Содержание к диссертации
Введение
Список используемых сокращений 5
1. Введение 7
1.1 Актуальность работы 7
1.2 Цели и задачи исследования 8
1.3 Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы 9
1.4 Положения, выносимые на защиту 10
1.5 Степень достоверности и апробация результатов 10
2. Обзор литературы 12
2.1 Роль C-концевого домена большой субъединицы РНК-полимеразы II в организации транскрипционного комплекса 14
2.2 Распределение фосфорилирования C-концевого домена большой субъединицы РНК-полимеразы II как маркер стадии транскрипции 17
2.3 Процесс кэпирования и его влияние на другие ко-транскрипционные события 20
2.4 Ко-транскрипционный сплайсинг 22
2.5 Процессинг 3-конца мРНК 25
2.6 Упаковка транскрипта и связь с другими ко-транскрипционными процессами 28
2.7 Расщепление/полиаденилирование детерминирует терминацию транскрипции 30
2.8 Формирование петель у генов 31
3. Материалы и методы 33
3.1 Объекты 33
3.2 Молекулярное клонирование 33
3.2.1 Работа с бактериями 33
3.2.2 Общие методы работы с ДНК 34
3.2.3 Создание векторов с репортерной системой 38
3.3 Работа с культурой клеток S2 дрозофилы 39
3.3.1 Ведение культуры клеток S2 Drosophila melanogaster 39
3.3.2 Трансфекция клеток культуры S2 Drosophila melanogaster 39
3.4 Измерение активности люцифераз 39
3.5 Работа с РНК 40
3.5.1 Выделение РНК 40
3.5.2 Разделение ядерной и цитоплазматической фракций РНК 40
3.5.3 Нозерн-блот анализ 41
3.5.4 Количественная ОТ-ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени 43
3.6 Генетические методы 45
3.6.1 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий 45
3.6.2 Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в трансгенных линиях 46
3.6.3 Генетические скрещивания 46
3.7 Методы компьютерной обработки данных 47
3.7.1 Предсказание СПА 47
3.7.2 Поиск генов, полностью расположенных в интроне другого гена 48
3.7.3 Анализ паттерна экспрессии изоформ на основе данных секвенирования РНК 48
Результаты 49
4.1 СПА широко представлены в интронах Drosophila melanogaster 49
4.2 Экспериментальное подтверждение функционирования СПА в экзонах, но не в интронах генов 54
44.3 СПА, встроенные в интрон, функционально выключены 57
4.3.1 Создание модельной системы для определения эффективности работы СПА 57
4.3.2 Проверка активности СПА в модельной системе 60
4.3.3 Установление особенностей работы терминатора в интроне гена yellow 63
4.3.4 Исследование активности инсулятора 1А2 и сигнала полиаденилирования в интроне гена yellow в трансгенных линиях Drosophila melanogaster 64
4.3.5 Проверка активности СПА внутри искусственного интрона 69
4.4 Использование СПА внутри интронов - редкое явление в геноме и, по всей
видимости, является индуцибельным 71
5. Обсуждение 76
6. Выводы 80
Список цитированной литературы 81
- Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы
- Процесс кэпирования и его влияние на другие ко-транскрипционные события
- Общие методы работы с ДНК
- Экспериментальное подтверждение функционирования СПА в экзонах, но не в интронах генов
Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы
Большинство этапов биогенеза мРНК: транскрипция, кэпирование 5-конца, сплайсинг, расщепление/полиаденилирование – могут быть воссозданы in vitro независимо, но в ядре они происходят одновременно и в непосредственной близости друг от друга [6], [7], [8]. Когда различные этапы созревания мРНК происходят ко-транскрипционно, в одно время, в одном месте, появляется возможность для их взаимовлияния. Завершение одного этапа способствует прохождению следующего, увеличивая его эффективность и точность. Также возможен обратный процесс: этапы могут конкурировать между собой, приводя к появлению различных форм транскриптов, увеличивая генное разнообразие и возможности регуляции экспрессии гена.
Связь между процессами, сопровождающими транскрипцию, выявляется, когда мутации в факторе, отвечающем за один этап, влияют на другие процессы биогенеза мРНК. Например, связь между транскрипцией РНК-полимеразой II (РНКП II) и процессингом мРНК подтверждается тем фактом, что делеция в C-концевом домене (CTD) большой субъединицы РНК-полимеразы II приводит к ухудшению процессинга [9], хотя это влияние также зависит и от конкретного транскрибируемого гена [10]. В ряде работ были установлены функциональные связи между транскрипцией, процессингом и упаковкой мРНК in vitro [11], [12], [13].
Взаимодействие транскрипционного аппарата, процессов созревания мРНК и модификаций хроматина может осуществляться несколькими способами. Наиболее простой способ – собрать все факторы в одном месте на элонгационном комплексе РНКП II, ускоряя при этом процессы, идущие медленно по отдельности. Поэтому комплекс РНКП II должен обладать рядом характеристик, позволяющих собрать множество компонентов в одном месте.
Транскрипционный аппарат эукариот очень сложен в своем устройстве и функционировании. В отличие от бактерий, у которых гены транскрибируются одной РНК-полимеразой, эукариоты обладают тремя типами РНК-полимераз, специализирующихся на транскрипции определенных наборов генов. Все три полимеразы представляют собой мультисубъединичные комплексы из 10-12 компонентов и, несмотря на общую функцию, имеют только небольшое число общих компонентов.
Структура РНКП II на примере S. pombe (слева) и S. cerevisiae (справа). Разными цветами отмечены 12 субъединиц, из которых состоит РНКП II. Рисунок взят из [15]. сайтом, куда заходит транскрибируемая ДНК [14]. Каналы, ведущие в активный сайт, позволяют проникать нуклеотидам внутрь активного сайта и выходить синтезированной РНК. Рядом с каналом для РНК располагается неструктурированный C-концевой домен (CTD) большой субъединицы комплекса [16]. Хотя этот домен и не выполняет каталитической функции, его роль в транскрипции и процессинге мРНК огромна [17], [18], [19], [20]. Во-первых, домен является местом посадки транскрипционных факторов и факторов кэпирования, сплайсинга, полиаденилирования, элонгации, терминации и модификаций хроматина [21]. А во-вторых, распределение модифицированных аминокислотных остатков характеризует текущее функциональное состояние комплекса и определяет дальнейшее развитие событий.
Прямое взаимодействие с CTD показано для фермента кэпирования Cgt1, фактора расщепления/полиаденилирования Pcf11, метилтрансферазы гистонов Set2 и фактора терминации транскрипции Nrd1 [16], [22].
Второй способ организации сопряжения ко-транскрипционных процессов -аллостерическое регулирование, принцип которого заключается в том, что присутствие какого-либо компонента изменяет активность другого. К примеру, фосфорилирование CTD активирует гуанилтрансферазу, фермент кэпирования [23].
Третий способ «кинетического взаимодействия» направляет созревание мРНК по тому или иному направлению, изменяя длительность прохождения последовательных процессов. «Кинетическое взаимодействие» между элонгацией транскрипции и скоростью сборки сплайсосомы может регулировать альтернативный сплайсинг [4].
2.1 Роль C-концевого домена большой субъединицы РНК-полимеразы II в организации транскрипционного комплекса
CTD представляет собой гибкую платформу для посадки факторов процессинга мРНК и модификаторов хроматина [21]. Длина CTD во много раз превышает размеры глобулярной части РНКП II [16], обеспечивая достаточное пространство для связи с множеством партнеров. Домен состоит из повторяющегося гептамера YSPTSPS. Количество повторов у разных организмов различно: дрожжи содержат 26 повторов, Drosophila – 44, человек - 52. Кроме увеличения длины CTD у сложно устроенных организмов также наблюдаются изменения в некоторых позициях. У дрожжей почти все повторы идентичны, в то время как у высших эукариот часть аминокислот в некоторых гептамерах заменена [24] (рис. 2).
Рис. 2. Сравнительный анализ последовательностей CTD разных организмов: S.cerevisiae, S.pombe, D.rerio, H.sapiens. Консенсусный гептамер YSPTSPS отмечен красным, числа рядом – номера повторов. CTD S.pombe состоит из 29 повторов, 24 из которых – консенсусные; у S.cerevisiae - 19 из 26. CTD человека и рыбы содержат по 52 повтора. Отличия аминокислотной последовательности рыбы от человека отмечены желтым. Отклонения от консенсуса отмечены синим. Рисунок взят из Hsin et al [28]. Потенциально, все аминокислотные остатки CTD могут подвергаться модификациям: фосфорилированию, гликозилированию, убиквитинилированию.
Аминокислотные остатки в позициях S2, S5 и S7 (серин в позиции 2, 5, 7) гептамеров фосфорилируются и дефосфорилируются киназами и фосфатазами в зависимости от стадии транскрипционного цикла [16], [21] (рис. 3). Остаток аргинина (R1810) в позиции 7 неконсервативного 31-го гептамера преимущественно подвергается метилированию [25], в то время как остаток K7 дистальных неконсервативных гептамеров может метилироваться, сумоилироваться и убиквитинилироваться [25], [26], [27]. Кроме того, два пролина могут менять свою конформацию путем изомеризации (рис. 3).
Процесс кэпирования и его влияние на другие ко-транскрипционные события
Прямое взаимодействие между транскрипцией и сплайсингом было продемонстрировано во многих исследованиях. Более 25 лет назад было установлено, что проксимальный интрон способен усиливать транскрипцию гена [81]. Впоследствии было показано, что этот эффект связан с усилением инициации транскрипции РНКП II [82].
Большая часть интронов удаляется ко-транскрипционно, но не все события сплайсинга заканчиваются во время транскрипции. Возможно, что сборка большинства сплайсосом все же происходит на вновь синтезируемом транскрипте. Сплайсосома – один из примеров последовательной самоорганизации. Сплайсинг представляет собой сложную двухстадийную реакцию транс-этерификации, осуществляемую сплайсосомой - рибонуклеопротеиновым комплексом, состоящим из пяти U-богатых мяРНК (U1, U2, U4, U5 и U6) и более чем двухсот белков. In vitro U1 snRNP связывается с 5-сайтом сплайсинга предварительно синтезированной матрицы, а U2AF связывается с 3-сайтом сплайсинга, с последующим спариванием U2 snRNP с точкой ветвления. Затем во взаимодействия вовлекаются факторы snRNP U4-U6/U5, что приводит к реорганизации комплекса в каталитически активную форму. ChIP-анализ котранскрипционного сплайсинга дрожжей подтвердил пошаговую сборку сплайсосомы, схожую с наблюдаемой in vitro [83], [84]. С другой стороны, возможность ко-транскрипционного привлечения уже предварительно собранного snRNP не может быть исключена, особенно у млекопитающих [85]. Сплайсинг предварительно синтезированной пре-мРНК, введенной в ооциты Xenopus, проходит менее эффективно по сравнению со сплайсингом, связанным с транскрипцией [86], [32].
Недавние данные говорят о существовании тесной связи между сплайсосомами и транскрипционным аппаратом и о прохождении сплайсинга во время синтеза пре-мРНК [87], [88], [89], [90]. Кроме того, результаты RNA-seq-анализа транскриптома человека выявили широкое распространение ко-транскрипционного сплайсинга [91].
Существует две модели сопряжения транскрипции и сплайсинга: «физическое сопряжение» и «кинетическое сопряжение». Обе модели, по всей видимости, описывают две стороны одного и того же процесса.
В пользу модели физического сопряжения говорят данные о взаимодействии факторов сплайсинга и компонентов транскрипционного комплекса. Известно, что CTD выполняет важную роль в сопряжении ко-транскрипционных процессов [92], [93]. В поддержку этого существует прямое доказательство роли CTD, фосфорилированного по остатку S2, в специфичном привлечении факторов сплайсинга (U2AF65) и терминации (PCF11) транскрипции к транскрибирующей РНКП II in vivo [94]. Это исследование впервые представило доказательства того, что код CTD регулирует ко-транскрипционный процессинг пре-мРНК. Кроме того, в модели физического сопряжения большое количество факторов, помимо CTD, взаимодействуют друг с другом. Среди них SR-белки и факторы, играющие роль в регуляции и транскрипции и сплайсинга, и/или физически взаимодействующие с компонентами аппаратов транскрипции и сплайсинга [95], [96]. Дрожжевой белок Prp40 из комплекса U1 мяРНП, соединяющий 5-сайт сплайсинга и точку ветвления, может связываться напрямую с фосфорилированным CTD [21]. U1 мяРНП, но не другие мяРНП, также соосаждается в одном комплексе с РНКП II [11]. Более того U1 мяРНП на 5-сайте сплайсинга может активировать привлечение РНКП II и общих транскрипционных факторов на промотор, независимо от процесса сплайсинга [97]. Семейство факторов сплайсинга SR связывается с образующимся транскриптом на последовательностях энхансеров сплайсинга и регулирует сборку сплайсосомы путем контакта с U1 и U2 snRNP [98]. SR-белки соосаждаются с РНКП II, а представители подсемейства SC35 вовлечены в стимуляцию элонгации транскрипции через взаимодействие с PTEFb [99]. SR-белки, отличные от подсемейства SC35, по всей видимости, вовлечены в элонгационный комплекс за счет взаимодействия с образующимся транскриптом, а не через белок-белковые взаимодействия с РНКП II [100]. Функциональная связь между белками SR и транскрипцией подтверждается данными, согласно которым регуляция альтернативного сплайсинга фактором SRp20 требует наличия CTD [101].
Как и модель физического сопряжения сплайсинга и транскрипции, кинетическая модель подтверждена рядом работ. Согласно данной модели, скорость элонгации транскрипции играет решающую роль в исходе конкурирующих реакций сплайсинга, происходящих ко-транскрипционно (рис. 5). В недавних исследованиях эта модель
Скорость элонгации транскрипции определяет исход конкурирующих реакций сплайсинга. Сигнал сплайсинга (синий), расположенный перед альтернативным экзоном, слабее, чем сигнал, расположенный ниже (красный). Медленная скорость элонгации (справа) позволяет включить альтернативный экзон. Быстрая элонгация (справа) способствует прохождению сплайсинга по более сильному сигналу и пропуску альтернативного экзона. Рисунок взят из [110]. получила экспериментальное подтверждение [102], [103], [104], [105], [106]. «Кинетическая» модель подразумевает, что в тех случаях, когда РНКП II продвигается на достаточно низкой скорости, появляется временной промежуток, названный «окно возможностей», в течение которого слабый сигнал сплайсинга может быть распознан и использован [20]. Таким образом, кинетическая модель сопряжения может объяснить некоторые случаи альтернативного сплайсинга, связанные с изменением скорости РНКП II. Синтез молекулы РНК не монотонный, а прерываемый многочисленными паузами, процесс. Элонгация РНКП II идет приблизительно со средней скоростью 1,9 т.н./мин [107], а на максимальной скорости достигает 4,3 т.н./мин [108]. Кроме многочисленных внешних факторов, влияющих на скорость движения полимеразы, скорость транскрипции может ограничиваться скоростью диффузии НТФ в активный сайт. Канал, ведущий в активный сайт, содержит консервативные заряженные аминокислотные остатки, которые за счет электростатических взаимодействий могут ограничивать диффузию нуклеотидов, при этом лимитируя скорость транскрипции [109]. Эволюционные изменения канала могли привести к тому, что скорость транскрипции РНКП II попала в диапазон, благоприятный для ко-транскрипционного прохождения процессинга и упаковки мРНК. Возможно, одной из причин отсутствия ко-транскрипционного процессинга мРНК в работах с экспрессией эукариотических генов T7 РНК-полимеразой [12], [33] является высокая скорость транскрипции, значительно превосходящая таковую у РНКП II. В отличие от других этапов процессинга мРНК, сплайсинг может происходить многократно по мере прохождения транскрипции. Каким образом связь аппарата сплайсинга с транскрипцией обеспечивает многократное использование компонентов сплайсосомы - неизвестно.
Общие методы работы с ДНК
На каждую трансфекцию брали около 8x105 клеток. За два часа до трансфекции клетки разносили по лункам. Трансфекцию проводили с использованием реагента Cellfectin II (Invitrogen). На 1 трансфекцию брали 1 мкг ДНК. Смешивали ее с 100 мкл среды. Брали 5 мкл Cellfectin II, предварительно ресуспендированного, и смешивали с 100 мкл среды. Инкубировали 10-15 минут. Оба раствора смешивали и инкубировали 10-15 минут. Наслаивали смесь на чашки с клетками. Клетки собирали через 48 часов после трансфекции.
Активность люцифераз анализировали с помощью Firefly & Renilla Luciferase Assay Kit (Biotium). Клетки смывали с лунок, осаждали центрифугированием, промывали фосфатным буфером, повторно осаждали. К осадку добавляли 200 мкл лизирующего буфера. Лизис проводили в течение 30 мин при комнатной температуре. Лизат осветляли центрифугированием, разносили по 20 мкл в планшет для измерения активности люцифераз. Для измерения активности люциферазы светлячка к пробе добавляли 100 мкл буфера с субстратом (D-люциферин). Для измерения активности люциферазы медузы к пробе добавляли 50 мкл усиливающего сигнал раствора, а затем 50 мкл буфера с субстратом (целентеразин). Измерение проводили на планшетном анализаторе с чувствительностью 100 и временем экспозиции
РНК выделяли из трансфицированных клеток при помощи TRI-реагента (Ambion). Собранные после трансфекции клетки промывали фосфатным буфером, осаждали центрифугированием. Осадок ресуспендировали в 1 мл TRI-реагента. Инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Центрифугировали в течение 10 мин при максимальных оборотах. К супернатанту добавляли 100 мкл BCP (1-Bromo-3-chloropropane, бром-хлор-пропан), встряхивали, инкубировали 5 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая. Центрифугировали в течение 15 мин при максимальных оборотах. Водную фазу осторожно отбирали и переносили в чистый 1,5 мл эппендорф. Добавляли 0,7 объема изопропанола, выдерживали в течение 10 мин при комнатной температуре. РНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин на максимальных оборотах. Осадок промывали 70% этанолом, подсушивали, растворяли в необходимом объеме воды.
Клетки культуры S2 снимали с 100-мм чашек, промывали фосфатным буфером, осаждали и ресуспендировали в 100 мкл TD-буфера (0,8% NaCl, 0,028М KCl, 0,01% Na2HPO4, 0,3% Tris-HCl; pH 7,4–7,5). В полученную суспензию добавляли 100 мкл TD с 1% NP-40 и ингибитором рибонуклеаз SUPERase-In (Ambion), инкубировали в течение 5 минут на льду. Препарат центрифугировали, супернатант использовали для выделения цитоплазматической фракции РНК, используя TRI-реагент. Осадок, содержащий ядра, ресуспендировали в 200 мкл TD с 0.5% NP-40 и SUPERase-In, инкубировали на льду и повторно центрифугировали. Ядерную фракцию выделяли из осадка, используя TRI-реагент. 3.5.3 Нозерн-блот анализ
Для интересуемого участка РНК синтезировали комплементарные зонды, меченые биотином. Для этого участок амплифицировали и клонировали в вектор, содержащий T7-промотор. Полученную плазмиду использовали как матрицу для синтеза зонда. Для этого ее линеаризовали эндонуклеазой рестрикции по сайту ниже интересуемого фрагмента. Транскрипцию in vitro проводили с помощью наборов MEGAshortscript и MAXIscript (Ambion). Реакционная смесь собиралась по протоколу производителя и содержала буфер, РНК-полимеразу T7, нуклеотиды: АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ, и биотин-16-УТФ (Roche) в соотношении 1:1:1:0,7:0,3. Реакцию проводили в течение 2 часов при 37C, затем обрабатывали turboDNAse I (Ambion) и очищали от свободных нуклеотидов переосаждением или с помощью TRI-реагента.
Объем образца доводили водой до 50 мкл, добавляли 5 мкл 5 M ацетата аммония и три объема этанола, охлаждали при –20C около 30 минут и центрифугировали в течение 15 минут на максимальных оборотах при 4C. Осадок промывали 70% этанолом, подсушивали, растворяли в воде, хранили при -70C.
Заливали гель толщиной около 8-10 мм. На 100 мл геля брали 1 г агарозы, 80 мл воды. Нагревали до растворения агарозы, остужали до 50-60C. Добавляли 37% формалин (18 мл на 100 мл геля) и 50x буфер MOPS (1 М MOPS (morpholinopropanesulphonic acid), 250 мМ ацетат натрия, 25 мМ EDTA, pH 7,0). Гель заливали в вытяжном шкафу.
Пробы смешивали с двукратным буфером для внесения (95% формамид, 0,025% SDS, 0,025% бромфеноловый синий, 0,025% ксиленцианол FF, 0,025% бромистый этидий, 0,5 мМ EDTA) в соотношении 1:1, инкубировали в течение 10 мин при 70C, затем охлаждали на льду.
Пробы наносили на гель. Электрофорез проводили в 1xMOPS буфере при напряженности поля 2 В/см. После электрофореза гель промывали деионизованной водой, фотографировали под ультрафиолетом, уравновешивали в 0,5x трис-боратном буфере (TBE) в течение 15 минут.
Перенос РНК на мембрану проводили в аппарате Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Biorad). По размеру геля вырезали четыре куска фильтровальной бумаги толщиной около 0,5 см (Biorad). Первый смачивали в 0,5x TBE, клали его на платиновый анод прибора, сверху - уравновешенную в TBE мембрану (BrightStar-Plus Positively Charged Nylon Membrane, Ambion). На мембрану укладывали гель, поверх геля последовательно клали смоченные в TBE три куска бумаги. Стопка должна быть влажной, но не мокрой. Сверху стопку прижимали катодом. При напряжении 25 В, сила тока задавалась в зависимости от размера геля, вычислялась по формуле I=0,003A длина (см) ширина (см) стопки. Время переноса составляло 25-30 минут. После переноса РНК пришивали к мембране УФ-излучением с энергией 120 мДж в течение 30 секунд.
Прогревали буфер ULTRAhyb (Ambion) до 68C. Мембрану переносили в гибридизационные стаканы, в которые добавляли 6-10 мл гибридизационного буфера, и проводили предгибридизацию в течение 30 минут на 68C. Растворяли 0,1 нмоль зонда в 1 мл гибридизационного буфера и переносили в гибридизационные стаканы. Гибридизацию проводили в течение 14-24 часов при 68C. После гибридизации мембраны дважды по 15 мин отмывали в буфере (0.1 X SSC, 0.1% SDS).
Экспериментальное подтверждение функционирования СПА в экзонах, но не в интронах генов
Транскрипция у эукариот - сложный процесс, состоящий из множества этапов. Каждый этап должен осуществляться в строго определенной последовательности, происходить в определенное время транскрипционного цикла. Поэтому должны существовать механизмы, благодаря которым осуществляется сопряжение ко транскрипционных процессов. В нашем исследовании мы исходили из предположения, что использование неуместных СПА внутри интронов не допускается. Это предположение было выдвинуто в связи с тем, что сигналы полиаденилирования несложные в своем строении мотивы, и это может приводить к их большой встречаемости в геноме по теории вероятностей. Несвоевременное их функционирование во время транскрипции может приводить к дисфункции гена. Кроме того, было показано, что в 5-нетранслируемых областях СПА заблокированы, что наводит на мысль о существовании механизма блокирования СПА в неподходящем месте. Ранее был описан феномен функционирования скрытых СПА внутри интрона после нокдауна U1 snRNP в клетках культуры HeLa [177]. В данном эксперименте истощение U1 snRNP приводило к тому, что не все интроны оказывались способны ко-транскрипционно определить свои границы, что, по всей видимости, приводило к активации СПА, как если бы они находились внутри экзонов.
В начале нашей работы мы проверили частоту встречаемости СПА в интронах Drosophila melanogaster и обнаружили, что СПА широко представлены в интронах – более 30% от всех интронов. С учетом того факта, что многие гены содержат более одного интрона, можно сказать, что проблема преждевременных СПА характерна для большого их количества. Затем мы обратили внимание на случаи, когда один ген расположен в интроне другого так, что транскрипционный аппарат последнего вынужден проходить преждевременный для него СПА внутреннего гена. Оказалось, что это довольно распространенное явление. Таким образом, можно утверждать, что в геноме очень часто встречаются скрытые СПА, часть из которых является работоспособной в только определенном геномном контексте. Наши опыты на примере пар вложенный-внешний ген выявили, что такая организация генов не приводит к нарушению работы внешнего гена. При транскрипции внешнего гена СПА вложенного гена, расположенный в интроне, игнорируется. Это было показано при помощи количественной ПЦР и нозерн-блот-анализа.
Созданная в работе репортерная система удобна для измерения активности СПА. Она позволяет не только выявить функционирующие сайты, но и количественно оценить силу сигнала, определить отношение количества транскриптов, у которых произошло расщепление/полиаденилирование к общему количеству синтезируемой РНК.
С использованием созданной репортерной системы, была проверена активность СПА в интронах. Нами не было выявлено транскриптов, получаемых при процессинге на СПА в интронах, как с интроном из гена yellow, так и с искусственно синтезированным интроном. Примечательно, что делеция всего нескольких нуклеотидов донорного сайта сплайсинга в репортерной системе приводит к восстановлению функции СПА.
Блокирование функционирования СПА на примере интрона гена yellow также было показано на трансгенных линиях Drosophila melanogaster. Анализ полного транскриптома показал, что изоформы, получаемые при использовании СПА внутри интронов, редко экспрессируются у Drosophila melanogaster, а отношение между интрон-терминированной и сплайсированной формами изменяется в процессе развития.
Объединяя наши и ранее полученные [178], [177] данные, мы заключили, что транскрипция в общем случае не прерывается на СПА внутри интронов. Исключения из этого правила редки и указывают на то, что должны быть дополнительные условия для активация СПА внутри интронов. Примечателен тот факт, что среди генов с альтернативным включением 3-экзона, мы обнаружили только 16 генов, экспрессирующих две изоформы транскриптов одновременно, одна – сплайсированная, вторая – процессированная на СПА внутри интрона. По нашему мнению, в данном случае происходит регулируемое переключение между изоформами.
Для объяснения феномена блокирования активности СПА в интронах генов, можно предложить две модели. Первая модель, «антитерминации» основана на данных о сопряжении между факторами сплайсинга и комплексом расщепления/полиаденилирования [179], [178], [177]. Возможно, что факторы сплайсинга и полиаденилирования взаимодействуют с элонгационным комплексом РНКП II на конкурентной основе с доминированием первых над вторыми (рис. 19А).
Две возможные модели. А. В модели «антитерминации» СПА не доступен для комплекса расщепления/полиаденилирования из-за конкурентного связывания факторов сплайсинга и расщепления/полиаденилирования с элонгирующим комплексом РНКП II. Сплайсинг берет верх над полиаденилированием в связи с его более ранним вовлечением в процесс. Б. В «кинетической» модели СПА доступен, но движущаяся РНК-полимераза достигает 3СС достаточно быстро, в результате запускается реакция сплайсинга. Внесенные разрывы в транскрипт остаются в вырезаемом интермедиате и не приводят к терминации транскрипции.
Вторая, «кинетическая модель», основана на предположении, что РНКП II, после прохождения участка СПА внутри интрона и внесения разрыва в транскрипт, продолжает свое движение, синтезируя РНК-предшественник [181], [182]; и в результате она успешно достигает акцепторный сайт сплайсинга, вызывая запуск и прохождение реакции сплайсинга, с образованием структуры «лассо» (рис. 19Б). В данном варианте расщепление и полиаденилирование могут происходить, но не влияют на созревание мРНК, так как интермедиат «лассо» вырезается. Известно, что если в интроне разместить элемент для ко-транскрипционного расщепления (CoTC), то это не приводит к нарушению сплайсинга, и экзоны, окружающие интрон, точно и эффективно сплайсируются вместе [183]. Мы можем предположить, что СПА внутри интрона работает схожим образом как и CoTC. Данная модель предполагает, что включение СПА в интроне может регулироваться не только маскированием донорного сайта сплайсинга, но и изменением скорости РНКП II, зависящей также от метилирования CpG, статуса хроматина, связанных с участками интронов белков. В общем случае РНКП II движется с высокой скоростью, достаточной для достижения акцепторного сайта, перед тем как быть сброшенной эндонуклеазами, которые привлекаются на 5-конец синтезируемого РНК-предшественника после расщепления на СПА внутри интрона. Если РНКП II сделает паузу или замедлится, транскрипция будет терминирована в интроне, что в результате приведет к выработке короткой изоформы.
Наблюдаемое явление способствует пониманию логики транскрипции: каждый этап происходит строго в отведенный для него промежуток времени, формирование 3-конца в интроне заблокировано. Однако молекулярные механизмы, ответственные за эту особенность, требуют отдельных исследований.
