Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 Гонады в эмбриональном развитии 9
1.2 Морфологическое строение семенников у D. melanogaster 12
1.3 Генетический контроль сперматогенеза 17
1.4 Геномная организация семенник-специфичных генов и предполагаемые механизмы их координированной регуляции 28
1.5 Гены задержки мейоза 30
1.6 Генетические методы мечения отдельных клеточных популяций и исследования в них функций генов 35
1.7 Методы определения сайтов посадки ДНК-связывающих белков 38
Глава 3. Результаты 58
3.1 Генетическая система для запуска эктопической экспрессии трансгенов исключительно в клетках зародышевого пути 58
3.2 Генетическая система для проведения DamID в клетках зародышевого пути D.melanogaster 66
3.3 Связывание Comr с генами в семенниках у D. melanogaster 68
3.4 Влияние белка Comr на экспрессию генов 71
3.5 Идентификация вторичных Comr-зависимых регуляторов транскрипции 74
3.6 Связывание Comr не всегда приводит к изменению экспрессии генов 76
3.7 Тканеспецифичная принадлежность Comr-связанных и Comr-не связанных генов 78
3.8 Гены-мишени Comr обогащены маркерами неактивного хроматина в недифференцированных клетках мужского зародышевого пути 80
3.9 Транскрипционный фактор Comr связывается с протяженными участками хромосом у D. melanogaster 83
3.10 Активация генов в семенниках D. melanogaster транскрипционными факторами tMAC и tTAF комплексов 85
Глава 4. Обсуждение 88
- Морфологическое строение семенников у D. melanogaster
- Генетические методы мечения отдельных клеточных популяций и исследования в них функций генов
- Генетическая система для проведения DamID в клетках зародышевого пути D.melanogaster
- Связывание Comr не всегда приводит к изменению экспрессии генов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Одним из главных направлений функциональной геномики является изучение регуляторных систем, управляющих генетическими и эпигенетическими программами развития организма. Сперматогенез у Drosophila melanogaster является удобной моделью для изучения регуляции экспрессии генов в процессе клеточной дифференцировки. В семеннике дрозофилы можно легко различить все стадии развития клеток зародышевого пути - образование клеток из стволовых предшественников, пролиферацию и терминальную дифференцировку. Терминальная дифференцировка клеток мужского зародышевого пути у D. melanogaster сопровождается перестройкой хроматина, за которой следует активация генов, необходимых для сперматогенеза. Активация генов дифференцировки контролируется несколькими специализированными транскрипционными факторами, которые кодируются так называемыми генами задержки мейоза и которые можно разделить на два класса - aly и сап. Белковые продукты генов а/у-класса образуют комплекс tMAC (testis-specific meiotic arrest complex), а гены caw-класса являются семенник-специфичными паралогами (tTAF, testis-specific TBP-associated factors) генов TAF у D. melanogaster. Мутации генов задержки мейоза приводят к инактивации множества генов в семенниках, неспособности клеток зародышевого пути вступить в мейоз и остановке гаметогенеза на стадии сперматоцитов. Было показано, что на фоне мутаций по генам задержки мейоза промоторные области генов дифференцировки остаются связанными белком-репрессором Polycomb, что по всей вероятности вызывает подавление экспрессии. В работе Chen et al. [2011] была сформулирована гипотеза, согласно которой активация генов в семенниках зависит от синхронизированного действия белков tMAC и tTAF. Это предположение основано на наблюдении о том, что в отсутствии компонентов tMAC нарушается связывание tTAF с ДНК. Однако существующие данные описывают конечный эффект мутаций, что не дает представления о механизме действия и конкретной роли этих транскрипционных факторов в регуляции активности генов. В первую очередь остаются невыясненным гены-мишени белков, кодируемых генами задержки мейоза. Более того, до сих пор не определено, являются ли эти белки прямыми активаторами или подавляют активность генов-репрессоров в клетках зародышевого пути. Также остается открытым вопрос о том, каким образом эти транскрипционные факторы участвуют в эпигенетической регуляции активности генов. Ответы на эти вопросы позволят приблизиться к пониманию принципов работы регуляторных систем, управляющих генетическими программами дифференцировки клеток зародышевого пути D. melanogaster.
В представленной работе для исследования роли транскрипционных факторов, кодируемых генами задержки мейоза, на первом этапе были установлены гены-мишени транскрипционного фактора Cookie monster (Comr), кодируемого геном, относящимся к aly классу. Картирование Comr проводили методом тканеспецифичного DamID с последующим анализом методом микрочипов в масштабе генома. Анализ данных о локализации сайтов связывания Comr и экспрессии генов в семенниках мутантов по генам cookie monster {aly класс) и cannonball {сап класс) позволил установить роль транскрипционных факторов Comr и Cannonball (Can) в регуляции экспрессии генов при дифференцировке клеток мужского зародышевого пути и сформулировать гипотезу относительно
механизмов активации генов, необходимых для дифференцировки мужских гамет у D. melanogaster.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы являлось изучение роли транскрипционных факторов Cookie Monster (Comr) и Cannonball (Can) в регуляции активности генов в процессе сперматогенеза у D. melanogaster. Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:
-
Создать генетическую систему для картирования сайтов связывания транскрипционных факторов методом DamID в клетках мужского зародышевого пути у D. melanogaster.
-
Определить профиль связывания транскрипционного фактора Comr с ДНК терминальных клеток самцов D. melanogaster.
-
Определить эффект связывания Comr на экспрессию генов в сперматоцитах D. melanogaster.
-
Определить регуляторный эффект белка Сап на гены, связанные с белком Comr
Научная новизна
Разработан подход, позволяющий картировать сайты связывания хроматиновых белков с ДНК в отдельных клеточных популяциях в организме D. melanogaster методом DamID. Этим методом впервые были локализованы участки связывания транскрипционного фактора Comr в геноме и выявлены его гены-мишени в терминальных клетках самца D. melanogaster. Показано, что белок Comr является прямым активатором части своих генов-мишеней в сперматоцитах. Выявлен возможный вторичный регуляторный фактор, экспрессия которого контролируется Comr. Предложена модель, описывающая этапы активации семенник-специфичных генов в сперматоцитах D. melanogaster и роль белков tMAC и tTAF в этом процессе.
Научно-практическая ценность
Полученные в результате исследования вносят вклад в современные представления о регуляторных системах, управляющих генетическими и эпигенетическими программами развития клеток. Полученные данные содержат принципиально новую информацию о механизме действия белков комплексов tMAC и tTAF, что значительно расширяет представления о механизмах регуляции генов в семенниках D. melanogaster. процессе клеточной дифференцировки. Разработанная генетическая система для проведения тканеспецифичного DamID может быть использована для исследования транскрипционных факторов и иных ассоциированных с ДНК белков в клетках зародышевого пути у D. melanogaster. Полученная система универсальна и может быть легко адаптирована для исследования ткане специфичных транскрипционных факторов в других органах D. melanogaster.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Проведен анализ профиля связывания белка Comr в терминальных клетках самца D. melanogaster. Белок Comr является прямым активатором генов-мишеней в сперматоцитах. Установлено наличие неизвестных ранее вторичных генов-регуляторов транскрипции, находящихся под контролем белков Comr и Сап.
Личный вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Работа по математической обработке данных выполнена в сотрудничестве с Белякиным С.Н. и Максимовым Д.А. Данные по
представленности транскриптов генов в семенниках предоставлены Dr. Н. White-Cooper (Университет Кардиффа, Великобритания).
Апробация работы. Результаты работы представлены на российских и международных конференциях в виде стендовых сообщений: на международной конференции по системной биологии дрозофилы (Пултуск, Польша, 2012), на международной конференции «Хромосома-2012» (Новосибирск, Россия, 2012), на международной конференции «Высокопроизводительное секвенирование в геномике» (Новосибирск, Россия, 2013); а также в устных докладах: на международной конференции по молекулярным механизмам регуляции сперматогенеза «ETW-16» (Эльба, Италия, 2010), на международной конференции «Хромосома-2012» (Новосибирск, Россия, 2012).
Публикации. По теме исследования опубликовано 3 статьи и 5 тезисов конференций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в которые входит 167 ссылок. Работа изложена на 112 страницах печатного текста, содержит 1 таблицу и 12 рисунков.
Морфологическое строение семенников у D. melanogaster
Семенники взрослых особей D. melanogaster имеют характерную спиралевидную форму с утолщением на апикальном конце. Оболочка семенников дрозофилы образована мышечными и пигментными клетками (Fuller, 1993). В апикальной области расположены стволовые клетки зародышевого пути и, по мере продвижения к основанию семенника, можно различить все дальнейшие стадии развития клеток зародышевого пути – сперматогонии, сперматоциты, сперматиды и зрелые сперматозоиды. Ниже будут рассмотрены морфологические особенности всех стадий развития клеток зародышевого пути у самцов дрозофилы.
Стволовые клетки и пролиферативный центр На замкнутом апикальном конце семенника располагается пролиферативный центр (также называемый нишей) который состоит из трех типов клеток (Hardy et al., 1979). Сердцевина пролиферативного центра образована двадцатью плотно прилегающими друг к другу соматическими клетками, которые формируют конусообразную структуру, называемую хабом (Fuller, 1993). Вокруг хаба расположены от 5 до 9 стволовых клеток (Рис. 1), которые дают начало линии зародышевого пути (Hardy et al., 1979). Каждая стволовая клетка заключена в оболочку, образованную двумя соматическими стволовыми клетками гонад (также называются клетками-предшественниками цисты) (Fuller, 1993). Стволовые клетки зародышевого пути и соматические стволовые клетки гонад поддерживают плотный контакт с клетками хаба (Hempel et al., 2008) (Рис. 1).
В результате асимметричного митотического деления стволовых клеток зародышевого пути образуется две клетки, одна из которых по прежнему контактирует с клетками хаба и остается стволовой, в то время как вторая клетка, так называемый гониобласт, вытесняется из ниши и приступает к пролиферации (Hardy et al., 1979; Gonczy, DiNardo, 1996) (Рис. 1). Одновременно делятся соматические стволовые клетки гонад, что приводит к их самообновлению и образованию цистных клеток. Образованные цистные клетки окружают гониобласт. В дальнейшем цистные клетки не делятся, а лишь увеличиваются в размерах; они окружают развивающиеся половые клетки на всех стадиях развития – от начальных стадий и вплоть до стадии индивидуализации сперматид. Деление соматических стволовых клеток гонад зависит от клеточных сигналов, поступающих от стволовых клеток зародышевого пути: в отсутствие стволовых клеток зародышевого пути наблюдается нерегулируемая пролиферация цистных клеток (Gonczy, DiNardo, 1996). Кроме того показано, что соматические стволовые клетки гонад способны образовывать клетки хаба (Voog et al., 2008). Циста, состоящая из клеток зародышевого пути, окруженных двумя цистными клетками, представляет собой функциональную единицу сперматогенеза у дрозофилы (Fuller, 1998). Сперматогонии: стадия митотических делений
Гониобласт претерпевает четыре раунда митотических делений, что приводит к формированию цисты, состоящей из 16 сперматогониев, окруженных двумя цистными клетками. В каждом раунде деления не проходит полный цитокинез, поэтому клетки остаются соединенными между собой межклеточными мостиками, так называемыми кольцевыми каналами (de Cuevas et al., 1997). Они формируются за счет стабилизации сократительного кольца, что препятствует разделению клеток зародышевого пути (Hime et al., 1996). Кольцевые каналы сохраняются на всех стадиях развития вплоть до индивидуализации, предполагается, что они требуются для синхронного прохождения программы сперматогенеза (Hime et al., 1996). Каналы пронизывает разветвленная цитоплазматическая мембранная структура – фусома, которая формирует сеть, проникающую во все клетки синцития (Lin et al., 1994; Hime et al., 1996). В мужских клетках зародышевого пути фусома отвечает за нормальное протекание митотических делений и регулирует наследование центросом в ходе мейоза (Wilson, 2005; Lighthouse et al., 2008). Мутации по структурным белкам, образующим фусому, приводят к нарушениям распределения центросом в ходе мейоза и стерильности самцов (Wilson, 2005).
Сперматоциты: стадия мейотических делений Сразу после четвертого митотического деления начинается предмейотическая S-фаза, и клетки зародышевого пути переходят на стадию первичных сперматоцитов (Fuller, 1993). На этой стадии клетки переходят от фазы пролиферации к фазе роста, активной транскрипции генов и дифференцировки. Сперматоциты, в отличие от более ранних стадий развития клеток зародышевого пути, уже не способны вернуться в состояние стволовых клеток (Brawley, Matunis, 2004), поэтому считается, что с началом стадии сперматоцитов запускается терминальная дифференцировка клеток зародышевого пути.
В ходе предмейотической G2 фазы, занимающей около 90 часов, первичные сперматоциты увеличиваются в размере приблизительно в 25 раз (Lindsley, Tokuyasu, 1980), и активируются все гены, которые потребуются в ходе дальнейших стадий сперматогенеза. После G2 фазы мейоза I транскрипция большинства генов прекращается (Fuller, 1993). Пост-мейотическая транскрипция была обнаружена лишь для 24 генов (Barreau et al., 2008a; Barreau et al., 2008b). В то же время, в семенниках дрозофилы функционирует механизм отложенной трансляции, когда наработанные на стадии сперматоцитов транскрипты сохраняются и могут быть транслированы на последующих стадиях (Fuller, 1993). Экспрессия многих генов запускается впервые на стадии сперматоцитов (Jiang, White-Cooper, 2003; Chen et al., 2005). Примерно 10% генов дрозофилы экспрессируется исключительно в семенниках (White-Cooper, 2010).
Процесс роста первичных сперматоцитов сопровождается морфологическими изменениями. Ранние первичные сперматоциты проходят несколько этапов развития, в ходе которых увеличивается количество митохондрий и разрастается эндоплазматический ретикулум (Fuller, 1993). Зрелые первичные сперматоциты являются наиболее крупными клетками зародышевого пути. Они содержат крупное ядрышко, развитый эндоплазматический ретикулум и две пары центриолей. Первичные сперматоциты претерпевают первое мейотическое деление, в результате которого образуются вторичные сперматоциты. После короткой интерфазы вторичные сперматоциты вступают во второе мейотическое деление. Мейотические деления сперматоцитов приводят к образованию цисты, содержащей 64 круглых гаплоидных сперматиды.
Генетические методы мечения отдельных клеточных популяций и исследования в них функций генов
В состав aly-класса входят гены aly, comr, tomb, topi и achi/vis (White-Cooper et al., 2000). Белок Aly содержит DIRP-домен (domain in Rb-related pathway), а все остальные белки, кодируемые генами aly-класса, содержат
ДНК-связующие домены (Ayyar et al., 2003; Jiang, White-Cooper, 2003; Perezgasga et al., 2004; Beall et al., 2007; Jiang et al., 2007).
Белки, кодируемые генами aly-класса, образуют комплекс tMAC (testis Meiotic Arrest Complex). Помимо белков, кодируемых генами задержки мейоза, Aly, Comr, Topi, Tomb, в состав tMAC комплекса также входят белки Wuc, Mip40 и Caf1/p55 (Beall et al., 2007). Два последних белка также являются компонентами комплекса Myb-MuvB (MMB/dREAM), а Aly и Tomb являются паралогами субъединиц этого комплекса (Korenjak et al., 2004; Lewis et al., 2004). В состав ММВ-комплекса входят белки Myb, Mip40, Mip120, Mip130, Caf1/p55, Rbf1, Rbf2, E2F2, Dp, Lin-52, Rpd3 и L(3)mbt (Korenjak et al., 2004) (Lewis et al., 2004; Sim et al., 2012). Было обнаружено, что в соматических клетках MMB-комплекс связывается с большим количеством генов (Georlette et al., 2007). В состав комплекса входят как белки-репрессоры (Rbf1, Rbf2, E2F2, Dp, Mip40, Mip120, Mip130), так и активаторы (Myb) транскрипции (Korenjak et al., 2004; Lewis et al., 2004; Georlette et al., 2007; Lee et al.; Lee et al., 2012; Sim et al., 2012). Хотя и известно, что в некоторых случаях MMB-комплекс может вызывать активацию генов, основная его роль заключается в подавлении транскрипции генов (Beall et al., 2007; Sim et al., 2012). Было показано, что MMB-комплекс вовлечен в регуляцию многих процессов, таких как регуляция клеточного цикла, репарация, инактивация транскрипции генов, задействованных в клеточной дифференцировке (Manak et al., 2002; Georlette et al., 2007; Manak et al., 2007; Lee et al., 2012). Несмотря на столь обширный спектр действия этого комплекса, остается неисследованным вопрос, каким образом происходит активация репрессированных им генов.
Гены mip40 (can-класс) и wuc также являются генами задержки мейоза (Beall et al., 2007; Doggett et al., 2011). По характеру влияния на экспрессию, mip40 был отнесен к can-классу, однако кодируемый им белок входит в состав tMAC (Beall et al., 2007). Ген wuc является гомологом lin-52 (кодирует компонент MMB, Lin-52) и по данным о влиянии на экспрессию не принадлежит ни к одному из двух классов генов задержки мейоза. Кроме того, предполагается, что белок Wuc может подавлять транскрипцию генов, и с учетом того, что он действует в составе tMAC, это может быть дополнительным свидетельством функционального сходства tMAС и MMB-комплексов (Doggett et al., 2011). Предполагается, что tMAC может являться семенник-специфичной версией MMB (Beall et al., 2007). На данный момент нет опубликованных данных относительно того, каким образом белки, кодируемые генами aly-класса (tMAC-комплекс) влияют на генную экспрессию в сперматоцитах. Вероятно, белки, кодируемые генами aly-класса, могут оказаться активаторами транскрипции, так как они ассоциированы с эухроматином (White-Cooper et al., 2000; Jiang, White-Cooper, 2003; Wang, Mann, 2003; Jiang et al., 2007). Однако в некоторых работах не исключалась и возможность активации генов-мишеней tMAC посредством ингибирования генных репрессоров (White-Cooper, Davidson, 2011). Прямых указаний в пользу первого или второго предположения пока нет.
К can-классу принадлежат гены can, mia, sa, rye, nht. В отсутствие белков can-класса нарушается транскрипция генов, необходимых для осуществления программы развития половых клеток от стадии сперматоцитов до стадии сперматозоидов (спермиогенез). Гены can, mia, sa, rye, nht являются семенник-специфичными гомологами генов TAF4, TAF5, TAF6, TAF8 и TAF12, соответственно (Hiller et al., 2001; Hiller et al., 2004). Белки TAF4, TAF5, TAF6, TAF8 и TAF12 входят в состав базального фактора транскрипции TFIID и экспрессируются практически во всех тканях D. melanogaster. Вполне возможно, что семенник-специфичные TAF (tTAF), кодируемые генами can-класса, также формируют сходный комплекс. Предполагается, что в состав такого комплекса входят белки tTAF и изоформа TAF1, TAF1-2 (Metcalf, Wassarman, 2007). Однако, по всей вероятности, функции семенник-специфичного TFIID-комплекса могут несколько отличаются от функций повсеместно представленного TFIID, поскольку было обнаружено, что белки tTAF локализуются преимущественно в ядрышке и лишь небольшая часть ассоциирована с эухроматином (Chen et al., 2005). Кроме того белки tTAF могут участвовать в процессе перестройки хроматина (Chen et al., 2005; Chen et al., 2011).
Генетическая система для проведения DamID в клетках зародышевого пути D.melanogaster
Для исследования механизма действия комплекса tMAC в регуляции активности генов в сперматоцитах была поставлена задача установить сайты связывания белка Comr, который входит в состав tMAC, методом DamID. Как упоминалось ранее (см. Обзор литературы), в методе DamID для экспрессии химерного белка, состоящего из исследуемого белка и Dam метилтрансферазы, используется базальная активность промотора гена hsp70, которая проявляется во всех клетках организма. Эта особенность является препятствием для картирования тканеспецифичных транскрипционных факторов методом DamID, поскольку химерный белок образуется во всех клетках организма, что может приводить к неконтролируемому искажению картины связывания и не позволить адекватно интерпретировать полученные результаты. Исследуемый транскрипционный фактор Comr in vivo экспрессируется только в клетках мужского зародышевого пути, поэтому необходимо было разработать систему, которая бы позволила проводить DamID только в клетках зародышевого пути. Поставленная задача была решена в два этапа: в ходе первого этапа была создана генетическая система, позволяющая ограничить экспрессию трансгенов популяцией клеток зародышевого пути и, таким образом, избежать неспецифического сигнала из других клеточных типов. В ходе второго этапа мы адаптировали полученную генетическую систему для проведения DamID, и в результате была разработана методика картирования семенник-специфичных транскрипционных факторов.
Для создания необходимой системы была выбрана методика, в которой активация трансгена происходит за счет удаления специальной стоп-кассеты, блокирующей его транскрипцию (см. Обзор литературы). В геном дрозофилы были введены две генетические конструкции, одна из которых кодирует рекомбиназу Cre под контролем тканеспецифичного промотора, а другая содержит повсеместно активный промотор и целевой трансген, разделенные стоп-кассетой, которая представляет собой терминатор транскрипции, фланкированный сайтами узнавания фермента-рекомбиназы (Struhl, Basler, 1993; Evans et al., 2009).
Для активации рекомбиназы Cre специфично в клетках зародышевого пути мы использовали регуляторные элементы гена nanos. Такой выбор обуславливается тем, что белок Nanos является специфичным маркером стволовых герминальных клеток в организме дрозофилы. Исключительная роль гена nanos в клетках зародышевого пути подтверждается тем, что во взрослых мухах мутация по нему вызывает только нарушения гаметогенеза и не затрагивает другие функции организма (Forbes, Lehmann, 1998; Bhat, 1999; Gilboa, Lehmann, 2004; Wang, Lin, 2004). Полученная нами конструкция содержала ген рекомбиназы, фланкированный регуляторными областями гена nanos (Рис. 4А, Материалы и Методы). Ранее было показано, что использованные нами регуляторные области обеспечивают паттерн экспрессии трансгенов, неотличимый от нативного гена nanos (Gavis et al., 1996; Forrest et al., 2004). Полученная конструкция nanos-cre была интегрирована в геном дрозофилы с использованием системы phiC31-опосредованной трансформации дрозофилы в сайт интеграции attP40, расположенный на второй хромосоме (Bischof et al., 2007; Markstein et al., 2008).
Чтобы убедиться в том, что под контролем регуляторных областей nanos Cre-рекомбиназа нарабатывается и осуществляет удаление стоп-кассеты только в клетках зародышевого пути, мы создали вторую, репортерную конструкцию. В ней был использован промотор гена Ubi-p63E (Evans et al., 2009), который активен во множестве органов и тканей, как взрослых мух, так и личинок дрозофилы, и поэтому широко используется для запуска экспрессии трансгенов в различных тканях организма дрозофилы (Chintapalli et al., 2007; Evans et al., 2009). Под контролем этого промотора был размещен ген репортерного белка mCD8-GFP (Lee, Luo, 1999, 2001). Этот ген кодирует химерный белок, состоящий из флуоресцентного белка GFP и трансмембранного домена мышиного лейкоцитарного рецептора CD8, который позволяет экспонировать GFP на поверхности клеток. Для предотвращения повсеместной экспрессии репортерного белка промотор и последовательность mCD8-GFP были разделены стоп-кассетой, состоящей из терминатора транскрипции гена hsp70AB, фланкированного loxP сайтами узнавания Cre-рекомбиназы (Struhl, Basler, 1993) (Рис. 4А). Полученная конструкция Ubipro stop mCD8-GFP была встроена в сайт интеграции attP40, таким же образом, как описано выше.
На следующем этапе проверки мы скрестили линии мух, несущие полученные генетические конструкции и проанализировали флуоресцентный сигнал GFP в семенниках и яичниках потомков (Рис. 4Б).
У потомков были выделены гонады, в которых детектировали флуоресценцию GFP. Анализ экспрессии репортерного белка в семенниках проводили при помощи флуоресцентного микроскопа. Свечение GFP и DAPI в яичниках детектировали при помощи конфокальной микроскопии. Результаты приведены на Рис. 5 и 6.
В семенниках дрозофилы присутствует соматические клетки и клетки зародышевого пути. Соматические клетки представлены несколькими популяциями: оболочка семенника (мышечные и пигментные клетки), клетки хаба, стволовые соматические клетки гонад и их потомки – цистные клетки. Цистные клетки формируют оболочку вокруг синцития развивающихся клеток зародышевого пути, такая оболочка сохраняется на протяжении всего сперматогенеза вплоть до стадии обособления зрелых сперматозоидов
Связывание Comr не всегда приводит к изменению экспрессии генов
Области связывания Comr содержали 3036 генов, причем лишь 693 из них были семенник-специфичными. Кроме того, 350 областей связывания Comr не содержали семенник-специфичных генов. Протяженность 192 таких областей превышала 20 т.п.н., а 37 из них – 100 т.п.н. В составе этих 350 областей связывания Comr, располагались 638 генов, причем лишь 124 из них снижали уровень экспрессии в два и более раз на фоне мутации по comr, то есть многие такие области вообще не содержали генов, регулируемых Comr. Тем не менее, мы обнаружили, что промоторные области генов, расположенных в этих 350 районах, были обогащены репрессивной гистоновой меткой H3K27мет3 и обеднены меткой H3K4мет3 (Рис. 11Б). Это означает, что присутствие Comr в этих районах не связано с регуляцией заключенных в них генов, и можно предположить, что именно состояние хроматина определяет связывание с ними белка Comr.
Полученные данные свидетельствуют о том, что Comr-связанные гены склонны располагаться группами в геноме и их промоторные области обогащены репрессивной гистоновой меткой H3K27мет3. Это может означать, что Comr, как часть tMAC-комплекса, участвует в процессах перестройки хроматина, причем связывание Comr определяется состоянием хроматина, а именно наличием репрессивной метки H3K27мет3.
Важно отметить, что в отсутствие tTAF действия только белков комплекса tMAC не достаточно для активации генов в сперматоцитах дрозофилы (Chen et al., 2005; Chen et al., 2011). Согласно существующим данным, регуляторное влияние белков tTAF и tMAC в конечном итоге направлено на пересекающиеся группы генов, однако до сих пор остается не изученным вопрос о возможной совместной регуляции генов белками tTAF и
tMAC. Для исследования механизма совместной регуляции генов-мишеней белками, кодируемыми генами aly (tMAC) и can-классов (tTAF), мы сопоставили данные по экспрессии генов в семенниках самцов, мутантных по генам can и comr. Мутация по гену can (can3) вызывала нарушения в транскрипции значительно меньшего числа генов, чем было обнаружено в семенниках comr-мутантов. Так, лишь 309 генов снижали уровень экспрессии в 8 и более раз. Среди них, 277 (90%) также снижали уровень экспрессии в 8 и более раз и в семенниках comr-мутантов. Из 779 генов, снижающих экспрессию в 4 и более раз в семенниках can-мутантов, 702 гена (88%) экспрессировались на таком же или более низком уровне в семенниках comrz2-1340 самцов. Это означает, что активность большинства can-зависимых генов также зависит и от comr. Как уже было упомянуто, белок Comr напрямую связывался приблизительно c 40% генов, снижающих экспрессию в 8 и более раз в семенниках самцов comrz2-1340. Среди 277 генов, снижающих экспрессию не менее чем в 8 раз в семенниках, как самцов can3, так и comrz2-1340, c белком Comr были связаны только 112 генов, что также составляет 40%. Оставшиеся 60% генов в этой группе, по-видимому, регулируются при участии вторичных Comr-зависимых регуляторов, к которым может принадлежать CG9879. Необходимо отметить, что активность гена CG9879 снижается в 8 раз в семенниках самцов, несущих мутацию по can, то есть его активность регулируется как tMAC, так и tTAF.
Заключение
В ходе проведенных исследований мы обнаружили несколько принципиальных моментов, касающихся механизма регуляции генов белками tMAC и tTAF в семенниках у дрозофилы. Установлено, что семенник-специфичный транскрипционный фактор Comr является прямым активатором экспрессии, а также необходим для запуска вторичного активационного генетического каскада в сперматоцитах. Обнаружены новые свидетельства в пользу того, что Comr, в составе tMAC-комплекса участвует в процессах перестройки репрессированного хроматина, обогащенного меткой H3K27мет3. Показано, что совместное действие белков Comr и Can направлено только на часть генов, экспрессия которых нарушается у мутантов aly и can классов. Полученные данные содержат принципиально новую информацию о механизмах активации генов в семенниках D. melanogaster и позволяют выдвинуть гипотезу о роли белков tTAF и tMAC в этом процессе.
