Введение к работе
Актуальность проблемы
Помимо широко известных взаимодействий компонентов вирусов и вироидов с белками аппарата транскрипции и трансляции клетки, а также транспортных комплексов вирусов с элементами цитоскелета, появляются данные о вовлеченности новых, неизученных белков растения-хозяина в жизненный цикл патогенов. Роль таких взаимодействий на сегодняшний день не всегда понятна. Так, обнаружено, что подавление экспрессии гена VirPl в протопластах N.tabacum приводило к нарушению репликации вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) (Kalantidis et al., 2007). Кроме того, получены данные, свидетельствующие в пользу того, что белок VirP 1 необходим для системного распространения ВВКК и вироида экзокортиса цитрусовых (Kalantidis et al., 2007), тогда как функция этого белка в жизненном цикле растения по-прежнему неизвестна. Показано, что ключевую роль в дальнем транспорте умбравирусов и потивирусов играет взаимодействие белков ORF3 и VPg с фибрилларином. Снижение уровня экспрессии фибрилларина являлось причиной подавления накопления А вируса картофеля в системных листьях и невозможности дальнего транспорта вируса розеточности арахиса (Kim et al., 2007; Rajamaki and Valkonen, 2009). Несмотря на то, что многие функции фибрилларина в клетке изучены, роль его взаимодействия с компонентами вирусов является недостаточно понятной.
Таким образом, более детальное исследование факторов растения-хозяина, вовлеченных в осуществление отдельных стадий жизненного цикла патогенов, позволит приблизиться к пониманию устойчивости некоторых видов сельскохозяйственных культур к патогенам и в перспективе поможет в создании новых сортов растений резистентных к инфекционным агентам.
В двугибридной дрожжевой системе при скрининге кДНК библиотеки Arabidopsis thaliana против транспортного белка (NSm) вируса пятнистой гнилостности томатов был обнаружен белок с неизвестной функцией, названный At-4/1 (von Bargen et al.,2001). Ранее в нашей лаборатории в экспериментах по совместной экспрессии в клетках N. benthamiana At- 4/1 слитого в одной рамке трансляции с GFP и слитого с YFP третьего транспортного белка (ТБГ3) полулатентного вируса мятлика было показано, что оба белка локализуются в одних и тех же структурах. В нашей лаборатории была клонирована полная кодирующая последовательность белка ортолога At-4/1 из растений Nicotiana tabacum (Nt-4/1). В данной работе физико-химическими методами исследуется вторичная и третичная структуры белка Nt-4/1, анализируется его РНК-связывающая активность, а также тканеспецифичность экспрессии гена Nt-4/1.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было изучение структурных особенностей, РНК-связывающих свойств и профиля экспрессии гена Nt-4/1.
В ходе работы решались следующие основные задачи:
-
Исследование тканеспецифичности экспрессии гена Nt-4/1 в трансгенных растениях.
-
Анализ вторичной и третичной структуры полноразмерного белка и его мутантов с помощью метода кругового дихроизма и дифференциальной сканирующей калориметрии.
-
Изучение олигомеризации белка дикого типа и его делеционных мутантов с помощью динамического лазерного светорассеяния.
-
Визуализация олигомерных комплексов белка Nt-4/1 с помощью электронной микроскопии.
-
Изучение РНК-связывающих свойств белка Nt-4/1 и картирование участка, отвечающего за образование рибонуклеопротеидных комплексов.
Научная новизна и практическая ценность работы
В ходе выполнения данной работы с помощью физико-химических методов впервые была исследована вторичная и третичная структура белка. Было продемонстрировано, что белок Nt-4/1 является а-спиральным и состоит из трех доменов. Впервые было показано, что белок Nt-4/1 in vitro взаимодействует с разными РНК, предпочтительно связывая молекулы, содержащие шпилечные структуры и несовершенные дуплексы, но не образует комплексов с ДНК. Были получены делеционные и точечные мутанты белка Nt-4/1, позволившие локализовать сайт связывания с РНК, включающий область положительно заряженных аминокислот в С-терминальном домене белка. В ходе выполнения диссертационной работы были получены трансгенные растения, несущие ген Р-глюкуронидазы (gusA) под контролем промотора гена Nt-4/1. Гистохимическое окрашивание трансгенных растений позволило выяснить, в каких органах и тканях работает данный промотор.
Результаты диссертации могут быть использованы в научно-исследовательской работе, а также при чтении курсов лекций на биологических факультетах высших учебных заведений. Полученный материал может быть использован в дальнейших исследованиях распространения патогенов по растению и последующего получения растений, устойчивых к вирусной инфекции. Апробация работы
Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ имени М.В.Ломоносова. Результаты работы докладывались на семинарах кафедры вирусологии Биологического факультета и на международных конференциях: «Новые информационные технологии в медицине, фармакологии, биологии и экологии» 2011, 2012 (г. Ялта, Украина); 36th FEBS Congress «Biochemistry for Tomorrow's Medicine» (Torino, Italy) 2011; FEMS, 4th Congress of European Microbiologists (Geneva, Switzerland), 2011. Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из которых 2 статьи в международном реферируемом журнале и 4 тезиса международных конференций. Структура работы
Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на страницах, содержит рисунков и таблиц.
