Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Основные сведения о первичной структуре и филогенетических связях альфавирусов
1.1. Общие черты строения геномов альфавирусов
1.2. Гены белков полимеразного комплекса
1.3. Синтез белков нуклеокапсида^оболочки, кодируемых субгеномной 26S РНК
1.4. Сборка нуклеокапсидов и вирионов альфавирусов. Формирование химерных вирионов
1.5. Функциональная характеристика гликопротеидов оболочки
Глава 2. Рекомбинация у вирусов с непрерывным РНК-геномом .36"
2.2.1. Строение геномов вирусов-рекомбинантов
2.2.2. Экспериментальные доказательства процесса рекомбинации на модели ВС
Глава 3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения и индикации РНК-содержащих вирусов ..HS
3.1. Основные характеристики метода ПЦР
3.2. Цели и варианты ПЦР- анализа
3.3. Подходы к разработке метода ОТ-ПЦР анализа для индикации альфавирусов
Часть 2 Собственные исследования ."
Глава 4. Материалы и методы
4.1. Альфавирусы: культивирование и определение инфекционности
4.2. Смешанное инфицирование клеточных культур двумя видами альфавирусов
4.3. Реакция нейтрализации (РН) инфекционной активности альфавирусов
4.4. Приготовление материала для ПЦР-анализа из природных изолятов альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ
4.5. Методы выделения РНК альфавирусов
4.6. Постановка ОТ-ПЦР
4.7. Рестрикция ДНК- продуктов ОТ-ПЦР
4.8. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле
4.9. Блот- гибридизация ПЦР- продуктов с олигонуклеотидными зондами. Исследование генетической структуры РНК вирусов-рекомбинантов
4.9.1. Метка зондов в реакции кинирования
4.9.2. Перенос ПЦР-продуктов на мембраны
4.9.3. Процедура гибридизации с Р-32 зондами
4.10. Расчет олигонуклеотидных ПЦР-праймеров и гибридизационных зондов
Глава 5. Результаты исследований $
5.1. Генотипирование вирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ
методом ОТ-ПЦР и рестрикционного анализа
5.1.1. Структура олигонуклеотидных праймеров вирусов Синдбис (ВС)
5.1.2. Амплификация и рестрикция участков генов эталонных штаммов вирусов Синдбис
5.1.3. Структура олигонуклеотидных праймеров вирусов
ЗЭЛ
5.1.4. Амплификация и рестрикция участков генов nsP2 и Е2 эталонных штаммов вируса ЗЭЛ Мак Миллан
5.2. Генетические связи и биологические свойства географических вариантов альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ
5.2.1. Анализ географических вариантов вирусов Синдбис
5.2.2. Сходство и различие американских вирусов ЗЭЛ и ЗЭЛ-подобного вируса У-62-33 из России (Удмуртия)
5.2.3. Дифференциация антигеннородственных вирусов Синдбис и ЗЭЛ методом ОТ-ПЦР
5.3. Рекомбинация у альфавирусов
5.3.1. Сравнение участка рекомбинации С-Е2 у географических вариантов вируса ЗЭЛ
5.3.2. Моделирование процесса рекомбинации при смешанной инфекции вирусами ВЭЛ и ВКЛ в культуре клеток
5.3.3. ОТ-ПЦР анализ гибридных форм РНК в составе вирионов
5.3.4. Сравнительный рестрикционный анализ участков геномов рекомбинантных вирусов и вирусов-родителей
5.3.5. Результаты сравнительного изучения инфекционной активности и антигенного состава вирусной популяции, образующейся при смешанной инфекции, и исходных
родительских вирусов 5.3.6.Гибридизационный анализ генетической структуры
области рекомбинации
Глава 6 Обсуждение f.f
- Гены белков полимеразного комплекса
- Экспериментальные доказательства процесса рекомбинации на модели ВС
- Подходы к разработке метода ОТ-ПЦР анализа для индикации альфавирусов
- Приготовление материала для ПЦР-анализа из природных изолятов альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ
Гены белков полимеразного комплекса
Все альфавирусы содержат в вирионах однонитевую 49S РНК положительной полярности длиной порядка Ит.н.п., которая кодирует белки полимеразного комплекса (nsPl-nsP4), белок нуклеокапсида (С), гликопротеины оболочки (Е1-Е2), функционирующие в форме гетеродимера, и белки ЕЗ и 6К, участвующие в транспорте гликопротеинов и сборке вирионов. Наиболее полно исследовано строение генома вируса Синдбис, который считается типичным видовым представителем рода альфавирусов [Strauss a. Strauss, 1994] (рис. 2). В составе вирионов вируса Аура, дополнительно к 49 S геномной РНК, обнаружена субгеномная 26S РНК [Rumenaph et al., 1995].
Особенность строения Южно-Американского вируса Синдбис, возможно, объясняется наличием в его 26S РНК сигналов инкапсида-ции, характерных для 49 S РНК. Геномные РНК альфавирусов инфекционны [Strauss a. Strauss, 1986], 5 - конец их кэпирован 7-метилгуа-нозином, а У- полиаденилирован и содержит около 70 адениловых остатков. По этим свойствам вирионная РНК альфавирусов во многом сходна с большинством эукариотических мРНК.
В геноме альфавирусов выделяют две транслируемые структуры: кодирующие неструктурные и структурные белки. Область генов неструктурных белков составляет по размеру 2/3 генома (порядка 7т.н.п.) (рис. 2). Она кодирует 4 белка полимеразного комплекса: nsPl, nsP2, nsp3, nsP4. В комплексе с клеточным белком 120 кДа белки полимеразного комплекса осуществляют репликацию вирусной РНК и синтез субгеномной 26S РНК [Barton et. al., 1991]. Область структурных генов располагается в остальной 1/3 генома и содержит информацию о последовательности структурных белков: капсидного (С) и оболочечных (Е1 и Е2), а также белков 6К и ЕЗ, которые , как правило, отщепляются от N- концов белков Е1 и Е2, соответственно, и не входят в состав зрелых вирионов у альфавирусов, за исключением представителей ВЛС, у которых белок ЕЗ обнаружен в составе вирионов [Garoff et. al., 1974].
Область генома между неструктурными и структурными белками носит название "junction" (слияние) и соответствует некодирующему 5 - концу субгеномной 26 SPHK (-50 нуклеотидов). Данная область играет роль промотора и состоит из 20-ти последних нуклеотидов гена nsP4 и 4-х первых нуклеотидов "junction" области со стоп-кодоном.
В геноме альфавирусов имеется несколько высококонсервативных участков, которые располагаются на 5 - и 3 - концах и имеют выраженную вторичную структуру в виде шпилек [Strauss a. Strauss 1994].Они являются регуляторными элементами, участвующими в инициации процессов трансляции и транскрипции вирусных РНК и сборке нуклеокапсидов. На 5 -конце вирионной 49S РНК локализована последовательность из 51 нуклеотида (вирус Синдбис 150-201 нуклеоти-ды), которая является дополнительным промотором синтеза минус нити и участвует в инициации инкапсидации. Показана важная функциональная значимость 51-нуклеотидного участка для скорости репликации вируса [Ou et. al., 1982b]. Мутации и делеции в этом участке могут быть летальными для вируса Синдбис. Основным сигналом инкапсидации считается участок генома, расположенный в гене nSP2 между 746 и 1226 нуклеотидами.
В структуре 51-nt шпильки у вирусов Окельбо и Карельской лихорадки по сравнению с прототипным вирусом Синдбис (штамм HRSP) имеется одна нуклеотидная замена (А вместо G), которая частично нарушает стабильность шпильки. Возможно, этим объясняется сниженная способность северо-европейских вариантов ВС к размножению в комариных клетках. В 3 - нетранслируемой области имеется консервативная последовательность из 19 нуклеотидов, выполняющая, по-видимому, функцию промотора синтеза минус-нити [Levis et.al., 1986; Niesters а. Strauss, 1990a,b; Kuhn et. al., 1990]. Кроме того, для 3 - концевых участков геномов альфавирусов характерны повторяющиеся последовательности от 25 до 72 нуклеотидов [Strauss a. Strauss, 1986]. Вероятно, они принимают участие в формировании вторичной структуры на этом участке генома и обеспечивают взаимодействие его с регуляторными клеточными белками. Область повторов вариабельна по первичной структуре у разных альфавирусов и их штаммов.
В структуре 49S геномной РНК ВС имеется один инициирующий кодон AUG, с которого начинается трансляция генов белков полимераз-ного комплекса. У большинства альфавирусов стоп-кодоны UAG находятся в конце генов nsP3 и nsP4. Поэтому 49S РНК транслируется в виде двух полипротеинов Р123 и Р1234 (рис.З), поэтапно расщепляю щихся с образованием функционально активных промежуточных форм до конечных продуктов- белков nsPl, nsP2, nsP3 и nsP4. Однако, у отдельных альфавирусов [ВЛС и БОНН] стоп-кодон в nsP3 заменен на значимый кодон CGA. В таком случае, 49S РНК транслируется только в виде одного полипротеина Р 1234 [Johnson et. al., 1981].
Структурный домен генома транслируется как полипротеин на субгеномной 26S РНК (26 т.н.п.). 26S РНК также содержит структуру "кэп" на 5 - конце и поли (А)- "хвост" на 3 - конце, что придает ей свойства, сравнимые с эукариотической мРНК. При расщеплении структурного полипротеина образуются : белок нуклеокапсида (С), два белка оболочки вириона Е1 и Е2 и два небольших по размерам полипептида ЕЗ и 6К, участвующих в транспорте белков оболочки и сборке вирионов на клеточной мембране [Garoff et. al., 1978]. Образующиеся в процессе репликации минус-нити геномной РНК являются матрицами не только для синтеза вирионной РНК, но и субгеномной 26S РНК [Strauss a. Strauss, 1986].
Экспериментальные доказательства процесса рекомбинации на модели ВС
В последние годы особый интерес вызывают вопросы специфичности процессов взаимодействия у альфавирусов вирионной РНК с белком нуклеокапсида и связывания нуклеокапсида с белками оболочки [Hahn et. al., 1989b; Lopez et. al., 1994]. Это обусловлено появлением данных о возможности формирования химерных вирионов при взаимодействии РНК и белков разных видов альфавирусов (ВЛС и ВРР). Кроме того, при альфавирусной инфеции происходит накопление вирионов с дефектными формами вирусных РНК [Barret et. al., 1984]. Возможно также образование инфекционных вирусов-рекомбинантов в клетках и при репликации гибридных форм РНК альфавирусов [Weiss а. Schlesinger, 1991; Raju et. al., 1995]. Следует особо выделить Синдбис-подобный американский вирус Аура, вирионы которого могут включать как геномную 49S РНК, так и субгеномную 26S РНК [Rumenaph et. al., 1994]. Включение в вирион Аура субгеномной 26S РНК объясняется наличием в ней сигнала инкапсидации, что не свойственно субгеномным РНК других известных альфавирусов. Считается, что именно благодаря наличию сигнала инкапсидации только в 49S РНК, происходит преимущественное включение ее в вирионы. У ВС делеция в положении 97-106 49S РНК приводит к утрате специфического связывания с белком нуклеокапсида и попаданию в вирионы субгеномной РНК. Такой же эффект может наблюдаться при трансфекции в клетки РНК-репликонов, не содержащих сигналов инкапсидации. Наиболее сильные сигналы инкапсидации локализованы у ВС в nsPl гене (позиции 721-1306), а у ВРР в nsP2 гене (позиции 2902- 3062) [Weiss et. al., 1989]. Таким образом, сигналы упаковки у ВС и ВЛС отличаются.
Процесс сборки нуклеокапсида начинается с присоединения капсидного белка С к 5 -концевому участку вирусной РНК, соответствующему сигналу инкапсидации [Wengler et. al., 1984; Wengler, 1987]. Далее, за счет специфических латеральных взаимодействий между С-белками и неспецифических электростатических связей N-концов С-белков с РНК, формируется икосаэдрическая структура нуклеокапсида с числом триангуляции Т=4. Однако, в разных условиях могут наблюдаться частицы и иной структуры с меньшими Т=1,3,5, содержащие дефектные РНК, и с большим Т=7, с аномальными видами вирусных РНК. В структуре вирионов с Т=4 отношение между нуклеокапсидом и гликопротеинами оболочки соответствует 1:1, при этом сайт взаимодействия каждого нуклеокапсидного белка соответствует цитоплазматическому домену Е2 [Lee a. Brown, 1994].
При смешивании изолированного очищенного С-белка с разными видами РНК происходит его связывание не только с геномной 49S РНК, но и субгеномной 26S РНК, а также с клеточной т-РНК и полианионами. Сигнал инкапсидации влияет на эффективность процесса образования нуклеокапсидов. В процессе образования вирионов структура нуклеокапсидов модифицируется. Свободные цитоплазмати-ческие нуклеокапсиды отличаются по физико-химическим свойствам от выделенных из вирионов [Stubbs et. al., 1991; Harrison et. al., 1992]. Нуклеокапсиды, собранные в цитоплазме, взаимодействуют с вирусными гликопротеинами, локализованными на поверхности клеточной мембраны с участием С-концевого цитоплазматического участка белка Е2. Взаимодействие считается высокоспецифическим [Torrisi a. Bonatti, 1985; Metsikko a. Garoff, 1990].В структуре белка С определены наиболее вероятные а.о., взаимодействующие с цитоплазматическим доменом оболочечного белка Е2. В структуре рекомбинантного вируса ЗЭЛ (нуклеокапсидный белок которого подобен вирусу ВсЭЛ, а гликопротеины-ВС), в белке С локализованы 7 аминокислот, аналогичные ВС ( М137, N-172, G201, L-231, A-234, T-238 и 1-254 (позиции по ВС). Возникновение аминокислотных замен у вируса ЗЭЛ в сторону ВС привело к формированию стабильных рекомбинтных вирионов. С другой стороны, у рекомбинантного вируса ЗЭЛ в цитоплазматическом домене Е2 имеются 4 аминокислотные замены, адаптирующие белок оболочки гликопротеина к нуклеокапсиду ВсЭЛ (V-408, 1-415, Р-420, Т-421) [Hahn et. al., 1988; Strauss et. al., 1994; Урываев с соав., 1994-95; Лебедев, 1996]. Наряду с изменениями в 4-х позициях цитоплазматического домена Е2 вируса ЗЭЛ в сторону ВсЭЛ, имеются сходные по направленности замены и в участках Е2, погруженных в мембрану, хотя в целом, внутримембранные участки Е2 малоконсервативны у альфавирусов.
Латеральные взаимодействия между гликопротеинами Е2 и Е1 также важны для сборки вирионов. Описано несколько ts-мутантов по генам гликопротеинов, у которых процесс формирования вирионов нарушен [Григорьев, 1993; Маныкин, 1993]. Почкующиеся вирионы видны в электронном микроскопе, начиная с 3 часов инфекции. По-видимому, гликопротеины оболочки быстро взаимодействуют с нуклеокапсидами на плазматической мембране. В отсутствии нуклекапсидного белка гликопротеины деградируют и их фрагменты освобождаются в культуральную жидкость [Zhao a. Garoff, 1992]. Между гликопротеинами и нуклеокапсидами осуществляются прямые нековалентные взаимодействия без участия липидов [Hahn et. al., 1989b; Lopez et. al., 1994].
Подходы к разработке метода ОТ-ПЦР анализа для индикации альфавирусов
Оригинальный подход в исследовании процесса рекомбинации был использован на модели альфавирусов [Raju et. al., 1995; Weiss a. Schlesinger, 1991]. РНК-репликоны ВС были сконструированы генноин-женерными методами так, что одни конструкции содержали только гены неструктурных белков (nsPl-nsP4), но были дефектны по генам структурных белков. Другие РНК-репликоны, наоборот, не содержали последовательности, необходимые для репликации и инкапсидации, но содержали гены структурных белков. В результате котрансфекции генноинженерных фрагментов РНК ВС в чувствительные клетки образовывались инфекционные вирионы, РНК которых имела рекомбинантную структуру, содержала вставки, делеции и перегруппировки генов. Места перекреста были множественными. Обмен нуклеотидных последовательностей происходил по гомологичному и аберрантному типам, т. к. в местах перекреста в вирусной РНК выраженная гомология не всегда имела место. Экспериментальные исследования включали трансфекцию РНК в клетки ВНК, титрование полученного инфекционного вируса в культуральной жидкости, -чч определение генной экспрессии у вирусов -рекомбинантов. Для доказательства рекомбинации был проведен электрофоретический анализ вирусных внутриклеточных РНК и вирионных РНК в составе вирусов-рекомбинантов и определена первичная структура фрагментов в сайтах рекомбинации. В составе вирионной 49S РНК найдены гены неструктурных и структурных белков. "Сильные" РНК-репликоны, кодирующие РНК-полимер азы, выступали в роли акцепторных матриц, а "слабые" РНК-репликоны, кодирующие структурные белки, - в роли доноров. 5 и 3 - регуляторные последовательности промоторов РНК-полимеразы были необходимы для рекомбинации. Однако, в случае трансфекции нереплицирующихся фрагментов РНК, также наблюдалось образование инфекционного вируса с рекомбинантным геномом. Таким образом, опыты по рекомбинации с ВС впервые показали, что полноразмерная инфекционная РНК в составе дочерних вирионов может быть получена в результате внутриклеточной рекомбинации из сегментированной, но для этого необходимы элементы промотора РНК-полимеразы и сигналы инкапсидации РНК в вирионы. Образующиеся вирусы-рекомбинанты имеют селективные преимущества, т. к. среди них найдены варианты РНК с двумя копиями промоторов для синтеза субгеномной РНК и удвоенной областью "junction", соединяющей неструктурную и структурную области геномов. Образуемые гибридные формы РНК подвергаются естественному отбору, который обеспечивает сохранение молекул, способных формировать стабильные вирионы. Происходит накопление вирусов, содержащих рекомбинантные геномные РНК с необходимыми для репликации и формирования вирионов нуклеотидными последовательностями.
Полимеразная цепная реакция для обнаружения и индикации РНК-содержащих вирусов. 3.1. Основные характеристики метода ПЦР.
В настоящее время для определения вирусов в биопробах различного происхождения широко используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) [PCR. A Practical Approch., 1991, London; Глухов с соавт., 1996]. Чувствительность метода очень высока (несколько молекул РНК или ДНК) и сравнима с определением инфекционного вируса в биологическом титровании. Метод ПЦР обладает уникальной специфичностью и позволяет в смеси молекул РНК и ДНК провести поиск отдельных участков вирусных генов, размножить их в достаточном для обнаружения количестве (десятки мкг). Специфические ДНК-продукты обычно определяют визуально в агарозном геле по окраске бромистым этидием. Последующий анализ специфичности и первичной структуры амшшфицированных участков вирусных генов осуществляется методами рестрикции, гибридизации и секвенировния. Разработка метода ПЦР стала возможной после выделения термостабильной ДНК-полимеразы из Termus aquaticus (Taq- полимераза) [PCR Protocols., 1990]. Фермент сохраняет свою активность при температуре 95"С, что позволяет использовать его в многоцикловой реакции с чередующимися этапами: плавления (90- 95С), отжига с олигонуклеотидными праймерами (бО-бО С) и амплификации (70-75оС) в оптимальной реакционной смеси. Сродство Taq- полимеразы к матрицам ДНК более чем в 1000 раз выше, чем к РНК. Поэтому при работе с вирусными РНК предварительно проводят реакцию обратной транскрипции для получения комплементарной ДНК (кДНК). При определении вирусных ДНК ПЦР ставится непосредственно на исследуемом образце выделенной нуклеиновой кислоты
Приготовление материала для ПЦР-анализа из природных изолятов альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ
Проведено генотипирование ряда природных изолятов вирусов Синдбис и ЗЭЛ с неизвестной первичной структурой. В таблицах 3 и 4 приведены основные биологические характеристики изученных альфавирусов серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ и указаны географические районы их выделения. Природные изоляты, прошедшие 1-2 пассажа в мозге новорожденных мышей или в культурах чувствительных клеток, были адаптированы к первичной культуре ФЭК или Vero. Инфекционный материал "культурального" вируса имел титр 10 - 10 БОЕ/ мл.Проведен сравнительный анализ нескольких природных изолятов Синдбис-подобных вирусов Северной Европы (Карелия,Эстония), Северной и Центральной Африки, Кавказа (Армения) и Новой Зеландии. Изученные ВС различались между собой по скорости размножения (табл. 3). Цикл репродукции у разных вирусов колеблется от 6 до 10 часов. Такие изоляты как 1381 и 1383 (Эстония), можно условно отнести к быстроразмножающимся. Наиболее продуктивными среди ВС являются Бабанки, ВКЛ, 1381, Ватароа, а наименее - прототипный штамм ВС AR 339 и Ф-720. Исследованные нами вирусы различались между собой по уровню нейтрализации инфекционной активности (ИН) антисывороткой к ВКЛ, который является представителем Синдбис-подобных вирусов Северной Европы. Наиболее высокий ИН антисывороткой (4-5 lg ЦПД) установлен для географически близкой группы изолятов Скандинавии (1381, 1383- Эстония). Низкая активность в РН показана у географически отдаленных вирусов: Ватароа (Новая Зелан дия) и ЗЭЛ (Северная Америка). Промежуточное положение занимают вирусы из Африки (ВС AR 339; Бабанки) и Армении (Ф-720), индекс нейтрализации антисывороткой которых равен 2-3 lg ЦПД.
Для генетического анализа описанных выше вирусов использовали ОТ-ПЦР- амплификацию участков двух генов: неструктурного nsPl и структурного Е1 с последующей рестрикцией полученных ДНК-продуктов. Амплифицированные участки включали последовательности гена nsPl (позиции 215-716) и Е1 (позиции от начала гена 764-1249), идентичные известной первичной структуре ВС HRSP, Окельбо и ВКЛ. Результаты генотипирования природных вирусных изолятов с неизвестной первичной структурой приведены на рис. 12 (а, Ь). Географические изоляты Синдбис-подобных вирусов из Африки (AR 339, Бабанки) и Европы (ВКЛ, 1381, 1383) являются идентичными по ДНК продуктам (522 н.п. и 506 н.п.), полученным в ОТ-ПЦР с праймерами к генам неструктурного nsPl и структурного Е1 белков. Полученные данные позволяют отнести изоляты 1381 и 1383, выделенные на территории Эстонии в период вспышки [Урываев, Василенко с соавт., 1992], к вирусам Синдбис.
Вирус Ф-720 (Армения) имеет сходство с ВС других регионов по гену неструктурного nsPl белка, но отличается от них по гену белка оболочки Е1. Вирус Ватароа проявляет сходство с ВС по гену белка оболочки Е1 и отличается от него по гену неструктурного белка nsPl. Вирусы Бабанки, 1381 и Ф-720 были дополнительно исследованы в ОТ-ПЦР с праймерами к гену nsP2 вируса ЗЭЛ. Отрицательный результат подтвердил отсутствие связей этих вирусов с группой ЗЭЛ.
Данные ОТ-ПЦР анализа показывают необходимость генотипирования вирусных изолятов, как минимум, по двум генам, один из которых находится в области генов неструктурных белков генома, а другой - в области генов нуклеокапсида и оболочечных белков, содержащих основные антигенные детерминанты вирионов. Полученные данные дают основания считать исследованные изоляты вирусов Бабанки, 1381 и 1383 сходными с африканским прототипным штаммом Синдбис AR 339 и Северо-европейским штаммом ВКЛ по генам структурного Е1 и неструктурного nsPl белков.
Для исследования внутренних последовательностей амплифицирован-ных участков генов природных изолятов был проведен их рестрикционный анализ несколькими ферментами (табл. 5). Рестрикци-онный анализ амплифицированных участков гена Е1 показал сходство между ВС AR 339, Бабанки, ВКЛ и 1381 (рестриктазы: Hincll, Pstl, Pvull) и, вместе с тем, выявил определенные отличия в нуклеотидных последовательностях участка генов nsPl этих вирусов. Так, распределение фрагментов после действия рестриктазы Нра 11 на ДНК- продукт nsPl изолятов Бабанки, 1381, Ф-720 было близко к ожидаемому. Однако, в случае действия рестриктазы Ava 11 на ДНК- продукт nsPl ВКЛ и 1381 были получены фрагменты, не совпадающие с расчитанными для nsPl ВС HRSP. Поскольку между ВКЛ и эстонским вирусом 1381 есть различия в наборе и величине рестриктов, можно сделать вывод об отличии их друг от друга по первичной структуре в проанализированных участках гена nsPl. Картина рестрикции Ava 11 участка гена nsPl вируса Бабанки была аналогична рассчитанной для гена вируса Синдбис HRSP.
