Введение к работе
Актуальность проблемы
Для обеспечения морфологического и функционального разнообразия клеток, формирующегося в ходе развития многоклеточного организма, необходимы точные и высокоэффективные механизмы регуляции экспрессии генов. Геномы эукариотических организмов могут содержать десятки тысяч генов, для каждого из которых существует программа реализации генетической информации, характеризующаяся определенным временем, местом и уровнем экспрессии. Одним из важнейших механизмов, обеспечивающих правильную работу генов, является регуляция транскрипции. За счет взаимодействия белковых факторов с промоторами генов и другими г/ис-регуляторными элементами ДНК (энхансерами или сайленсерами) происходит активация или репрессия транскрипции, соответственно. Считается, что скоординированная транскрипция обеспечивается, в частности, путем организации генов в независимые хроматиновые домены с определенными паттернами экспрессии (Spellman & Rubin 2002; Dillon & Sabbattini, 2000). Существует предположение о том, что в этом процессе важную роль играют инсуляторы - г/ис-регуляторные элементы, которые способны блокировать активирующее действие энхансера, если расположены между ним и промотором, а также являются барьерами, предотвращающими распространение репрессионного хроматина (Cai & Levine, 1995; Gerasimova & Corces, 1996, Kuhn & Geyer, 2003). В последнее время появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что энхансеры и промоторы сближены в пространстве, а инсуляторы играют ключевую роль в обеспечении этих взаимодействий (Cleard F. et al., 2006).
Удобной моделью для изучения регуляции транскрипции является й/йогах-комплекс (ВХ-С) Drosophila melanogaster. Гены ВХ-С: Ultrabithorax (Ubx), abdominal A (abd-A) и Abdominal В (Abd-В), - отвечают за формирование части третьего грудного и всех брюшных сегментов. Эти гены регулируются тканеспецифичными энхансерами {аЪх/Ъх, bxd/pbx, iab-2 - iab-8), расположенными в порядке следования сегментов, которые они контролируют. Энхансеры отделены друг от друга регуляторными границами. В составе трех изученных ранее границ (Мер, Fab-7 и PTS/Fab-8) были найдены инсуляторы. Было показано, что инсуляторная активность PTS/Fab-8 зависит от наличия сайтов связывания белка dCTCF, который является гомологом инсуляторного белка позвоночных - CTCF (Moon et al., 2005). Недавно сайты связывания dCTCF были картированы между /абдоменами й/йогах-комплекса (Holohan et al., 2007). Это позволило предположить существование новых инсуляторов в й/йогах-комплексе.
Для CTCF позвоночных была показана роль в установлении взаимодействий между удаленными участками генома. Участие dCTCF в дистанционных взаимодействиях было продемонстрировано ранее в нашей лаборатории (Kyrchanova et al., 2008). Можно предположить,
что dCTCF играет важную роль в установлении взаимодействий между регуляторними элементами в локусе ВХ-С. Исследование данного вопроса является важным для понимания механизмов регуляции транскрипции генов.
Цель и задачи исследования
Целью работы было определение роли dCTCF в функционировании границ локуса bithorax Drosophila melanogaster.
В работе были поставлены следующие задачи:
Протестировать участки границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6, содержащие сайты связывания dCTCF, на способность к инсуляции.
Изучить способность границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6 к поддержанию дистанционных взаимодействий.
Определить роль белка dCTCF в организации дистанционных взаимодействий между инсуляторами границ.
Протестировать границы разных регуляторных областей (генов abd-A и Abd-B) на способность к взаимодействию с предпромоторной областью тепа, Abd-B.
Определить роль белка dCTCF во взаимодействиях инсуляторов границ ВХ-С с предпромоторной областью гена Abd-B.
Научная новизна и практическое значение работы
В работе исследованы фрагменты границ Fab-3, Fab-4 и Fab-6, содержащие сайты связывания dCTCF, и впервые показано, что они не проявляют энхансер-блокирующих свойств и способны поддерживать дистанционные взаимодействия. Установлено, что способность границ Мер, Fab-6 или PTS/F8 к дистанционным взаимодействиям не зависят от dCTCF. Впервые продемонстрировано, что dCTCF является одним из белков, обеспечивающих функциональную ориентационную зависимость взаимодействий между двумя копиями PTS/F8. Выявлена селективность взаимодействия предпромоторной области гена Abd-B с границами регуляторной области Fab-6, Fab-7 и PTS/F8. Получены данные, свидетельствующие о том, что помимо dCTCF, в поддержание специфических взаимодействий между этими регуляторными элементами вовлечены пока не идентифицированные белки.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 21-28 июня, 2009), на международной конференции ЕМВО Conference of Nuclear Structure & Dynamics (Isle la Sorgue, France, 30 September-4 October 2009); на международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ-2010» (Москва, 12-15 апреля, 2010); на международном симпозиуме «Control of gene expression and cancer» (Moscow, Russia, 21-25 June, 2010); на 15-ой Международной
Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2011); на V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 8-12 августа, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Из них статей -2, тезисов устных и стендовых сообщений на конференциях - 6.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 97 страницах, включает 28 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 122 источника.
