Введение к работе
Актуальность темы
Регуляция семенник-специфичной генетической системы crystal-Stellate у Drosophila melanogaster является предметом активных исследований. Нарушение нормальной репрессии расположенных в Х-хромосоме тандемных кластеров семенник-специфичных генов Stellate сопровождается накоплением в сперматоцитах белковых кристаллов, дефектами конденсации и сегрегации мейотических хромосом, а также частичной либо полной стерильностью. Гены Stellate кодируют белок, гомологичный регуляторной р-субъединице протеинкиназы СК2 (СК2(3), однако у мух дикого типа не экспрессируются. Один из кластеров Stellate расположен в эухроматине (участок 12Е1-2 карты политенной Х-хромосомы), другой - в гетерохроматине (участок h27 митотической прометафазной карты Х-хромосомы). Функция этих генов неясна, однако протеинкиназа СК2 играет важную роль в регуляции транскрипции и клеточного деления у D.melanogaster и других эукариот.
Репрессия кластеров генов Stellate осуществляется при участии локуса crystal, или Su(Ste) (Supressor of Stellate), расположенного в Y-хромосоме D.melanogaster (участок hi 1 митотической прометафазной карты Y-хромосомы). Повторы Su(Ste) обладают высокой степенью гомологии с генами Stellate. В норме экспрессия генов Stellate подавлена при помощи коротких РНК, обеспечиваемых антисмысловой транскрипцией локуса Su(Ste), по механизму ріРНК-сайленсинга (Aravin et al., 2001; Vagin et al., 2006). В отсутствие Y-хромосомы транскрипты Stellate накапливаются, и в сперматоцитах появляется кодируемый ими белок, образующий кристаллические звездчатые или иглоподобные структуры (Hardy et al., 1984; Bozzetti et al., 1995). Удаление небольшого участка Y-хромосомы, содержащего значительную часть повторов Su(Ste), также приводит к сверхэкспрессии генов Stellate (самцы cry'). И у самцов, лишенных Y-хромосомы, и у самцов cry1 наблюдаются дефекты конденсации и сегрегации мейотического хроматина, что приводит к нарушению мейоза и, в конечном
итоге, к частичной или полной стерильности. Число копий гена Stellate варьирует у разных линий D.melanogaster от 15-50 копий (аллель Ste+) до 150-400 копий (аллель Ste). В присутствии аллеля Ste+ белковые кристаллы, образующиеся в семенниках самцов cry', имеют иглоподобную форму, мейотические дефекты незначительны, наблюдается неполная стерильность. В присутствии аллеля Ste в семенниках самцов cry1 накапливаются звездчатые кристаллы, а сильные мейотические дефекты приводят к полной стерильности. Причины возникновения и функциональный смысл существования системы Ste-Sa(Ste) до сих пор неясны. Повторы Stellate обнаружены только у D. melanogaster, у других видов Drosophila они отсутствуют. Считается, что эти повторы возникли в результате амплификации аутосомного гена CKlfites, кодирующего регуляторную р-субъединицу протеинкиназы СК2 (Kalmykova et al., 1997). Механизм патогенеза, вызываемого сверхэкспрессией Stellate, до сих пор не выяснен. В ходе данной работы была обнаружена растворимая форма белка Stellate, присутствующая в ядрах сперматоцитов D.melanogaster, лишенных локуса crystal, и выявлены некоторые его партнеры, а также установлено, что эндогенный Stellate подвергается посттрансляционной модификации - триметилированию по остатку лизина. Эта посттрансляционная модификация специфически узнается антителами к гистону НЗ, триметилированному по остатку лизина К9 (НЗК9теЗ), что свидетельствует о структурной мимикрии и возможности взаимодействия Stellate с хромодоменными белками. Полученные данные позволяют прояснить механизм патогенетического действия белка Stellate в семенниках D.melanogaster.
Цельи задачи работы
Целью работы являлась характеристика особенностей экспрессии и белок-белковых взаимодействий белка Stellate в семенниках D. melanogaster. Для этого были поставлены следующие задачи:
-
изучение субклеточной локализации белка Stellate;
-
поиск возможных белковых партнеров Stellate in vivo;
3. исследование посттрансляционной модификации Stellate.
Научная новизна работы
Для исследования субклеточной локализации и поиска партнеров белка Stellate были получены высокоспецифичные антитела к Stellate. Впервые показано, что Stellate присутствует в растворимой форме в нуклеоплазме сперматоцитов. Установлено, что растворимый ядерный Stellate взаимодействует с каталитической а-субъединицей протеинкиназы СК2 (СК2а) in vivo, а сверхэкспрессия генов Stellate в семенниках приводит к модуляциям фосфорилирования ядерных белков по остаткам серина. Показано, что при сверхэкспрессии кластеров генов Stellate выявляются белковые продукты как эухроматинового, так и гетерохроматинового кластеров Stellate.
В ходе работы установлено, что и растворимая, и кристаллическая формы эндогенного Stellate триметилированы по остатку лизина К92, причем эта посттрансляционная модификация структурно мимикрирует эпигенетическую модификацию гистона НЗ, триметилированного по остатку лизина К9 (НЗК9теЗ), с которой взаимодействует несущий хромодомен гетерохроматиновый белок НР1. Показано, что в метилировании белка Stellate принимает участие гистонметилтрансфераза dSETDBl. Это первый найденный случай триметилирования негистонового белка по остатку лизина у Drosophila.
Установлено, что Stellate обнаруживается в комплексе с гетерохроматиновым белком НР1, ответственным за формирование участков транскрипционно репрессированного гетерохроматина. Показано ассоциированное с фосфорилированием уменьшение электрофоретической подвижности НР1 в полиакриламидном геле на фоне сверхэкспресии генов Stellate, по сравнению с диким типом. Предложен механизм патогенетического действия Stellate в семенниках D.melanogaster.
Практическая значимость
Мутации, приводящие к нарушениям сперматогенеза, критически влияют на возможности воспроизводства и поддержания вида. Обнаружено
множество генетических локусов, повреждения которых приводят к
стерильности, однако механизмы патогенетического влияния таких мутаций в
большинстве своем неизвестны. Показано, что мутации по генам,
участвующим в сайленсинге с помощью коротких piPHK, - aubergine, spindle-
Е, armitage и др. (Aravin et al, 2001; Vagin et al, 2006) - приводят к
сверхэкспрессии генов Stellate и к соответствующим нарушениям
сперматогенеза. Регуляция системы генов crystal-Stellate является объектом
изучения многих исследователей, но причины патогенеза, вызываемого
сверхэкспрессией Stellate, до сих пор неизвестны. Результаты данной работы
позволили предложить модель патогенетического влияния сверхэкспрессии
Stellate на состояние прицентромерного гетерохроматина, выражающегося в
нарушениях когезии и сегрегации мейотических хромосом в сперматоцитах
D.melanogaster. Согласно предложенной модели, растворимый
триметилированный белок Stellate в ядрах сперматоцитов выполняет функцию
регуляторной Р -субъединицы протеинкиназы СК2, привлекая белок НР1 к
гетеротетрамерному комплексу СК.2 и способствуя его
гиперфосфорилированию. НР1 несет хромодомен, узнающий эпигенетическую модификацию НЗК9теЗ, и в норме является мишенью фосфорилирования, осуществляемого СК2, которое важно для связывания части ядерного пула НР1 с гетерохроматиновыми локусами, в том числе с прицентромерным. Избыток гиперфосфорилированного НР1, в свою очередь, может вызывать гиперконденсацию прицентромерного гетерохроматина, что может служить причиной мейотических нарушений и некорректного сперматогенеза.
Обнаруженная в ходе данной работы посттрансляционная модификация Stellate - триметилирование по остатку лизина К92 -специфически узнается антителами к НЗК9теЗ и представляет собой один из немногих известных на данный момент случаев структурной мимикрии in vivo.
Апробация работы
Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих научных симпозиумах и конференциях: на 16-м симпозиуме
FEBS/ESF, посвященном протеинкиназам, 'Dynamics of Cell Signal Systems' (Осло, Норвегия, 25-28 сентября 2008 г.); на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 23-27 июня 2009 г.); на протеомной школе-семинаре FEBS/EMBO 'Proteins and their Networks - from specific to global analysis' (о-в Спетсэ, Греция, 7-17 сентября 2009 г.); на Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, Россия, 28 сентября - 1 октября 2009 г.; 2-е место на конкурсе молодых ученых в рамках конференции).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 2 статьи в международных реферируемых журналах.
Материалы и методы
Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе:
В настоящей работы были использованы терминальные ткани взрослых самцов D.melanogaster следующих линий:
Df(l)w, yw67c23(2>; использована в качестве контрольной; в работе обозначена yw;
ywf/C(l)DX, yf/cry'Bs, Yy+; несет делецию локуса crystal в Y-хромосоме; в работе обозначена cry1;
yw67c23/cry'Bs, Yy*;+/+;P{pCaSpeR-6Ste-lacZJ; несет делецию локуса crystal в Y-хромосоме, а также содержит вставку Р-элемента с 6 тандемными копиями гена Stellate во 2-й хромосоме; в работе обозначена///-172-2 cry;
w; 10.1-1 a / СуО GFP; +/+; хромосома 10.1-1'аех несет делецию участка гена DmSetdbl, кодирующего 421-1261 а.о. гистонметилтрансферазы dSETDBl (Seum et al., 2007); в работе обозначена dSETDB 1+/-.
Обозначение crystal используется для обеих линий cry' и Ш-172-2 cry.
Молекулярно-биологические методы:
Субклеточное фракционирование, Вестерн-блот-анализ,
иммунопреципитацию, пептидный фингерпринт и гетерологичную экспрессию в E.coli проводили согласно опубликованным стандартным протоколам.
Структура и объем диссертации
Материал диссертации изложен на 102 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 7 таблиц. Список цитированной литературы состоит из 208 работ.
