало, что он относится к кДНК гена grp78, который кодирует гомолог Hsp70, локализующийся в эндоплазматической сети (рис. 5А). Рис. 5. Экспрессия MHC-ассоциированных генов hsp70 верблюда. А. RT-PCR с мРНК из лимфоцитов со специфичными парами праймеров. B. RT-PCR с мРНК, выделенной из ткани сердечной мышцы. –RT – отрицательный контроль RT-PCR, проба без обратной траскриптазы.
Результаты RT-PCR подтверждаются путём 5 - и 3 -RACE-анализа. Данный метод позволил обнаружить 5 - и 3 -нетранслируемые фрагменты, относящиеся ко всем трём генам, как в контрольной, так и в подвергнутой тепловому шоку пробе. Таким образом, можно сделать вывод, что все три гена транскрипционно активны в периферических лимфоцитах.
Для изучения структуры генов hsp83 были секвенированы рекомбинантные клоны, которые были выделены из геномных фаговых библиотек, полученных из ДНК S. singularior и O. pardalina. Было получено 7 рекомбинантных фагов S. singularior (рис. 6А). В одном из них (С3) находятся фрагменты двух генов hsp83 в тандемной ориентации на расстоянии около 12,5 т.п.о друг от друга. Обнаруженные гены были названы hsp83S1 и hsp83S2 по аналогии с номеклатурой генов hsp70 S. singularior. Остальные клоны (C2, C4, C5, C7 и C8) содержат длинные фрагменты, перекрывающиеся различными областями с фагом С3 вместе с одним из двух генов hsp83. Оба гена hsp83 имеют типичную структуру, характерную для генов группы hsp90 всех известных двукрылых, и состоят из 5 -нетранслируемой области, короткого первого экзона, одного интрона и второго экзона, содержащего открытую рамку считывания (ORF) с последующей 3 -нетранслируемой областью (рис. 6B). С помощью 5 - and 3 -RACE анализа были определены точки старта транскрипции, локализация интрона и 3 -конец мРНК. Длина открытых рамок считывания двух генов S. singularior составляет 2157 п.о. Сходство последовательностей ORF гена hsp83 D. melanogaster и других двукрылых составляет 80%. Идентичность белков hsp83 S. singularior составляет около 85% с hsp83 D. melanogaster. Полученные последовательности были депонированы в GenBank: JN627861 (10320 п.о.) и JN627862 (8230 п.о.) (рис. 6B).
При секвенировании перекрывающихся фрагментов разных клонов был обнаружен индивидуальный полиморфизм аллелей генов hsp83 S. singularior и фланкирующих регионов: 13 одиночных нуклеотидных замен в hsp83S1, две из которых приводят к замене нуклеотидных кислот к белке, и 7 незначащих замен в двух аллелях hsp83S2. Отдельные замены в 5 -нетранслируемой области гена hsp83S1 S. singularior дают около 1% различий между клонами на расстоянии до 2670 п.о. от старта транскрипции. Секвенирование 3 -фланкирующей области клонов с hsp83S1 показало наличие коротких делеций и инсерций (около 6%) на расстоянии 1400 п.о. после 3 -нетранслируемой области. Не удалось проанализировать полиморфизмы 5 - и 3 - фланкирующих областей гена hsp83S2, так как при скринировании геномной библиотеки не было обнаружено перекрывающихся фрагментов между рекомбинантными фагами. При сравнении ORF генов hsp83S1 и hsp83S2 было показано 43 нуклеотидные замены, 15 из которых приводят к замене аминокислотных остатков. Первые экзоны обоих генов имеют 100% сходство последовательностей. При сравнении интронов генов hsp83S1 и hsp83S2 была обнаружена только одна замена.
Данные по количеству замен в составе кодирующих последовательностей генов hsp83 S. singularior свидетельствуют об отсутствии конверсии между двумя генами. Этим гены hsp83 отличаются от генов hsp70 того же S. singularior и D. melanogaster, для которых было показано поддержание консервативной структуры по механизму генной конверсии (Garbuz, 2011).
При скринировании геномной библиотеки O. pardalina было получено 2 неперекрывающихся клона, обозначенных 1 и 5, каждый из которых содержал по одному полноразмерному гену hsp83 (рис. 6С). Структуры этих клонов похожи, но не идентичны. Анализ 3 -фланкирующих областей генов hsp83 клонов выявил отсутствие гомологии последовательностей на расстоянии более чем 1000 п.о. после 3 -нетранслируемой области. 5 -фланкирующие области также отличаются друг от друга рядом делеций и инсерций, так что сходство последовательностей данных областей составляет около 83%. Полученные данные дговорят о том, что в составе фагов 1 и 5 были клонированы два разных гена hsp83 O. pardalina (рис. 6С). Эти гены были обозначены hsp83P1 и hsp83P2 и депонированы в GenBank: JN627859 (14519 п.о.) и JN627860 (14764 п.о.), соответственно.
Как видно из рис. 6С, фаги 1 и 5 содержат длинные повторяющиеся последовательности в 5 - и 3 -фланкирующих областях генов hsp83. Выявленные повторы и общая структура клонов 1 и 5 позволяют предполагать, что две копии гена hsp83 O. pardalina находятся в тандемной ориентации, так же как и гены hsp83 S. singularior, но на расстоянии не менее чем 12 т.п.о.
Общая организация и номенклатура генов hsp83 у Stratiomys singularior и Oxycera pardalina. (A) Структура рекомбинантных фагов, полученных из геномной библиотеки S. singularior. (B) Общая организация тандемно расположенных генов hsp83 S. singularior. (C) Структура фаговые клоны из геномной библиотеки O. pardalina, содержащие гены hsp83. Отдельные гены hsp83 показаны серыми прямоугольниками со стрелками, разделенными интронами. Заштрихованными прямоугольниками обозначены области с тандемными повторами (11 п.о.), обнаруженными во фланкирующих регионах генов hsp83 O. pardalina. Черные стрелки показывают их направление. H – HindIII, X – XbaI. Локализация и размеры в т.п.о. рестрикционных фрагментов показаны вертикальными линиями на фаговых картах относительно анализа по Саузерну (рис. 7)
С помощью Саузерн-блот гибридизации была исследована геномная организация hsp83 O. pardalina и S. singularior (рис. 7). Анализ с использованием эндонуклеазы рестрикции HindIII подтверждает, что оба вида содержат по две копии гена hsp83. При этом наличие двух гибридизующих фрагментов ( 7 и 3,5 т.п.о.) у O. pardalina соответствует генам hsp83P1 и hsp83P2, что совпадает с описанными областями в фагах 1 и 5. Появление дополнительных полос гибридизации возможно относится к псевдогенам hsp83 у O. pardalina. У S. singularior, так же было показано наличие двух высокомолекулярных фрагментов, содержащих гены hsp83 (рис. 7). Общая структура генов hsp83 O. pardalina в основном не отличается от S. singularior. Сходство последовательностей ORF hsp83P1 и hsp83P2 составляет 99% и (14 незначащих замен). (табл. 3). Первый экзон и интрон hsp83P1 и hsp83P2 идентичны на 99%. Сходство последовательностей ORF между S. singularior и O. pardalina состаляет 83% и по кодирующему белку - 91%. Первые экзоны идентичны на 60% между генами hsp83S1 и hsp83P1.
Сравнительный анализ структуры промоторных областей генов hsp70 и hsp83 S. singularior и O. pardalina
Ранее была подробно изучена структура кластера генов hsp70 S. singularior. Два гена в кластере (hsp70S1 и S2) расположены в виде инвертированного повтора, и еще три (hsp70S3, S4 и S5) находятся после гена S2 в тандемной ориентации (Garbuz, 2011). В отличие от генов hsp70 Drosophila, у hsp70 S. singularior более или менее консервативны только кодирующие области и первые 50 п.о. выше старта транскрипции, расположенные в 5 -фланкирующей области, в которой находятся ТАТА-бокс и первый HSE. У разных копий hsp70 S. singularior последовательности, расположенные выше первого HSE и ниже стоп-кодона открытой рамки считывания не имеют значимой гомологии и различаются по числу HSE. У D. melanogaster регуляторные области всех шести генов hsp70 высококонсервативны и содержат по четыре HSE, расположенных на одинаковых расстояниях от ТАТА-бокса. Анализ связывания факторов траскрипци с белковыми экстрактами подвергнутых тепловому шоку D. melanogaster показаны на рис. 13, на котором видно, что последовательности с -94 до -39 п.о. относительно старта транскрипции промоторов S. singularior hsp70S3 и hsp70S4 способны связывать фактор HSF D. melanogaster так же, как и ортологичный регион, полученный из D. melanogaster. Данная область D. melanogaster использовалась как положительный контроль. Супер-шифт с анти-HSF-антителами D. melanogaster (рис. 13A) подтверждает специфичность исследуемых HSF-HSE взаимодействий. Помимо HSE у D. melanogaster (и остальных видов Drosophila) промоторы генов hsp70 на протяжении первых 130 п.о. выше ТАТА-бокса содержат несколько GAGA-сайтов, абсолютно необходимых для эффективной транскрипции (Georgel 2005). Функционально активный GAGA-сайт у Drosophila как правило имеет вид GAGAG, GAGAGAG или состоит из нескольких тринуклеотидов GAG, разделенных спейсерами из нечетного числа нуклеотидов (один, три или пять). В некоторых случаях в составе тринуклеотидов допускаются замены (Omelina, 2011). Поиск сайтов связывания GAF в регуляторных районах генов hsp70 S. singularior с помощью программы MatInspector не дал результатов. В отличие от Drosophila, промоторы генов hsp70 S. singularior содержат только единичные тринуклеотиды GAG (или CTC). Для того, чтобы ответить на вопрос, взаимодействует ли GAF с промоторами генов hsp70 S. singularior, был проведен анализ связывания рекомбинантного GAF D. melanogaster с фрагментами промоторных областей генов hsp70S3 и hsp70S4. В качестве положительного контроля использовались фрагменты промоторной области гена hsp70Aa D. melanogaster. Полученные результаты показывают, что промоторы генов hsp70S3 и hsp70S4 в отличие от промотора гена hsp70Aa не взаимодействуют с олигомерной формой белка GAF, необходимой для инициации транскрипции генов hsp70 D. melanogaster (рис. 13B). Рис. 13. A. Гель-шифт анализ, показывающий эффективное связывание HSF D. melanogaster с промоторами генов hsp70 D. melanogaster и S. singularior после теплового шока (дорожки 2, 5 и 8). Чтобы подтвердить образование HSE–белковых комплексов в супер-шифт анализе (дорожки 3, 6 и 9), клеточные экстракты инкубировали в течение 5 мин с анти-HSF1 сывороткой (1:500) перед инкубацией с меченой HSE. B. Связывание рекомбинантного белка GAF D. melanogaster с промоторами генов hsp70 D. melanogaster и S. singularior. Стрелками показаны расположения комплексов HSF-HSE (A) и GAF-GAGA (B). Было проведено сравнение секвенированных промоторных областей всех клонов hsp83 S. singularior and O. pardalina. ТАТА-бокс находится в той же позициии относительно старта транскрипции, что и у всех изученных на данный момент двукрылых и имеет вид TATATT у Stratiomys и Oxycera. Были обнаружены канонические элементы теплового шока (HSE), состояшие из 7 GAA (или комплементарных TTC) с единичными заменами у обоих видов S. singularior и O. pardalina (рис. 14).
Также в гене hsp83 у S. singularior между TATA-боксом и стартом транскрипции найден предполагаемый сайт связывания GAF, который отсутствует у O. pardalina (Рис. 14A). Как известно GAF играет важнейшую роль в модификациях хроматина и обеспечивает быстрое включение генов hsps у Drosophila. Чтобы доказать, что GAF связывается с регуляторной областью S. singularior, была исследована электрофоретическая подвижность рекомбинантного GAF D. melanogaster и синтезированных олигонуклеотидов из промоторных областей генов hsp83 S. singularior и O. pardalina. Как видно из рис. 15 рекомбинантный GAF связывается с промотором hsp83 S. singularior, а с промотором O. pardalina связывания не происходит.
Следует отметить, что помимо 5 -регуляторной области генов hsp83 был обнаружен HSE в интронах генов hsp83 изучаемых видов (рис. 14B). Оба гена hsp83 S. singularior содежрат по два потенциально функциональных HSE, локализованных в 70 п.о. и .128 п.е. после первых экзонов, в то время как в генах hsp83 O. pardalina обнаружен только один предполагаемый HSE в положении 92 п.о. интрона. Сравнительный анализ интронов генов hsp83 других видов двукрылых, показал наличие подобных HSE у D. melanogaster, Ceratitis capitata (Wiedemann) и Aedes aegypti (Linnaeus). Таким образом, предполагается, что интроны также могут быть вовлечены в регуляцию транскрипции генов hsp83 O. pardalina и S. singularior. (A) Сравнение промоторных областей и первых экзонов генов hsp83S2 и hsp83P1. HSE, TATA-бокс и GAGA элементы подчеркнуты; старт транскрипциит показан жирным подчеркнутым шрифтом со стрелкой. (B) Общая организация промоторных областей генов hsp83 у S. singularior и Oxycera pardalina в сравнении с промоторами генов hsp83 других видов (трех видов Drosophila, Drosophilidae, Anopheles albimanus и Aedes aegypti, Culicidae, Ceratitis capitata, Tephritidae, и Lucilia cuprina, Calliphoridae). Предполагаемый GAF-связывающий сайт у Stratiomys sigularior обозначен G .
Сайты старта транскрипции консервативны у всех четырех генов hsp83 Stratiomyidae. На рис. 14B показано сравнение промоторных областей и 5-UTR генов hsp83 S. singularior и O. pardalina и некоторых других видов двукрылых. У S. singularior только первые 500 п.о. выше сайта старта транскрипции, включая промоторную область, демонстрирует высокий уровень гомологии. У O. pardalina на протяжении 8 т.п.о. до старта транскрипции генов hsp83P1и hsp83P2 показана высокая степерь гомологии с небольшими делециями в 5 -фланкирующей области hsp83P1 на расстоянии 3500 п.о. от начала гена. Эти данные, а также результаты секвенирования позволяют предположить, что дупликация генов hsp83 исследуемых видов шла разными путями в разные периоды эволюции Stratiomyidae.
Исходно было получено три конструкции, в которых рамка считывания гена люциферазы контролировалась промоторами разных копий hsp70 S. singularior и гена hsp70Аа D. melanogaster (рис. 16). В первой конструкции репортерный ген находился под промотором гена hsp70Aa D. melanogaster. Во второй конструкции рамка считывания гена люциферазы контролировалась промотором гена hsp70S3, т.к. этот ген имеет наибольшие структурные отличия в сравнении с генами D. melanogaster. Кроме того, получена конструкция под контролем промотора гена hsp70S4, с тем, чтобы сравнить активность промоторов двух разных генов hsp70 S. singularior, максимально различающихся по своей структуре. Клонировали следующие фрагменты 5 -регуляторных областей вместе с 5 -UTR генов S. singularior: hsp70S3 (-570…+225 п.о. относительно точки старта транскрипции), hsp70S4 (-607…+223), и D. melanogaster hsp70Aa (-524…+234). Параллельно с опытными плазмидами клетки трансфицировали “пустым” беспромоторным вектором pGL4.10 в качестве отрицательного контроля для определения фоновой люминесценции. Полученные результаты свидетельствуют о том, что активность промоторов генов hsp70 S. singularior в клетках D. melanogaster оказывается в 10 раз ниже по сравнению с эндогенным промотором как при нормальной температуре, так и при ТШ (рис. 16).
