Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы
Глава I. Латентные и хронические инфекции вирусами комплекса клещевого энцефалита 9
Глава 2. Цитопролиферативная активность флавивирусов 27
Глава 3. Метод органных культур в изучении арбовирусных инфекций 36
Заключение 50
ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава I. Материал и методы 52
Глава 2. Моделирование латентной инфекции сирийских хомячков вирусами комплекса клещевого энцефалита 63
2.1. Латентная инфекция сирийских хомячков,вызванная штаммом Еланцев вируса клещевого энцефалита 66
2.2. Персистенция клона 5 штамма TP-2I вируса Лангат в организме сирийских хомячков 71
2.3. Особенности инфекции сирийских хомячков,вызванной штаммом Софьин вируса клещевого энцефалита 75
2.4. Влияние иммуностимулятора В-активина на антителообразование у сирийских хомячков в условиях хронической инфекции 80
2.5. Заключение 85
Глава 3. Выделение и изучение свойств персистиругощих вирусов комплекса клещевого энцефалита 87
3.1. Применение метода органных культур для выделения персистирующего вируса клещевого энцефалита 87
3.2. Изучение вируса,выделенного из мозга сирийских хомячков при персистентной инфекции,вызванной клоном 5 штамма TP-2I вируса Лангет 92
3.3. Заключение 101
Глава 4. Шделирование хронической инфекции культур клеток головного мозга сосунков сирийских хомячков вирусами комплекса клещевого энцефалита
4.1. Получение и культивирование клеток ГМСХ 103
4.2. Моделирование хронической инфекции культур клеток ГМСХ вирусами комплекса клещевого энцефалита 105
4.3. Основные параметры развития инфекции культур клеток ГМСХ,вызванной вирусами комплекса клещевого энцефалита 106
4.4. Взаимосвязь антигенных и вирулентных свойств вирусов комплекса клещевого энцефалита в условиях персистенпии 116
4.5. Заключение 118
ОБСУЖДЕНИЕ 121
ВЫВОДЫ 138
УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ 140
- Латентные и хронические инфекции вирусами комплекса клещевого энцефалита
- Цитопролиферативная активность флавивирусов
- Моделирование латентной инфекции сирийских хомячков вирусами комплекса клещевого энцефалита
Введение к работе
Клещевой энцефалит является одной из наиболее распространенных на территории СССР инфекций арбовирусной этиологии,играющих значительную роль в инфекционной патологии человека.
Природные очаги клещевого энцефалита (КЭ) имеются на территории от Камчатки и Сахалина на востоке до Белоруссии и Прибалтийских республик на западе СССР. За последнее десятилетие отмечен периодический подъем заболеваемости КЭ в Эстонии и на Украине ( 43, 8, 9 ).
Вирус КЭ вызывает у человека тяжелые заболевания с преимущественным поражением центральной нервной системы, часто приводящие к последующей инвалидизации. К неблагоприятным исходам относится развитие хронических прогредиентных форм КЭ,частота которых может достигать 14-41$ всех случаев. ( 72, 101 ). Возможна индукция хронического течения заболевания при использовании живых вакцин,созданных на основе аттенуированных штаммов вирусов комплекса КЭ ( 90 ). Профилактика КЭ по-прежнему остается достаточно серьезной проблемой практического здравоохранения.
Существование хронических прогредиентных форм КЭ диктует необходимость проведения исследований по изучению персистентных инфекций аттенуированных штаммов данных вирусов с целью решения вопроса о дальнейших перспективах разработки практических мер профилактического и лечебного характера,направленных на предотвращение и ликвидацию последствий персистенции вирусов комплекса КЭ.
Изучение этой важной проблемы неразрывно связано с раскрытием закономерностей длительного вирусоносительства,а также совершенствованием методов индикации персистирующего вируса КЭ в латентно инфицированных системах.
В настоящее время экспериментальному моделированию хронических инфекций вирусами комплекса КЭ посвящен ряд работ ( 80, 87 ). Однако,некоторые аспекты данной проблемы в них не представлены.
Важным вопросом в изучении проблемы бессимптомных форм виру-соносительства является выделение инфекционного агента - прямого доказательства его персистенции. Однако,в процессе длительного пребывания персистирущего вируса в иммунном организме могут существенно меняться свойства самого возбудителя,что в значительной степени затрудняет его определение обычными вирусологическими методами ( 37 ). С целью демаскирования персистируїощего вируса в условиях латентной инфекции необходимо привлечение высокочувствительных методов,как сокультивирование клеток исследуемых органов с чувствительными тест-культурами,метод эксплантации органов инфицированных животных. Имеющиеся в литературе сведения о применении данных методов в изучении патогенеза персистентных инфекций, вызванных вирусами комплекса КЭ ограничиваются единичными случаями.
Мало изученным остается описанный В.И. Гавриловым ( 1972 ) феномен цитопролиферативной активности вирусов - существенного элемента хронических инфекций,поражающих ЦНС человека и животных ( 16 ).
Явление цитопролиферативной активности ( ЦПФА ) вирусов установлено на модели первично-трипсинизированных культур клеток головного мозга и заключается в усилении пролиферативных потенций клеточных элементов под влиянием вирусного агента. Наиболее подробно изучение ЦПФА персис тирующих флавивирусов проведено для вируса ЯЭ ( 17, 18, 19, 26, 27 ). Недостаточно изучен вопрос о соотношении цитодеструктивных и цитопролиферативных процессов в мозговой ткани в условиях персистенции вирусов комплекса КЭ.
Не виявлено также, на какой стадии формирования хронического процесса персистирующий вирус КЭ приводит к пролиферации клеточных элементов.
Цель и задачи работы. В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования является определение способности аттенуированных и вирулентных штаммов вирусов комплекса КЭ вызывать латентную и хроническую инфекции, применение методов "демаскирования" вируса при бессимптомной инфекции и оценка потенциальной способности штаммов вирусов комплекса КЭ к персистенции.
В процессе настоящего исследования решались следующие конкретные задачи: изучение способности к персистенции различных по патогеннос-ти штаммов вирусов комплекса КЭ в организме сирийских хомячков; определение локализации, динамики накопления и свойств персис тирующего вируса КЭ в органах зараженных животных; изучение способности вирусов комплекса КЭ вызывать пролиферацию клеток головного мозга сосунков сирийских хомячков в условиях персистенции; определение особенностей иммуносупрессии и шлмушстшдуляции при персистенции аттенуированных и вирулентного штаммов вирусов комплекса КЭ.
Ответ на эти вопросы представляет важное значение не только для расширения общебиологических знаний, но и является основой для разработки практических мер профилактики и лечения КЭ.
Положения, выносимые на защиту.
I. Моделирование и изучение особенностей экспериментальной хронической инфекции вирусами комплекса КЭ в организме животных и в культурах клеток.
2. Определение различного воздействия иммуномодуляторов ( циклофосфана и В-активина ) на персистенцию вирулентного и ат-тенуированных штаммов вирусов комплекса КЭ.
3. Разработка методов определения потенциальной способности вирусов комплекса КЭ к персистенции.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований получен ряд новых экспериментальных данных: впервые показано, что в организме животных с латентной ( бессимптомной ) формой инфекции, вызванной КЭ персистируют и выделяются варианты исходного вируса, обладающие более высокой патогенностыо и отличающиеся по антигенной характеристике; доказана высокая эффективность выделения вирусов комплекса КЭ методом органных культур из органов животных с латентной ( бессимптомной ) сформой инфекции; впервые доказана возможность использования теста ЦПФА цито-пролиферативной активности для определения потенциальной способности вирусов комплекса КЭ к персистенции; впервые получены данные об особенностях стимуляции продукции противовирусных антител в ответ на иммунизацию вирулентным и аттенуированными штаммами вирусов комплекса КЭ сочетанную с введением препарата В-активина ( 76 ). Практическая ценность работы.
Получены доказательства возможности персистенции аттенуиро-ванных вариантов вирусов комплекса КЭ в организме, что ограничивает использование этих штаммов ( клон 5 штамма TP-2I вируса Лангат и штамм Еланцев вируса КЭ ) для создания живых вакцин.
Отработаны методические приемы выделения вируса при скрытой латентной инфекции из органов животных и определение потенциальной способности вирусов комплекса КЭ к персистенции.
На основании полученных данных разработаны и апробированы методические рекомендации: "Применение метода органных культур для выявления латентных и хронических инфекций, вызываемых арбовирусамп", утвержденные Ученым Советом Института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР, протокол JS 16 от 22.11.76 г. "Применение ДЕАЕ-декстрана для усиления цитопатогенной активности персистирутощего вируса клещевого энцефалита", утвержденные Ученым Советом Института вирусологии игл. Д.И. Ивановского АШ СССР, протокол Je 10 от 06.10.78 г. "Методы выявления и оценки потенциальной способности штаммов флавивирусов к персистенции", утвержденные Ученым Советом Института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР и Ученым Советом ГИСК игл. Л.А. Тарасевича MS СССР, протокол JS 15 от 28.12.78 г.
Данные рекомендации апробированы и внедрены в практику в вирусологическом отделе Томского НИИ вакцин и сывороток МЗ СССР ( 1984 ), в лаборатории КЭ и ГЛПС Хабаровского НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ СССР ( 1984 ), в лаборатории природноочаговых инфекций Львовского НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ УССР ( 1984 ).
Фрагмент работы по моделированию персистентной инфекции сирийских хомячков, вызванной вирусами комплекса КЭ, выполнен совместно с канд. мед. наук, старшим научным сотрудником М.С. Воробьевой -руководителем лаборатории стандартизации и контроля медицинских препаратов для профилактики и диагностики арбовирусных инфекций и риккетсиозов ГИСК игл. Л.А. Тарасевича МЗ СССР и канд. мед. наук, старшим научным сотрудником этой лаборатории И.П. Ладыженской, которым выражаем искреннюю признательность и благодарность.
Латентные и хронические инфекции вирусами комплекса клещевого энцефалита
Одним из наиболее распространенных на территории СССР представителей арбовирусов являются вирусы комплекса клещевого энцефалита ( КЭ ),включающего 7 антигенно сходных представителей: клещевого энцефалита, шотландского энцефаломиелита овец, омской геморрагической лихорадки,киазанурской лесной болезни, Лангат,ПЬвассан и Не-гиши. Для трех представителей вирусов комплекса КЭ доказана природная очаговость на территории СССР ( вирусы КЭ,Негиши,Повассан ). Согласно современной классификации вирусы комплекса КЭ являются представителями недавно выделенного в самостоятельное семейство, многие из которых играют значительную роль в инфекционной патологии человека ( 67 ).
Для вирусов комплекса КЭ характерно латентное инфицирование широкого круга животных и птиц в межэпидемический период,участвующих в циркуляции вируса в очагах арбовирусных инфекций и обеспечивающих сохранение данных вирусов как вида.
К настоящему времени накоплены многочисленные данные, свидетельствующие о широком распространении в природе латентных инфекций, вызванных вирусами комплекса КЭ. Так,птицы являются одним из наиболее важных звеньев в цепи циркуляции и распространения вируса ( 62, 63, 64 ).
На широкое носительство вируса КЭ среди птиц и животных указывают работы Краминской Н.Н. ( 50, 51, 52 ). Изучая птиц Восточной Сибири,автор выделяла из мозга,печени и крови вирус КЭ. Были обнаружены антитела к вирусу КЭ у недавно вылупившихся птенцов дрозда, что свидетельствовало о трансовариальнои передаче вируса. Это пред - 10 положение подтверждалось обнаружением вируса в яйцах дрозда. Особый интерес представляет выделение вируса КЭ из мозга зимующих в Восточной Сибири птиц. Из 143 отстреленных птиц у 20 из них был обнаружен вирус в головном мозге.
Пожизненное вирусоносительство было установлено у клещей - переносчиков заболевания ( 74 ).
Рядом исследователей установлен феномен трансовариальной передачи вируса инфицированными клещами,что наряду с длительной персис-тенпией способствует сохранению и поддержанию КЭ в очагах ( 57, 71, 103, 155 ).
Получены данные о способности ежей длительное время поддерживать персистенцию вируса КЭ,при этом установлено,что чем ниже температура тела животного,тем продолжительнее виремия ( 135, 151, 165 ).
Установлено существование латентных форм инфекций,вызываемых вирусом КЭ у некоторых видов сельскохозяйственных и домашних животных.
Цитопролиферативная активность флавивирусов
В настоящее время в литературе имеются многочисленные данные о способности ряда вирусов вызывать эффект стимуляции клеточного деления. Показано, что вирусная инфекция далеко не всегда сопровождается цитоцидным действием, а в ряде случаев, напротив, приводит к усилению пролиферации тех или иных клеточных элементов. Этот феномен, названный В.И. Гавриловны ( 1972 ) цитопролиферативной активностью вирусов ( ЦПФА ), играет важную роль в патогенезе некоторых острых, хронических и медленных вирусных инфекций ( 16 ).
Явление ЦПФА не сводится лишь к количественному усилению про-лиферативных потенций клеток. Изменения клеточного метаболизма, лежащие в основе цитопролиферативного эффекта ( ЦПФЭ ), сказываются и на функциональной активности клеток, особенно высокодифференпиро-ванных, что в свою очередь приводит к ряду иммунопатологических реакций. Все эти изменения клеточных популяций определяют существенные стороны патогенеза подострых и хронических вирусных инфекций ( 16 ).
Значительный теоретический и практический интерес представляет обнаружение ЦПФА у некоторых флавивирусов. ЦПФЭ наблюдается при вирусных инфекциях клеточных популяций / у аг Рър и на уровне организма как в естественных условиях, так и в эксперименте. Так, рядом экспериментальных исследований показано, что в патологоанато-мической картине хронических заболеваний ЦНС полностью отсутствует воспалительная реакция, характерными изменениями являются дегенеративные и склеротические поражения некоторых отделов головного мозга ( аммонов рог, мозжечок, кора ), выраженный глиоз и гидроцефалия, что, в известной мере, сближает эти заболевания с такими медленными инфекциями ЦНС как подострый склерозирующий панэнцефалит и группа подострых спонгиозных энцефалопатии ( 120 ).
Исследованиями %&п Л &. ( 170 ) было установлено, что наиболее ранним изменением в ЦНС белых мышей, инокулированных внутрибрюшинно различными штаммами флавивирусов ( в том числе и аттенуированным штаммом TP-2I вируса Лангат ) была активация аст-роцитарной глии. Процесс интенсивной пролиферации астроцитов обнаруживался до развития воспалительных изменений в головном мозге и медленно прогрессировал, что приводило к развитию выраженного склероза в некоторых отделах зараженных животных. Принципиальное значение этой работы состоит также в том, что автором была обнаружена способность аттенуированного штамма TP-2I Лангат вызывать в ЦНС мышей патоморфологические изменения, существенно не отличающиеся от аналогичных изменений в головном мозге животных, зараженных вирулентными арбовирусами, хотя в первом случае инфекция протекала без клинических проявлений.
Аналогичные результаты в опытах с вирусом Лангат получили Ш0ЖЗ. а.Ж Лё .S. ( 183 ). Внутрибрюшинное заражение белых мышей вирусом Лангат приводило к развитию субхронических форм энцефаломиелита. Авторы отмечали усиленную пролиферацию астроцитов, олигодендроцитов и микроглиальных клеток. Несмотря на субклиническое течение энцефалита, вирус накапливался в ткани головного мозга до высоких титров.
Моделирование латентной инфекции сирийских хомячков вирусами комплекса клещевого энцефалита
Задачей настоящего исследования является изучение способности к персистенции различных по патогенности штаммов вирусов комплекса клещевого энцефалита в организме сирийских хомячков, определение локализации, динамики накопления вируса в органах зараженных животных, а также особенностей иммуносупрессии и иммуностимуляции при персистенции аттенуированных и вирулентного штаммов вирусов комплекса КЭ.
В эксперименте использовали три штамма вирусов комплекса КЭ: Софьин, Еланцев и ТР-2І клон 5 вируса Лангат,подробная характеристика которых представлена в предыдущем разделе. В качестве объекта исследования служили самки сирийских хомячков 4-недельного возраста ( массой 50-60 г ),инфицированные вышеперечисленными вирусами КЭ. В опытах было использовано 200 особей.
Для изучения особенностей персистенции вирусов комплекса КЭ в организме сирийских хомячков в условиях супрессировашого иммунного ответа часть животных ( 65 голов ) была обработана иммунодепрес-сантом циклофосфаном ( ЦФА ) в разные сроки инфекции.
Таким образом,все подопытные животные были разделены на следующие группы:
1 - сирийские хомячки,зараженные штаммом Софьин и не обработан ные ЦФА - 20 голов;
2 - зараженные штаммом ТР-21-5-Лангат и не обработанные ЦФА 30 голов;
3 - зараженные штаммом ТР-21-5-Лангат и обработанные ЦФА - 30 голов;
4 - инфицированные штаммом Еланцев и не обработанные ЦФА - 30 голов;
5 - инфицированные штаммом Еланцев и обработанные ЦФА - 30 голов.
6 - не обработанные ЦФА - 10 голов;
7 - обработанные ЦФА - 5 голов.
Сирийским хомячкам проводили подкожное заражение ( в область загривка ) однократно по 0,3 мл суспензии соответствующего вируса, содержащей 10 - 10 мышиных церебральных 1Я 50/ » мл Всех подопытных животных обследовали на 3,7,10,15,30,50,70,90, 120 сутки инфекции,общая продолжительность наблюдения составляла более 120 дней после заражения животных вирусами КЭ. На всех сроках исследования у сирийских хомячков ( по 2 хомячка от каждой группы ) производили взятие крови и органов ( головной и спинной мозг,печень,почки и селезенку ) для тестирования вируса.
Кроме того,изучали динамику накопления в органах вирусспецифи-ческого антигена с помощью прямого метода шмунофлюоресценции,а также динамику накопления гемагглютинирующих антител в реакции торможения гемагглютинации ( РТТА ).
Органы хомячков для вирусологического исследования и приготовления органных культур извлекали с соблюдением асептики немедленно после тотального обескровливания животных и перфузии через сердце внутренних органов стерильным физиологическим раствором (25-30 МЛ/ на I хомячка ).
