Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Организация хроматина 12
1.2 Локальная и глобальная регуляция транскрипционной активности хроматина 12
1.2.1 Неактивный хроматин у D. melanogaster 16
1.2.1.1 Pc-опосредованная инактивация 17
1.2.1.1 Pc-опосредованная инактивация 18
1.2.2 Типы хроматина у D. melanogaster 18
1.3 Репликация ДНК и ее связь с транскрипционной активностью хроматина 23
1.3.1 Регуляция времени репликации 23
1.3.1.1 Регуляция времени репликации –глобинового локуса млекопитающих 23
1.3.1.2 Регуляция времени репликации Igh локуса грызунов 24
1.3.1.3 Глобальная регуляция времени репликации при дифференцировке клеток 25
1.3.1.4 Исследования времени репликации ДНК в культивируемых in vitro клетках дрозофилы 26
1.3.2 Время репликации и транскрипционная активность 27
1.3.3 Механизм репликации ДНК 29
1.3.4 Эндорепликация 29
1.3.5 Недорепликация политенных хромосом у D. melanogaster 34
1.4 Влияние белка SUUR на процесс репликации хромосом D. melanogaster 39
1.5 Ассоциация белка SUUR с транскрипционно неактивным хроматином D. melanogaster 39
1.6 Заключение 41
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1 Создание набора генов для изучения районов недорепликации 42
2.2 Выявление районов, обладающих свойствами районов недорепликации 43
2.3 Выделение РНК и анализ экспрессии генов в развитии 45
2.4 Метод DamID 49
2.5 Молекулярное клонирование 51
2.6 Генетическая трансформация дрозофилы 55
2.7 Процедура DamID 56
2.8 Биоинформатическая обработка данных 58
Глава 3. Результаты 63
3.1 Связывание белка SUUR с районами недорепликации политенных хромосом слюнных желез D. melanogaster 63
3.2 Организация генов в районах недорепликации 68
3.2.1 Районы недорепликации характеризуются низкой плотностью генов 68
3.2.2 Районы недорепликации обогащены семенник-специфичными генами 71
3.2.3 Предсказание районов недорепликации 74
3.3 Динамика связывания SUUR в развитии 76
3.4 Связь динамики белка SUUR c экспрессией генов в развитии 80
3.5 Динамика белка SUUR в контексте изменения состояния хроматина в развитии 86
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ 93
4.1 Особенности генетической организации районов, обогащенных белком SUUR 93
4.2 Динамика связывания белка SUUR и регуляция генов 98
4.3 Динамика SUUR в разных типах хроматина 101
Выводы 103
Список литературы 104
- Репликация ДНК и ее связь с транскрипционной активностью хроматина
- Ассоциация белка SUUR с транскрипционно неактивным хроматином D. melanogaster
- Генетическая трансформация дрозофилы
- Районы недорепликации обогащены семенник-специфичными генами
Введение к работе
Актуальность проблемы. Хромосомы высших эукариот состоят из протяженных доменов, служащих для обеспечения правильной активности генов в клетке. Эти домены поддерживают активное или репрессированное состояние расположенных в них генов, что также коррелирует с другими аспектами их функционирования. Так, известно, что репликация активных участков хромосом обычно проходит в начале S-фазы клеточного цикла, тогда как неактивные районы реплицируются в конце S-фазы, однако механизм, лежащий в основе этого явления, остается непонятым (Schubeler et al., 2002; MacAlpine et al., 2004).
Для разных групп организмов была установлена закономерность: районы, проявляющие транскрипционную активность в большинстве клеточных типов, характеризуются повышенной плотностью генов. В участках, обогащенных тканеспецифично экспрессирующимися генами, этот показатель обычно снижен, и в большинстве клеточных типов такие районы формируют неактивные домены (Huvet et al., 2007; Hiratani et al., 2008). Эти наблюдения говорят о том, что особенности расположения генов в геноме и регуляция хроматиновых доменов каким-то образом связаны между собой. При этом следует понимать, что расположение генов во всех клетках организма одинаково, в то время как состояние хроматина может изменяться в разных клеточных типах. Вероятно, сниженная плотность генов в районах, обогащенных тканеспецифичными генами, имеет отношение к регуляции их активности в процессе развития.
Политенные хромосомы слюнных желез личинок Drosophila melanogaster содержат набор транскрипционно неактивных участков, характеризующихся недорепликацией, которая, по-видимому, является следствием их поздней репликации (Zhimulev et al., 1982). Недорепликация проявляется в том, что эти районы содержат значительно меньшее число нитей ДНК, чем окружающие их участки политенных хромосом. Длина районов недорепликации может достигать нескольких сотен т.п.н. (Belyakin et al., 2005; Sher et al., 2011).
На небольшой выборке генов было показано, что эти районы могут быть обогащены тканеспецифичными генами, в частности, избирательно активными в семенниках (Belyakin et al., 2005). Таким образом, районы недорепликации в политенных хромосомах D. melanogaster проявляют признаки, делающие их похожими на домены, описанные у других организмов. Однако систематический анализ взаимного расположения и транскрипционной специфичности содержащихся в них генов не проводился.
Мутация гена SuUR (Suppressor of UnderReplication) ускоряет прохождение репликации в описанных выше неактивных районах политенных хромосом и приводит к их полной политенизации (Belyaeva et al., 1998; Sher et al., 2012). Иммуноокрашивание политенных хромосом показало, что белок SUUR в норме связывается с позднореплицируемыми районами (Makunin et al., 2002). Этот результат был подтвержден позднее в экспериментах по картированию бела SUUR методом DamID в культуре клеток Kc Drosophila melanogaster (Pindyurin et al., 2007).
Механизм, в котором задействован белок SUUR, остается неизвестным, однако ясно, что он тесно ассоциирован с транскрипционно неактивными районами хромосом. В культуре клеток Kc белок SUUR является одним из основных компонентов всех трех репрессивных типов хроматина, выделенных на основании картирования 53 хроматиновых белков (Filion et al., 2010).
Хроматин является динамичной структурой и, как его белковый состав, так и транскрипционная активность, могут различаться между типами клеток и стадиями развития. В представленной работе был поставлен ряд вопросов о функционировании и динамике доменов, связанных с белком SUUR. Было неясно, обладают ли эти районы какими-либо особенностями расположения генов, как было описано для других организмов, где и когда эти гены активны, а также насколько эти домены изменяются в процессе развития D. melanogaster.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы было изучение свойств транскрипционно неактивных районов хромосом, связанных с белком SUUR, в процессе развития D. melanogaster. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Изучить особенности расположения генов в районах недорепликации политенных хромосом слюнных желез личинок дрозофилы
-
Исследовать транскрипционную специфичность генов в районах недорепликации
-
Получить полногеномные профили связывания белка SUUR в разных типах клеток дрозофилы
-
Исследовать динамику связывания белка SUUR в разных типах клеток
-
Проверить наличие корреляции между изменением уровня связывания SUUR в разных клеточных типах и активностью генов
Научная новизна. В представленной работе на молекулярном уровне показано, что районы недорепликации в хромосомах слюнных желез дрозофилы обогащены белком SUUR. Установлено, что такие районы обладают сниженной плотностью генов и имеют длинные межгенные
интервалы. Впервые показано, что эти характеристики, наряду с обогащением семенник-специфичными генами, свойственны в первую очередь хроматину, связанному с белком SUUR. Установлено, что белок SUUR распределен в хроматине из разных тканей по-разному, причем наблюдаемая динамика отличается для разных типов хроматина, согласно классификации Filion et al. (2010). Показано, что участки хромосом, в которых изменяется уровень связывания белка SUUR в разных типах клеток, содержат преимущественно тканеспецифичные гены, имеющие разный уровень экспрессии между этими типами клеток.
Научно-практическая ценность. Получены данные об экспрессии 14056 генов дрозофилы на десяти разных стадиях развития от эмбриона до имаго обоих полов. Построены профили связывания белка SUUR в эмбрионах, слюнных железах и мозговых ганглиях личинок дрозофилы. Создан алгоритм, позволяющий находить в геноме районы, обладающие низкой плотностью генов, длинными межгенными интервалами и обогащенные семенник-специфичными генами. С использованием этого алгоритма найдены 110 районов, характеризующихся сниженным уровнем политенизации и связыванием белка SUUR. Эти данные могут быть использованы для дальнейшего изучения организации тканеспецифичных генов дрозофилы. Предложен метод, позволяющий оценивать динамику хроматиновых белков в разных клеточных типах.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту. В хромосомах слюнных желез личинок дрозофилы белок SUUR связывается с районами, характеризующимися низкой плотностью генов, длинными межгенными интервалами и обогащением семенник-специфичными генами. Профиль связывания белка SUUR отличается в хромосомах эмбрионов, мозговых ганглиев и слюнных железах личинок, а так же в культуре клеток Кс. Эти отличия коррелируют с изменением в распределении модификации H3K27me3 и с активностью генов. Наблюдаемые различия в связывании SUUR отличаются для разных типов хроматина, согласно классификации Filion et al. (2010).
Личный вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Работа по молекулярному клонированию векторов pUC18-Dam-Myc-SUUR и pUC18-Dam-Myc проведена С.Н. Белякиным. Работа по получению данных о транскрипции генов дрозофилы на 10 стадиях развития выполнена совместно с С.Н. Белякиным и В.В. Шломой. Разработка алгоритма предсказания районов недорепликации осуществлялась совместно с В.Н. Бабенко, И.Ф. Жимулевым, Е.С. Беляевой и С.Н. Белякиным.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях: Международная конференция "Хромосома-2009" (Новосибирск, 2009), Международная Студенческая Конференция (Новосибирск, 2010), ESF-EMBO Conference on System Biology of Drosophila (Пултуск, Польша, 2012).
Публикации. Результаты исследования представлены в 5 статьях и 3 тезисах конференций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и содержит 23 рисунка. Текст состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов, результатов, обсуждения и выводов, а так же списка цитируемой литературы, в который входит 176 ссылок.
Репликация ДНК и ее связь с транскрипционной активностью хроматина
Репликация ДНК и ее связь с транскрипционной активностью хроматина Репликация ДНК является неотъемлемой частью клеточного цикла и служит для удвоения генома клетки. У высших эукариот этот процесс обладает рядом особенностей, связанных с функционированием хромосом.
Время репликации фрагмента ДНК зависит от его удаленности от ближайшей точки начала репликации – origin, а так же от времени, когда origin активируется в S-фазе. В то же время, неизвестно, почему разные районы в геноме реплицируются в разное время. Понятно лишь, что время репликации определяется не случайно, а является либо результатом, либо участником регуляции генетических процессов в клетке.
Регуляция времени репликации –глобинового локуса млекопитающих Одной из наиболее популярных и изученных моделей для исследования регуляции времени репликации является локус гена -глобина у млекопитающих. В неэритроидных клетках этот локус, занимающий 200-300 т.п.н., представляет собой поздно реплицирующийся участок ДНК. В эритробластах, которые экспрессируют ген -глобина, район ДНК размером около 1 млн.п.н., окружающий этот ген, становится рано реплицирующимся (Cimbora et al., 2000; Simon et al., 2001).
Известно, что репликация этого локуса во всех клетках происходит с одного и того же двунаправленного origin, расположенного рядом с геном -глобина (Kitsberg et al., 1993; Aladjem et al., 1995). У человека была найдена делеция участка ДНК длиной 40 т.п.н. на расстоянии 52 т.п.н. от этого origin. В отсутствие данного участка, -глобиновый локус становится транскрипционно неактивным и поздно реплицируемым в эритробластах, причем его репликация происходит с другого origin, расположенного в 15 т.п.н. от гена -глобина (Epner et al., 1981; Aladjem et al., 1995). В районе этой делеции находится кластер из 5 сайтов, гиперчувствительных к ДНКазе I, занимающий 25 т.п.н. – LCR (Locus Control Region). Было сделано предположение, что он может отвечать за время репликации этого локуса.
С этим согласуется результат эксперимента, в котором несколько трансгенных конструкций, содержащих LCR, были встроены в различные участки генома мыши. Вне зависимости от того, когда репликация в этих участках происходит в норме, после ввода LCR эти районы начинали поздно реплицироваться в неэритроидных клетках и рано реплицироваться в эритроидных клетках (Simon et al., 2001). Этот эксперимент позволяет предположить, что какие-то цис-действующие элементы внутри LCR локуса влияют на время репликации окружающей ДНК, но не отвечает на вопрос о том, как это происходит – через раннюю активацию origin или через глобальную перестройку хроматина.
Другим известным объектом для изучения времени репликации является локус тяжелой цепи иммуноглобулина (Igh) грызунов, занимающий около 3 млн.п.н. Известно, что в клетках, не относящихся к линии В-лимфоцитов, этот участок реплицируется поздно, в то время как в пре-В-лимфоцитах, он реплицируется в начале S-фазы (Brown et al., 1987; Hatton et al., 1988).
Было обнаружено, что в В-лимфоцитарных клетках репликация происходит с нескольких двунаправленных origin. В других клетках, где этот локус реплицируется поздно, репликация идет с одного однонаправленного origin, в направлении, противоположном транскрипции содержащихся в локусе генов (Zhou et al., 2002). Также в этом исследовании было установлено, что при ранней репликации локуса Igh, он расположен в отдалении от периферии ядра, а в случае поздней репликации – около ядерной оболочки. Такую же закономерность наблюдали и в других исследованиях (O Keefe et al., 1992; Dimitrova, Gilbert, 1999).
Глобальная регуляция времени репликации при дифференцировке клеток При изучении репликации в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК) мыши и в их дифференцированных производных выяснилось, что хромосомы ЭСК состоят из доменов размером в несколько млн.п.н., имеющих различное время репликации. Между собой эти домены разделены районами, которые обеднены точками начала репликации (Hiratani et al., 2008).
В процессе дифференцировки многие из таких доменов, расположенных рядом друг с другом и имеющих разное время репликации, сливаются в крупные, координированно реплицируемые районы хромосом. Интересно, что эти новые репликационные домены хорошо коррелируют с расположением изохор (протяженных районов ДНК, имеющих относительно постоянный процент ГЦ/АТ пар) в геноме – поздно реплицируемые районы являются АТ-богатыми, а рано реплицируемые – ГЦ-богатыми (Hiratani et al., 2008).
С этим согласуется работа, в которой показано, что в процессе дифференцировки у Xenopus повышается уровень синтеза гистона H1 и снижается уровень синтеза комплексов хроматиновых белков HMG-I/Y (Flickinger, 2001). Известно, что гистон Н1 связывается с АТ-богатым хроматином (Renz, Day, 1976), что приводит к конденсации последнего (Garrard, 1991). Это ведет к тому, что уменьшается число репликационных событий на единицу длинны ДНК (Lu et al., 1998), что в свою очередь может приводить к смещению времени репликации к концу S-фазы. Комплексы белков HMG-I/Y связываются с АТ-богатыми участками ДНК и могут мешать связыванию гистона Н1, тем самым позволяя репликации проходить раньше (Zhao et al., 1993; Maher, Nathans, 1996; Bonnefoy et al., 1999). Возможно, таким образом происходит изменение времени репликации в процессе дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши.
Похожую корреляцию времени репликации с ГЦ составом района установили и в ряде других работ (Woodfine et al., 2004; Schmegner et al., 2007). Однако такая закономерность, скорее всего, является отражением второстепенного и необязательного свойства районов с разным временем репликации, так как одни и те же участки ДНК в разных тканях могут иметь разное время репликации, в то время как их ГЦ-состав не меняется (Brown et al., 1987; Hatton et al., 1988; Cimbora et al., 2000; Simon et al., 2001). Например, инактивированная Х-хромосома самок млекопитающих реплицируется позже, чем гомологичная ей активная хромосома (Singh et al., 2003), хотя по ГЦ-составу они идентичны.
Ассоциация белка SUUR с транскрипционно неактивным хроматином D. melanogaster
Репликативные вилки, продвигающиеся с краев этих районов навстречу друг другу, тормозятся белком SUUR, в связи с чем не успевают пройти репликацию до конца сокращенной S-фазы эндоцикла. Такое предположение косвенно подтверждается результатами другой работы, в которой было установлено, что белок SUUR связывается с хромосомами не постоянно, а преимущественно в S-фазе, причем ближе к ее концу (Kolesnikova et al., 2013). Более того, на цитологическом и биохимическом уровнях была показана связь SUUR с белком PCNA – одним из главных компонентов репликационного аппарата клетки (Kolesnikova et al., 2013).
Ассоциация белка SUUR с транскрипционно неактивным хроматином D. melanogaster При цитологическом исследовании связывания белка SUUR с хромосомами слюнных желез было показано, что этот белок связывается с воспроизводящимся набором районов генома, соответствующим районам интеркалярного гетерохроматина (Makunin et al., 2002). При искусственном усилении экспрессии белка SUUR, появляются дополнительные сайты его связывания с хромосомами, также соответствующие гетерохроматиновым участкам (Makunin et al., 2002; Zhimulev et al., 2003a).
Другим признаком связи белка SUUR с неактивным хроматином служат свидетельства его взаимодействий и колокализаций с белками гетерохроматина. Так, при иммунофлуоресцентном окрашивании политенных хромосом слюнных желез выяснилось, что в 67% участков, где детектируется SUUR, так же выявляется и белок Polycomb (Zhimulev et al., 2003a). Более того, при изучении связывания белка SUUR с хромосомами культуры клеток Кс оказалось, что он часто колокализуется с белками из комплексов как PRC1 (Pc, Sce), так и PRC2 (Esc), а так же с модификацией H3K27me3, характерной для этого типа инактивации (Pindyurin et al., 2007). Молекулярный анализ распределения H3K27me3 на хромосомах установил, что у мух, несущих мутацию SuUR, исчезает значительная часть этого типа метилирования, в особенности в районах недорепликации (Sher et al., 2012). Однако, распределение сайтов связывания белка Pc на политенных хромосомах слюнных желез практически не изменяется у мух с мутацией SuUR (Zhimulev et al., 2003a), что, по-видимому, свидетельствует об отсутствии прямой функциональной связи между этими белками.
Помимо корреляции с Pc-инактивированным хроматином, достоверно показана связь SUUR со вторым хорошо изученным типом инактивации хроматина, обусловленным белком HP1. Выяснилось, что связывание двух основных белков, ответственных за работу этого механизма – HP1 и SU(VAR)3-9, с хромосомами клеток Кс коррелирует со связыванием белка SUUR. Так, 46% генов-мишеней HP1 и 61% мишеней SU(VAR)3-9 также являются мишенями белка SUUR (Pindyurin et al., 2007). Более того, при мутации SuUR изменяется картина связывания HP1 с хромосомами питающих клеток, а также связывание белка SU(VAR)3-9 в питающих клетках и слюнных железах (Koryakov et al., 2006; Koryakov et al., 2011). Также нарушается и соответствующее метилирование гистона H3 (H3K9me1/2/3) (Koryakov et al., 2011).
Наблюдаемый эффект, по-видимому, связан с физическим взаимодействием белков SUUR и HP1, которое было продемонстрированно в двугибридной дрожжевой системе (Pindyurin et al., 2008). Дополнительным свидетельством взаимодействия этих белков служит результат эксперимента, в котором с помощью GAL4-UAS системы (Brand, Perrimon, 1993) белок HP1 искусственно привлекали в несвойственный ему район хромосомы. В результате с этим районом также начинал связываться и белок SUUR (Pindyurin et al., 2008). При изучении связывания белка SUUR с хромосомами культуры клеток Кс, было установлено, что он колокализуется с одним из основных компонентов ядерной оболочки – белком LAM (Pindyurin et al., 2007). Как упоминалось ранее, близость хроматина к ядерной ламине также служит признаком неактивного хроматина.
Наиболее ярким свидетельством связи белка SUUR с репрессированным хроматином служит результат работы, посвященной разделению хроматина дрозофилы на пять принципиальных типов (Filion et al., 2010) (см. раздел 1.2.2. «Типы хроматина у D. melanogaster», страница 18). В этом исследовании были выделены три типа репрессированного хроматина, имеющих достаточно различный белковый состав. Однако для всех этих типов можно выделить общую черту – присутствие белка SUUR. Из 53 проанализированных белков, только для него наблюдается сильное связывание во всех неактивных типах и практически полное отсутствие в активных типах хроматина.
Итак, контроль экспрессии всех элементов генома осуществляется путем организации белкового состава хроматина, координации процесса репликации и особой пространственной организации хромосом в ядре. Очевидно, что эти процессы проходят по-разному в разных клетках организма, в зависимости от их функции.
Во многом регуляция транскрипции генов осуществляется путем формирования различных активных и неактивных типов хроматина, причем все неактивные типы хроматина, обнаруженные у дрозофилы, связаны с белком SUUR. В то же время, активный хроматин характеризуется отсутствием этого белка. Возникает вопрос, влияет ли белок SUUR на транскрипцию генов, расположенных в районах его связывания и каковы особенности таких районов. Представленная работа направлена на исследование этих вопросов путем изучения динамики связывания белка SUUR с хромосомами разных типов клеток и прослеживания сопутствующих изменений активности генов, а также состояний хроматина.
Генетическая трансформация дрозофилы
ДНК полученных конструкций была выделена при помощи набора Plasmid Midi Kit (QIAGEN) и трансформирована в геном линии дрозофил AttP18, содержащей сайт attP. Для этого мух сажали в контейнер, где они могли откладывать яйца в чашку Петри с агаровым кормом. Через 40 минут полученные яйца собирали кисточкой и отделяли от хориона при помощи клейкой ленты. Лишенные хориона яйца помещали на покровное стекло, давали подсохнуть 3-6 минут, после чего покрывали маслом Halocarbon 200 (Halocarbon). В такие яйца под микроскопом вводили раствор плазмидной ДНК концентрацией 500нг/мкл в область заднего полюса при помощи системы для трансформации дрозофилы, которая представляет собой микроманипулятор с закрепленным стеклянным капилляром, заостренным с одного конца и наполненным раствором плазмидной ДНК. Инъекция осуществляется за счет кратковременного повышения давления в капилляре при помощи специальной установки, подающей в капилляр порцию азота под давлением.
После инъекции стекла с яйцами помещали во влажную камеру, где им давали развиваться до стадии личинок, которых переносили на агаровый корм для дальнейшего развития. Выживших мух скрещивали с линией y, w (источник: фонд лаборатории). В потомстве этого скрещивания мух с успешно трансформированной конструкцией отбирали по экспрессии маркерного гена miniwhite в глазах.
Для получения мух, экспрессирующих химерный белок Dam-SUUR, либо Dam, полученную трансгенную линию скрещивали с линией, содержащей повсеместно экспрессирующуюся CRE-рекомбиназу (y[1]w[67c23]; sna[Sco]/CyO, P(w[+mC]=Crew) DH1, источник линии: Bloomington Stock Center). Это приводило к вырезанию терминатора транскрипции, окруженного сайтами loxP (Siegal, Hartl, 2000) и активации транскрипции Dam-содержащих белков. Вырезание терминатора не приводило к видимым изменениям в развитии мух, что может говорить о безопасно низком уровне экспрессии химерного белка Dam-SUUR, либо Dam. Низкий уровень экспрессии, также был подтвержден вестерн-блот анализом, при помощи которого белок Dam удавалось детектировать только при дополнительной активации (Maksimov et al., 2014).
Из самок двух полученных линий мух методом диссекции изолировали интересующие нас органы, либо собирали эмбрионов, из которых затем выделяли геномную ДНК. Для этих целей в пробирку собирали по 25 мозгов личинок, либо по 50 эмбрионов (12-14 часов после откладки), либо по 100 пар слюнных желез личинок.
Полученные биологические образцы гомогенизировали в 700 мкл лизирующего буфера (0.1М NaCl, 0.2M сахароза, 0.1M Tris HCl (pH=8.0), 0.05M EDTA, 0.5M SDS). Далее добавляли 10 мкл РНКазы I (100 мкг/мл) и инкубировали 30 минут при 370С. После этого добавляли раствор диспазы II (10 мкл, 100 мкг/мл, Roche) и проводили дополнительную инкубацию в течение как минимум 2 часов при 560С.
Очистку ДНК проводили методом фенол-хлороформной экстракции. Для этого к полученному раствору добавляли равный объем смеси фенола и хлороформа (1:1), активно перемешивали до образования равномерной эмульсии и центрифугировали при ускорении 13000g 5 минут. После этого из пробирки отбирали верхнюю водную фракцию, с которой повторяли процедуру экстракции до исчезновения нерастворимой интерфазы. К верхней фракции добавляли равный объем хлороформа, перемешивали и центрифугировали при 13000g 5 минут. Из пробирки отбирали верхнюю фракцию, к которой добавляли 1.5 объема изопропанола, перемешивали и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. После этого проводили центрифугирование при 13000g в течение 15 минут. Образовавшийся осадок промывали 1 мл 70% спирта, подсушивали на воздухе 5 минут и растворяли в 50 мкл деионизованной воды.
Полученную геномную ДНК обрабатывали согласно протоколам проведения процедуры DamID, описанным ранее, с некоторыми изменениями (Pollack et al., 1999; Greil et al., 2006). Так, 2.5мкг геномной ДНК подвергали гидролизу 20 единицами эндонуклеазы DpnI (NEB) в течение 2 часов в 50мкл конечного объема реакционной смеси. После этого образцы очищали при помощи набора QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN).
После очистки к 420 нг ДНК добавляли 1мкл двуцепочечных адаптеров, 2мкл буфера для ДНК лигазы T4 (SibEnsyme), 1мкл ДНК лигазы T4 (SibEnsyme) и деионизованную воду до 20 мкл конечного объема. Лигирование проводили при 160С в течение 2 часов.
Двуцепочечные адаптеры были созданы следующим образом: в равных объемах смешивали 100мМ олигонуклеотиды AdRt (5`-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGA-3`) и AdRb (5`CCTCGGCCG-3`). К ним добавляли 1/10 объема буфера для ДНК лигазы T4 (SibEnsyme), после чего полученную смесь нагревали до 980С и медленно охлаждали в амплификаторе (на 10С в 3 минуты) до 250С.
Районы недорепликации обогащены семенник-специфичными генами
В работе С.Н. Белякина с соавторами (Belyakin et al., 2005) было показано, что районы недорепликации обогащены генами, экспрессирующимися преимущественно у взрослых самцов D. melanogaster. Это наблюдение было сделано с использованием данных об экспрессии около 4000 генов, из которых всего 200 попадают в районы недорепликации.
Для получения более полных данных о специфике транскрипции в районах недорепликации был проведен анализ экспрессии большинства генов дрозофилы на разных этапах ее развития. Для получения этих данных были использованы олигонуклеотидные транскриптомные микрочипы, на которые гибридизовали кДНК, полученную из мух на разных стадиях развития: три эмбриональных стадии (0-1 часов, 5-6 часов, 11-12 часов после откладки), три личиночных стадии (первый, второй и третий личиночный возраст), стадия предкуколки, стадия куколки, взрослые самки и самцы.
Поскольку было обнаружено, что районы недорепликации обогащены короткими генами, изучение особенностей экспрессии было проведено в двух группах: среди генов короче 2 т.п.н. и генов длиннее 2 т.п.н. Оказалось, что районы недорепликации обогащены короткими генами, транскрипция которых в развитии начинается в метаморфозе и наиболее активна на стадии взрослых самцов, но не самок (достоверность по t-тесту p=8.8 10-15) (рис. 14, А). Ранее было показано, что такой паттерн экспрессии в самцах формируется за счет активности генов в развивающихся мужских гонадах (Arbeitman et al., 2002).
Чтобы проверить, действительно ли наблюдаемое повышение транскрипции этих генов в самцах вызвано усиленной экспрессией в семенниках, были использованы данные об интенсивности транскрипции в 13 различных тканях взрослых мух, полученные с использованием микрочипов другими исследователями (Chintapalli et al., 2007). Сравнение усредненных профилей экспрессии коротких генов в районах недорепликации и их флангах в 13 тканях подтвердило это предположение, позволив выявить значительное обогащение районов недорепликации генами, экспрессирующимися в семенниках взрослых мух (рис. 14, Б).
Недостатком использования усредненных профилей, представленных на рисунке 14, А-Б, является то, что они могут отображать смещенное значение общей транскрипции в случае наличия небольшой группы очень сильно экспрессирующихся генов. Чтобы проверить, не вызван ли наблюдаемый профиль экспрессии в семенниках присутствием таких генов, был проведен дополнительный анализ. Для этого, с использованием данных по экспрессии в тканях взрослых мух (Chintapalli et al., 2007), были выделены гены, экспрессирующиеся только в семенниках, а так же – в качестве контроля – гены, активные только в яичниках. Всего были идентифицированы 1653 семенник-специфичных гена и 907 яичник-специфичных генов (рис. 14, В).
Анализ распределения длин генов в этих группах показал, что подавляющее большинство семенник-специфичных генов не превышают 2 т.п.н. в длину (1235 из 1653) (рис. 14, В). При этом доля таких коротких семенник-специфичных генов в районах недорепликации значительно больше, чем в их фланкирующих участках: 41% в районах недорепликации и 17% во флангах. Напротив, доля коротких (менее 2 т.п.н.) яичник-специфичных генов в районах недорепликации оказалась очень мала – 3% против 8% во флангах (2 тест, P=3.0x10-17).
Таким образом, районы недорепликации в слюнных железах дрозофилы обеднены генами, причем значительную часть в этих районах составляют короткие семенник-специфичные гены, разделенные длинными межгенными интервалами. 75
Как упоминалось выше, действие SUUR является дозовозависимым. Это проявлялось в том, что при увеличении числа копий гена SuUR увеличивалось и число районов хромосом, проявляющих недорепликацию, а у гетерозигот по мутации SuUR проявление недорепликации снижалось (Belyaeva et al., 1998; Zhimulev et al., 2003a; Zhimulev et al., 2003b). Это означает, что в геноме дрозофилы могут присутствовать и другие районы, обладающие обнаруженными нами геномными характеристиками, но не представленные среди 51 района недорепликации. Мы решили проверить функциональность обнаруженных характеристик и предприняли попытку полногеномного поиска районов ДНК с похожими свойствами.
Для проведения такого анализа была создана компьютерная программа, которая производит поиск участков генома, где, наряду с низкой плотностью генов, наблюдается достоверное повышение доли длинных межгенных промежутков и семенник-специфичных генов по сравнению с флангами этих участков. С помощью этой программы были обнаружены 110 районов, обладающих указанными свойствами. Оказалось, что 41 из 51 экспериментально установленного района недорепликации пересекается с предсказанными участками хотя бы на 50% (рис. 15, А).
Выяснилось, что предсказанные районы достоверно проявляют признаки недорепликации в слюнных железах, хотя и в меньшей степени, чем 51 экспериментально установленный район (рис. 15, Б). В то же время, белок SUUR связывается с предсказанными районами практически так же сильно, как с 51 контрольным районом недорепликации (рис. 15, В). Этот результат позволяет предположить, что установленные нами свойства районов недорепликации – низкая плотность генов, длинные межгенные интервалы и обогащение семенник-специфичными генами – свойственны в первую очередь именно участкам хромосом, связанным с белком SUUR.
