Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1 Система ядерно-цитоплазматического транспорта 9
2.1.1 Компоненты ядерной оболочки 10
2.1.2 Активный ядерно-цитоплазматический транспорт 13
2.1.3 Регуляция ядерно-цитоплазматического транспорта .' 19
2.1.4 Динамика ядерной оболочки в клеточном цикле 21
2.1.5 Ядерно-цитоплазматический транспорт и апоптоз 24
2.2 Ядерно-цитоплазматический транспорт при вирусных инфекциях 25
2.2.1 Преодоление барьера ядерной оболочки вирусами 25
2.2.2 Взаимодействие цитоплазматических вирусов с системой транспорта 27
2.3 Влияние пикорнавирусов на ядерно цитоплазматический транспорт 28
2.3.1 Краткая характеристика семейства Picornaviridae 28
2.3.2 Некоторые аспекты взаимодействия пикорнавирусов с клеткой 34
2.3.3 Нарушение ядерно-цитоплазматического обмена при инфекции некоторыми пикорнавирусами 37
3. Постановка задачи 1 44
4. Материалы и методы 45
4.1 Методы работы с культурами эукариотических клеток 45
4.1.1 Клеточные линии '. 45
4.1.2 Культивирование клеток 45
4.2 Методы работы с нуклеиновыми кислотами 45
4.2.1 Плазмиды 45
4.2.2 Создание конструкции pE-luc-AL и методы молекулярного клонирования 46
4.3 Методы работы с вирусами и вирусными конструкциями 52
4.3.1 Штаммы вирусов 52
4.3.2 Размножение вирусов 53
4.3.3 Определение титра вирусной суспензии 53
4.3.4 Заражение монослоя клеток вирусами 54
4.3.5 Получение рекомбинантных вирусов 55
4.3.6 Выделение вирионной РНК 57
4.4 Экспериментальные подходы для изучения ядерно-цитоплазматического обмена и проницаемости ядерной оболочки 58
4.4.1 Изучение локализации флуоресцентных маркёров 58
4.4.2 Изучение проницаемости ЯО препарата ядер 60
4.5 Изучение фосфорилирования белков ядерной поры 64
4.6 Анализ белкового состава ядерных пор методом иммунофлуоресценции 68
4.7 Исследование ядерных пор методом электронной микроскопии 69
5. Результаты 70
5.1 Изучение влияния кардиовирусной инфекции на ядерно-цитоплазматический транспорт 70
5.1.1 Релокализация ядерных белков в цитоплазму 70
5.1.2 Причины накопления ядерных белков в цитоплазме 71
5.1.3 Релокализация цитоплазматических белков в ядро 74
5.2 Поиск вирусных продуктов, отвечающих за нарушения транспорта 75
5.2.1 Нарушение барьерных свойств ядерной оболочки, индуцированное экстрактом заражённых клеток 75
5.2.1 Роль кардиовирусных белков в нарушении транспорта 77
5.2.2 Роль доменов лидерного белка в нарушении транспорта 79
5.3 Поиск ферментативных активностей, участвующих в нарушении транспорта 83
5.3.1 Роль протеаз в нарушении транспорта 84
5.3.2 Роль протеинкиназ и фосфатаз в нарушении транспорта 85
5.4 Изучение модификаций компонентов транспортной системы 87
5.4.1 Фосфорилирование белков ядерных пор 87
5.4.2 Исследование взаимосвязи между нарушением транспорта и гиперфосфорилированием Nup62 91
5.5 Влияние кардиовирусной инфекции на состав и архитектуру ядерных пор 94
5.5.1 Анализ набора FG-содержащих нуклеопоринов в ядерных порах 94
5.5.2 Электронная микроскопия ядерных пор 96
5.6 Изучение изменения проницаемости ядерной оболочки в митозе 99
5.6.1 Анализ белкового состава ядерных пор на ранних стадиях митоза 99
5.6.2 Митотического фосфорилирование нуклеопорина Nup62 101
6. Обсуждение 104
6.1 Нарушение барьерных свойств ядерной оболочки кардиовирусами 104
6.2 Ключевая роль лидерного белка кардиовирусов в нарушении транспорта 106
6.3 Участие клеточных протеинкиназ в нарушении транспорта 108
6.4 Фосфорилирование нуклеопоринов — предполагаемый механизм нарушения барьерных свойств ядерной оболочки кардиовирусами 109
6.5 Сохранение состава и общей архитектуры ядерных пор при инфекции 114
6.6 Сходство между нарушением барьерных свойств ядерной оболочки при кардиовирусной инфекции и на ранних стадиях митоза 117
6.7 Механизм изменения проницаемости ядерной оболочки при кардиовирусной инфекции (гипотеза) 119
7. Выводы 121
8. Благодарности 122
9. Список литературы
- Активный ядерно-цитоплазматический транспорт
- Методы работы с нуклеиновыми кислотами
- Причины накопления ядерных белков в цитоплазме
- Участие клеточных протеинкиназ в нарушении транспорта
Введение к работе
Взаимодействие вирусов с клеткой - одна из наиболее увлекательных проблем вирусологии. Вирусы являются доклеточньши формами жизни, которые используют клеточные энергетические ресурсы для репликации собственной нуклеиновой кислоты. Кодируя ограниченный набор генов, вирусы выработали изощрённые стратегии для поражения клеток и ловко подстраивают функционирование клеточных систем для собственных нужд. Клетки-хозяева, в свою очередь, приобрели противовирусные программы, призванные уничтожать чужеродную нуклеиновую кислоту и защищать клетку от вторжения патогенов. Борьба «вирус-клетка» длится со времён обособления данных форм жизни и обеспечивает их ко-эволюцию; следить за развитием этой борьбы -интригующая и зачастую жизненно-важная для всего человечества задача учёных-вирусологов.
Настоящая работа посвящена одному из аспектов взаимодействия с клеткой
цитоплазматических РНК-содержащих вирусов семейства Picornaviridae, а именно
нарушению ядерно-цитоплазматического транспорта при инфекции. Система транспорта
обеспечивает обмен макромолекул между ядром и цитоплазмой через белковые
комплексы ядерных пор, пронизывающие ядерную оболочку. Цикл репродукции
пикорнавирусов протекает в цитоплазме, и, на первый взгляд, данная группа вирусов не
нуждается во взаимодействии с клеточной системой транспорта. Около 10 лет назад было
сделано открытие, показавшее, что полиовирус (наиболее хорошо изученный и печально
известный представитель семейства) нарушает обмен макромолекул между ядром и
цитоплазмой (Belov et al., 2000). За последние годы исследователи значительно
продвинулись в понимании механизмов нарушения транспорта полиовирусом: ключевую
роль играет вирусная протеаза 2А, которая расщепляет белки ядерной поры и, тем самым,
нарушает барьерные свойства ядерной оболочки (Gustin and Sarnow, 2001; Belov et al..
2004; Park et al., 2008). Тем не менее, на многие вопросы до сих пор нет ответа. Например,
каково биологическое значение нарушения ядерного транспорта для пикорнавирусов? Является ли взаимодействие с транспортной системой абсолютно необходимым или предпочтительным условием репликации полиовируса? Уникально ли данное свойство для полиовируса или консервативно для всех представителей семейства?
В поисках ответов на некоторые из этих вопросов, в настоящей диссертационной работе нами было продолжено исследование влияния Picomaviridae на клеточный транспорт. В качестве объекта исследований мы выбрали группу Cardiovirus, у представителей которой белок 2А лишён протеолитической активности, чем данная группа и представляла для нас особый интерес. Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из обзора литературы, экспериментальной части, а также списка литературы. В разделе 2.1 обзора литературы кратко сформулированы современные представления о механизмах функционирования и регуляции ядерно-цитоплазматического обмена. В следующем разделе (2.2) приведены примеры разносторонних взаимодействий ряда вирусов с системой ядерно-цитоплазматического транспорта. В разделе 2.3 изложена краткая характеристика семейства Picomaviridae, особое внимание уделено известным данным о нарушении клеточного транспорта при инфекции некоторыми пикорнавирусами. Экспериментальная часть состоит из разделов «Материалы и методы», «Результаты» и «Обсуждение» и включает описание основных результатов, полученных в данной диссертационной работе, а также их интерпретацию.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Активный ядерно-цитоплазматический транспорт
Для доставки в назначенный компартмснт большинство макромолекул в клетке подвергаются активному ядерно-цитоплазматическому транспорту через ЯО (рис.1).
Как известно, биосинтез белка происходит в цитоплазме, однако многие белки осуществляют свои функции в ядре: гистоны, компоненты репликативных систем, 13 , многочисленные транскрипционные факторы и многие др. Такие белки активно доставляются в ядро системой ядерно-цитоплазматического транспорта. Некоторые цитоплазматические белки также импортируются в ядро: например, рибосомальные белки после синтеза в цитоплазме транспортируются в ядро, где взаимодействуют с рРНК, и в виде 40S и 60S рибосомальных субъединиц возвращаются в цитоплазму для образования функциональных рибосом. Некоторые белки осуществляют свои функции попеременно в ядре и цитоплазме и вынуждены курсировать между этими компартментами.
Все классы РНК синтезируется в ядре, там же проходят стадии созревания, после чего активно транспортируются в цитоплазму в виде РНК-белковых комплексов или рибонуклеопротегідов (РНП). Цитоплазма является конечным компартментом для подавляющего большинства клеточной РНК (мРНК, рРНК, тРНК, микроРНК). Малая ядерная РНК (мяРНК) проделывает более сложный путь: сразу после транскрипции мяРНК экспортируется в цитоплазму, где претерпевает дополнительные модификации, и только после этого транспортируется обратно в ядро, где принимает участие в сплайсинге мРНК (Kohler and Hurt, 2007).
Для активного ядерно-цитоплазматического транспорта необходимы: (і) интзктная ЯО и функциональные ЯП, (И) сигнальные последовательности в транспортируемом субстрате, (Ш) транспортные факторы, (iv) градиент Ran GTP/GDP между ядром и цитоплазмой.
Упрощённую схему активного транспорта можно представить следующим образом (рис.3). Субстрат, предназначенный для транспорта (далее будет называться груз), обладает сигнальной последовательностью для ядерной (NLS) или цитоплазматической (NES) локализации. Такая последовательность специфически узнаётся растворимыми транспортными рецепторами, которые по своим функциям делятся на импортирующие в ядро (импортины) или экспортирующие в цитоплазму (экспортины). В результате взаимодействия рецептора с грузом образуется комплекс груз/рецептор (рисЗо ) Транспортные рецепторы взаимодействуют с FG-доменами нуклеопоринов, что обеспечивает сначала заякоривание комплекса на периферических структурах ЯП (рис.3б,б ), а затем его транслокацию через центральный транспортный канал (рис.Зв, ).
В акцепторном компартменте груз диссоциирует из комплекса (рис.3 ?, ?), а рецептор Стадии импорта: (а) образование комплекса груз/импортин в цитоплазме; (б) заякоривание и (в) транслокация комплекса; (і) высвобождение груза в ядре в присутствии Ran-GTP; (д) возвращение комплекса импортин/Ran-GTP в цитоплазму, где при участии фактора GAP гидролизуется GTP и транспортный рецептор регенерируется. Стадии экспорта: (а ) образование тройного комплекса экспортин/груз/Ran-GTP в ядре; (б ) заякоривание и (в ) транслокация комплекса; (г ) гидролиз GTP при участии фактора GAft высвобождение груза в цитоплазме; (д ) возвращение экспортина в ядро. Поддержание концентрации Ran-GTP в ядре: (е) цитоплазматический Ran-GDP импортируется в ядро в комплексе с фактором NTF2 (wuclearjfansport /Sctor 2); (ж) в ядре ООРзамещается на GTP в активном центре Ran при участии фактора GEF; Ran-GTP высвобождается из комплекса с NTF2. возвращается в исходный компартмент (рис.3д,д ) и обеспечивает транспорт следующей молекулы груза.
Энергетика транспорта
В подавляющем большинстве случаев связывание/высвобождение груза из комплекса с рецептором регулируется нуклеотид-связанньгаи формами GTPa3bi Ran, которые асимметрично распределены между ядром и цитоплазмой (Gorlich et al., 2003). В цитоплазме Ran преобладает в GDP-связанной форме благодаря цитоплазматическому кофактору GAP ( TPase-activating grotein), который стимулирует ОТРазную функцию Ran (рис.3д,г ). Ядерный кофактор GEF (guanine nucleotide exchange_ Sctor) способствует обмену GDP на GTP в активном центре Ran и обеспечивает преобладание в ядре Ran GTP (рис.Злг).
Связывание RanGTP по-разному влияет на сродство транспортных рецепторов к грузу (рис.3). Экспортины обладают наибольшим сродством к грузу в присутствии Ran-GTP, в результате в ядре образуется тройной комплекс экспортпн/груз/ Ran-GTP (рис.Зп )- В цитоплазме после гидролиза GTP взаимодействие рецептора с грузом ослабевает, и последний высвобождается из комплекса (рис.З ). Импортины, напротив, образуют комплекс с грузом в цитоплазме в отсутствии Ran-GTP (рис.За); в ядре импортин cBA3biBaeTRan GTP, что ослабляет его сродство к грузу (рис.Зг).
Как видно из рис.3, каждое транспортное событие сопровождается гидролизом одной молекулы GTP (за некоторым исключением, см. ниже), что обеспечивает направленность и необратимость транспорта.
Методы работы с нуклеиновыми кислотами
Аналогичные исследования по изучению влияния энтеровирусной инфекции на ЯЦТ были проведены другой группой авторов. Gustin and Sarnow также установили, что при инфекции полиовирусом (2001) и риновирусом 14 (2002) ядерный белок EGFP-NLS накапливается в цитоплазме клеток, причет транслокация белка в цитоплазму не связана с его частичной деградацией и/или потерей NLS. На основе этих данных авторы сделали і вывод о нарушении классического NLS-зависимого пути импорта белков в ядра при инфекции. Авторы также обнаружили через 4.5 ч п.и. релокализацию в цитоплазму белков семейства hnRNP, а именно hnRNP Al и hnRNP К, что позволило заключить о нарушении также альтернативных (М9- и KNS зависимых) импортных путей. Gustin and Sarnow (2001) подтвердили ингибирование ядерного импорта при полиовирусной инфекции in vitro на препарате ядер. Причём, было показано, что вирусом подавляются ранние стадии транслокации груза в ядро, а именно стадия заякоривания транспортного комплекса на компонентах ЯП.
Однако не все пути активного транспорта нарушались при энтеровирусной инфекции: экспортин!-зависимый транспорт, а также пути импорта SR-белков и глюкокортикоидных рецепторов оставались функциональными (Gustin and Sarnow, 2001). Деградация белков ядерной поры энтеровирусной протеазой 2А Учитывая, что при энтеровирусной инфекции нарушается стадия заякоривания транспортного комплекса на ЯП, Gustin и коллеги предположили нарушение структуры ЯП. Методом Вестерн-блоттинга с использованием специфичных к нуклеопоринам антител, было показано, что уже через 0,5-1 ч п.и. количество нуклеопорина ядерных і филаментов Nup98 сокращается более, чем на 50%; к 2 ч п.и. в клетке остаётся лишь 10% Nup98, а через 3 ч п.и данный белок практически не детектируется (Park et al., 2008). Два других компонента ЯП также подвергаются деградации при инфекции, однако в замедленной динамике: через 4-5 ч п.и. заметно сокращается количество белка транспортного канала Nup62 и ядерных филаментов Nupl53 (Gustin and Sarnow, 2001; 2002). Продукты деградации нуклеопоринов при энтеровирусной инфекции уникальны и отличаются от деградации в апоптозе (Gustin and Saraow, 2002; Park et al., 2008). ЭМ подтверждает полное разрушение основных структур ЯП при инфекции (Belov et al., 2004).
Белов и коллеги (2004) предприняли попытку идентифицировать вирусный белок, отвечающий за нарушения транспорта при энтеровирусной инфекции. Методом ингибиторного анализа в опытах in vitro были получены указания на участие вирусной протеазы 2А: ингибиторы протеаз МРСМК, эластатинал, антипаин, химостатин, zVAD(OMe).fmk, подавляющие протеолитическую активность 2А полиовируса (Molla et al., 1993; Deszcz et al., 2004), эффективно предотвращали нарушение барьерных свойств ЯО, индуцированное экстрактами инфицированных клеток. Ключевая роль 2А в нарушении ядерно-цитоплазматического транспорта при энтеровирусной инфекции также была подтверждена с помощью конструкции, экспрессирующей вирусную протеазу дикого типа или с мутацией активного сайта (Belov et al., 2004). Предположительно, протеаза 2А непосредственно осуществляет деградацию белков ЯП при энтеровирусной инфекции.
Механизм нарушения ядерно-цитоппазматического транспорта эптеровпрусами
На основе вышеописанных результатов был сформулирован следующий механизм нарушения ЯЦТ пикорнавирусами (рис.6). При инфекции некоторыми энтеровирусами (полиовирусом, риновирусом 14, вирусом коксаки ВЗ) вирус-специфическая протеаза 2А расщепляет белки ЯП (Nup62, Nup98, Nupl53), что приводит к разрушению основных структур комплекса поры. Как следствие, подавляется активный транспорт грузов через ЯО и повышается её проницаемости для пассивной диффузии макромолекул. В результате некоторые клеточные NLS- и NES-содержащие белки перераспределяются между ядром и цитоплазмой по градиенту концентрации.
Биологическое значение нарушения ЯЦТ для энтеровирусной инфекции Значение нарушения ЯЦТ для энтеровирусной инфекции до конца не понятно, однако многочисленные спекуляции на этот счёт имеются.
Во-первых, нарушение ЯЦТ способствует релокализации ядерных белков в цитоплазму, где они принимают участие в трансляции и репликации вирусных РНК. Например, аутоантиген La специфически связывается с участком 5 НТО РНК полиовируса и, по-видимому, увеличивает эффективность инициации трансляции вирусной мРНК, уменьшая количество абберантных продуктов (Meerovitch et al., 1993;
Svitkin et al., 1994). Белок PTB увеличивает эффективность трансляции РНК полиовируса (Hellen et al., 1993); расщепление РТВ протеазой ЗС, возможно, регулирует переключение с трансляции на репликацию вирусных РНК (Back et al., 2002). Для ядерного фактора Sam68 было показано взаимодействие с вирусной РНК-зависимой
РНК-полимеразой (McBride et al., , 1996); белок ядрышка нуклеолин и hnRNP С связываются с З НТО вирусной РНК (Waggoner and Sarnow, 1998; Brunner et al., 2005).
Во-вторых, вирусные протеазы ЗС и 2А осуществляют свои функции в ядрах инфицированных клеток; повышение проницаемости ЯО облегчает попадание вирусных белков и/или их предшественников в ядерный компартмент (Sharma et al., 2004).
В-третьих, нарушение активного транспорта подавляет общую передачу сигналов в ядро и предотвращает запуск защитных программ клетки. Было показано, что нуклеопорин Nup98, участвующий в экспорте РНК из ядра (Powers et al., 1997), является интерферон-респонсивным белком (Enninga et al., 2002). Расщепление Nup98 на ранних стадиях энтеровирусной инфекции (0,5-1 ч п.и.), по-видимому, подавляет экспорт из ядер мРНК, необходимых для развития эффективного противовирусного ответа клетки.
Является ли нарушение ЯЦТ критическим условием для репликации энтеровирусов или лишь повышает эффективность размножения ещё предстоит выяснить. Также не известно, является ли взаимодействие с системой транспорта уникальным свойством энтеровирусов, или другие группы пикорнавирусов оказывают схожее влияние на ЯЦТ. Ответы на эти вопросы расширят наше понимание сложных взаимоотношений патогена с хозяином.
Причины накопления ядерных белков в цитоплазме
Существует несколько возможных механизмов изменения локализации ядерных белков. Во-первых, релокализация ядерного белка в цитоплазму может быть связана с частичной деградацией белка и/или утратой последовательности NLS, как это было показано для аутоантигена La (Shiroki et al., 1999). Во-вторых, подавление активного импорта в ядро приводит к накоплению новосинтезированных NLS-содержащих молекул в цитоплазме. В-третьих, нарушение барьерных свойств ЯО способствует диффузии ядерных белков в цитоплазму по градиенту концентрации. Мы проверили, какой из возможных механизмов реализуется при кардиовирусной инфекции.
Отщепление последовательности JVZS
Методом Вестерн-блоттинга с использованием антител к GFP мы показали, что 3 EGFP-NLS не подвергается деградации и сохраняет интактность даже на поздних стадиях кардиовирусной инфекции (рис.8Б). Следовательно, цитоплазматическая локализация 3 EGFP-NLS не связана с потерей последовательности NLS.
Происхождение tfiimoплазматической фракции JVZS-содерокащих белков
Происхождение цитоплазматической фракции NLS-содержащих белков можно установить с помощью флуоресцентного белка Timer-NLS. Спектр флуоресценции данного белка меняется со временем от ярко-зелёной (0-3 ч после синтеза), затем желто-оранжевой (10-18 ч) и в конечном итоге до красной флуоресценции ( 50 ч). Жёлто-оранжевая флуоресценция складывается из флуоресценции «молодых» (зелёных) и «старых» (красных) форм белка (Terskikh et al., 2000). С помощью Timer-NLS можно ответить на вопрос, происходит ли при кардиовирусной инфекции накопление новосинтезированных NLS-содержащих молекул или цитоплазматическая фракция ядерных белков представляет собой ядерный материал, вышедший в цитоплазму.
Клетки HeLa трансфицировали плазмидой, экспрессирующей Timer-NLS. Как видно на рис.9, через 18 ч п.т. в ядрах контрольных клеток находится преимущественно «молодой» белок, через 120 ч п.т. в ядрах наблюдается флуоресценция жёлтого цвета. Заражение таких клеток кардиовирусами приводит к перераспределению Timer-NLS между ядром и цитоплазмой (рис.9), как это наблюдалось ранее для 3xEGFP-NLS (рис.8А). Согласно модели подавления импорта, следовало бы ожидать, что цитошіазматическая флуоресценция будет всегда иметь зелёный цвет, что соответствовало бы накоплению новосинтезированных молекул Timer-NLS. Однако цвет флуоресценции цитоплазмы указывает на накопление как «молодых», так и «старых» форм белка и всегда совпадает с цветом ядерной флуоресценции. Следовательно, если в инфицированных клетках и происходит подавление активного транспорта в ядро, то данный механизм не вносит существенный вклад в накопление NLS-содержащих белков в цитоплазме. Вероятнее всего, цитоплазматический Timer-NLS преимущественно представляет собой фракцию белка, которая находилась в ядрах клеток до инфекции и подверглась перераспределению после инфекции.
Повышение проницаемости ядерной оболочки Мы предположили, что выход маркерного белка из ядер происходит вследствие повышения проницаемости ЯО для пассивной диффузии и изучили, теряет ли ЯО свои барьерные свойства при кардиовирусной инфекции. Для этого контрольные и инфицированные клетки HeLa-ЗЕ обрабатывали детергентом (дигитонином), который пермеабилизует плазматическую мембрану, при этом ЯО сохраняет свои барьерные свойства (Adam et al., 1990). Действительно, контрольные пермеабилизованные клетки HeLa-ЗЕ сохраняют флуоресценцию в значительном проценте ядер (рис.10). Ядра инфицированных клеток не удерживают маркерный белок 3 EGFP-NLS, и он растворяется в окружающем буфере до недетектируемых концентраций (рис.10). Потеря ядерной флуоресценции происходит в отсутствии экзогенного источника энергии и, следовательно, вызвана пассивной диффузией маркерного белка по градиенту концентрации, а не активным экспортом в цитоплазму. Можно заключить, что кардиовирусы нарушают барьерные свойства ЯО при инфекции, что и является причиной изменения локализации ядерных белков. 5.1.3 Релокализация цитоплазматических белков в ядро
Повышение проницаемости ЯО при кардиовирусной инфекции должно также приводить к диффузии цитоплазматических белков в ядро. Распределение цитоплазматических белков в инфицированных клетках мы изучили на примере маркерного белка циклин B1-EGFP. В контрольных клетках HeLa, экспрессирующих циклин B1-EGFP, преимущественно наблюдается цитоплазматическая флуоресценция (рис.11). После заражения кардиовирусами маркерный белок обнаруживается также в ядрах. Релокализация цитоплазматического белка в ядра инфицированных клеток является дополнительным свидетельством нарушения ядерно-цитоплазматического обмена.
Из вышеописанных опытов следует, что кардиовирусы вызывают изменения ЯЦТ, сходные с наблюдаемыми при энтеровирусной инфекции (Belov et al., 2000; 2004; Gustin and Saraow, 2001): инфекция сопровождается повышением проницаемости ЯО, в результате чего ядерные белки диффундируют в цитоплазму, а цитоплазматические - в ядра.
Участие клеточных протеинкиназ в нарушении транспорта
Мы изучили роль кардиовирусных белков с помощью репликонов на основе генома ВЭМК (Aminev et al., 2003а) с делециями в области генов-кандидатов и установили ключевое значение лидерного или L-белка (рис.13), закодированного на N-конце генома (Kazachkov et al., 1982). Данное открытие было неожиданным, ведь в случае полиовируса центральное значение отводится вирусной протеазе 2А, а кардиовирусный L-белок лишён энзиматической активности и имеет длину всего 67 аминокислот (у ВЭМК и менговируса).
L-белок кардиовирусов не гомологичен лидерным белкам других представителей Picomaviridae (рис.5). В строении L-белка ВЭМК выделяют N-концевой неканонический (СНСС) домен Zn-пальца, образованный остатками CyslO, His 12, Cysl9 и Cys22 (Chen et al., 1995; Cornilescu et al., 2008). В С-концевом кислом домене находится сайт фосфорилирования казеин-киназы 2 (Thr47) (Zoll et al., 2002), а также потенциальный сайт фосфорилирования по Tyr41 (Dvorak et al., 2001).
Мы изучили роль домена Zn-пальца и сайта фосфорилирования (Thr47) L-белка для нарушения ядерно-цитоплазматического транспорта. Наши данные свидетельствуют, что оба функциональных домена необходимы для нарушения транспорта кардиовирусами (рис.15). Конкретный механизм действия L-белка неизвестен, но можно предположить, что мотив Zn-пальца необходим для взаимодействия белка с неидентифицированным субстратом, в то время как фосфорилирование по Thr47 может влиять на сродство L-белка к данному субстрату.
Независимые исследования других групп авторов подтверждают ключевую роль L-белка для нарушения транспорта при кардиовирусной инфекции (Delhaye et al., 2004; Paul and Michiel?2006; Porter et al., 2006). Показано, что при индивидуальной экспрессии L-белка ВЭМК в клетках HeLa подавляется экспорт мРНК из ядер (Porter et al., 2006); для этого необходим интактный домен Zn-пальца. L-белок вируса Тейлера (76 аминокислот) обладает всего 35% сходством с L-белками ВЭМК и менговируса, выполняет схожую функцию и отвечает за перераспределение ядерных и цитоплазматических белков в инфицированных клетках (Delhaye et al., 2004). Авторами также установлена значимость консервативного мотива Zn-пальца в L-белке этого вируса.
Помимо установленного нами участия в нарушении ЯЦТ, L-белок выполняет ряд других функций при репродукции кардиовирусов. Есть данные об участии L-белка в і подавлении клеточного синтеза белков (Zoll et al., 1996), а также в регуляции трансляции вирусной РНК (Chen et al., 1995; Hoffman and Palmenberg, 1996; Dvorak et al., 2001). Высказывается гипотеза, что L-белок кардиовирусов имеет адаптивную функцию для увеличения жизнеспособности вирусов в различных линиях клеток (Paul and Michiels, 2006). L-белок подавляет продукцию интерферонов типа I, и следовательно, предотвращает развитие противовирусного ответа клетки (van Pesch et al., 2001; Hato et al., 2007). Совсем недавно появились свидетельства об анти-апоптозном действии L-белка (Romanova et al., 2009). Каким образом такой маленький белок выполняет столь разнообразные функции - остаётся загадкой, решив которую, можно было бы лучше понять взаимосвязь различных клеточных процессов.
Учитывая, что L-белок лишён ферментативной активности, мы предположили, что кардиовирусы привлекают вирусные и/или клеточные ферменты для нарушения транспорта. Действительно, известны классы ферментов, регулирующих/нарушающих ядерно-цитоплазматический обмен в клетке. Например, пост-трансляционные модификации (фосфорилирование/дефосфорилирование, метилирование, убиквитинилирование) влияют на локализацию грузов в клетке (Terry et al., 2007). Митотические протеинкиназьт индуцируют распад ЯО в начале клеточного деления; цистеиновые протеазы (каспазы) атакуют транспортную систему при запуске апоптоза; при полиовирусной инфекции протеаза 2А нарушает барьерные свойства ЯО (Belov et al., 2004; Park et al., 2008).
Мы проверили участие протеаз, протеинкиназ и фосфатаз в нарушении барьерных свойств ЯО кардиовирусами методом ингибиторного анализа in vitro. Используемая тест-система ранее позволила установить фермент, отвечающий за нарушение транспорта полиовирусом: протеазные ингибиторы, подавляющие активность 2А (Molla et al., 1993; Deszcz et al., 2004), предотвращали повышение проницаемости ЯО in vitro (Belov et al., 2004). В случае кардиовирусов по результатам ингибиторного анализа нами было исключено участие тестируемых классов протеаз, фосфатаз и выявлена роль клеточных росковитин- и оломоуцин чувствительных протеинкиназ (рис. 16).
