Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение вирусных белков, определяющих патогенность и взаимодействие с хозяином, является важной задачей современной молекулярной вирусологии. Согласно данным последнего десятилетия, полученным с применением высокопроизводительных методов секвенирования нуклеиновых кислот, выделенных из материала различных образцов окружающей среды, разнообразие вирусов гораздо шире, чем предполагалось ранее (Roossinck et al., 2010; Roossinck, 2011a, c, d; Culley, 2011; Mokili et al., 2012). Значительная часть обнаруженных таким путем вирусов при инфекции не вызывает симптомов болезней или ухудшения состояния организма хозяина, а порой придает дополнительные свойства. Таким образом, восприятие вируса как объекта, приносящего исключительно вред, трансформируется, а вопрос изучения факторов, приводящих к появлению и усилению патогенности, становится еще актуальнее. Всестороннее изучение феномена «патогенности» создает потенциал, который можно будет использовать для предотвращения или уменьшения последствия вирусного заражения, повышая, таким образом, качество жизни человека, экологию, а также улучшая рентабельность сельскохозяйственных производств. Одним из основных направлений, несомненно, является изучение патогенности вирусов на молекулярном уровне.
Известно, что вирусы, помимо факторов, необходимых для репликации и сборки вириона, кодируют белки, которые для них не являются жизненно необходимыми. Между тем, данные белки могут значительно влиять на патогенность вируса (Yelina et al., 2005; Lukhovitskaya at al., 2005a, b; Lukhovitskaya at al., 2009). Известно, что некоторые из этих белков являются супрессорами посттранскрипционного умолкания генов (ПТУГ), тогда как функция других на сегодняшний день не вполне понятна. Одним из таких является белок ОРТ6 (открытая рамка трансляции 6) вируса табачной мозаики (ВТМ), рассматриваемый в настоящей работе. Ген этого белка перекрывается с открытыми рамками трансляции транспортного белка (ТБ) и белка оболочки (БО) и, предположительно, кодирует полипептид массой 4-5 кДа (Morozov et al., 1993). Похожие по размеру и последовательности ОРТ6 можно обнаружить у всех представителей субгруппы тобамовирусов 1а (Ikeda et al., 1993; Morozov et al., 1993). Ранее в нашей лаборатории было показано, что ОРТ6 вируса томатной мозаики (ВТоМ) штамма L (L- ОРТ6) способен к образованию стабильного комплекса с фактором элонгации трансляции eEF1A in vitro (Morozov et al., 1993; Fedorkin et al., 1995). Кроме того известно, что мутация гена ОРТ6 ВТМ штамма U1 (U1-ОРТ6) ведет к уменьшению патогенности ВТМ,
тогда как его экспрессия в составе геномов вируса погремковости табака (ВПТ) и Х - вируса картофеля (ХВК) усиливает патогенез этих вирусов (Canto et al., 2004). Несмотря на то, что Ь-ОРТ6 и Ш-ОРТ6 занимают похожие позиции в геномах родственных вирусов, а также имеют умеренно сходные аминокислотные последовательности (Morozov et al., 1993), на сегодняшний день неясно, насколько сходные свойства они проявляют in vivo и каковы их функции. Цель и задачи исследования:
Целью данной работы является сравнительный анализ малых неструктурных белков Ь-ОРТ6 и Ш-ОРТ6. Для достижения поставленной цели решались следующие основные научные задачи:
-
Изучение способности данных белков определять характер вирусной инфекции. Создание конструкций на основе инфекционных копий ВТоМ и ВПТ, экспрессирующих различные варианты ОРТ6. Изучение симптомов, вызываемых созданными вариантами вирусов на различных растениях-хозяевах.
-
Картирование детерминанты патогенности в составе последовательности L- и Ш-ОРТ6 с использованием точечного мутагенеза и гибридных последовательностей, содержащих N- и C-конец от разных ОРТ6.
-
Изучение внутриклеточной локализации белков L- и U1-ОРТ6 в клетках эпидермиса листа N. benthamiana с использованием метода временной экспрессии ОРТ6 в одной рамке трансляции с GFP.
-
Поиск последовательностей, ответственных за внутриклеточную локализацию L- и U1- ОРТ6, с использованием точечного мутагенеза и гибридных последовательностей, содержащих N- и C-конец от разных ОРТ6.
-
Исследование взаимодействия между L-ОРТ6 и eEF1A in vitro.
-
Изучение способности связывания нуклеиновых кислот белком L-ОРТ6 in vitro. Научная новизна и практическая ценность работы
В работе впервые проведена сравнительная характеристика белков L- и Ш-ОРТ6. Во-первых, показано, что белок L-ОРТ6, в отличие от белка Ш-ОРТ6, не усиливает патогенез ВТоМ. Во-вторых, L-ОРТ6, экспрессированый в составе вируса погремковости табака (ВПТ), лишь слегка усиливает патогенность вируса, тогда как U1 -ОРТ6 вызывает некроз стебля и гибель растения. С использованием точечных мутантов, а также гибридных вариантов последовательности ОРТ6 с N-и C-концами от L- или Ш-ОРТ6, определены детерминанты патогенности обоих белков в С-концевом районе. В-третьих, изучена субклеточная локализация белков, которая, как оказалось, также является различной. Белок Ш-ОРТ6 первоначально обнаруживается в ядрышке и ядре, но в
дальнейшем перемещается в митохондрии, тогда как L-ОРТб находится в ассоциации с мембранами эндоплазматического ретикулума (ЭПР) все время наблюдения. В работе проведено картирование последовательностей, ответственных за различия во внутриклеточной локализации этих белков.
В работе впервые представлены эксперименты по связыванию белком L-ОРТ6 нуклеиновых кислот. Показано, что мутация Ile> 11 >Thr в составе аминокислотной последовательности L-ОРТ6, блокирующая образование комплекса с фактором элонгации трансляции eEF1A, нарушает также кооперативность связывания белка с нуклеиновыми кислотами.
Результаты данной работы могут быть использованы в практике научных исследований в области вирусологии и молекулярной биологии, а также при чтении курсов лекций по вирусологии на биологических факультетах. Апробация работы
Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико- химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова. Результаты работы были доложены на семинарах кафедры вирусологии, на международных конференциях: «Информационные технологии в медицине, биологии и экологии» 2010, 2011, 2012 гг. (г. Ялта, Украина), а также на ежегодной конференции для аспирантов института Джеймса Хаттона 2011 г. (г. Данди, Шотландия). Публикации
По материалам диссертации опубликованы 6 печатных работ. Из них статьей в реферируемых журналах - 2, материалов международных конференций - 4. Структура работы
Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы».
Диссертация изложена на страницах, содержит рисунок и включает
следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список цитируемой литературы» ( цитируемая работа).
