Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Методы получения и культивирования свежеизолированных клеток животных для вирусологических исследований 14
1.1. Ферментативная дезагрегация измельченных кусочков ткани 15
1.2. Перфузионный способ дезагрегации паренхиматозных органов ...17
1.3. Способы выращивания первичных культур клеток 19
Глава 2. Применение линий клеток человека и животных для получения вирусных вакцин 23
2.1. Характеристика линий клеток человека и животных 23
2.2. Способы выращивания перевиваемых линий клеток 34
2.3. Перевиваемые линии клеток - субстраты для получения вирусных вакцин 45
Глава 3. Материалы и методы исследований 52
3.1. Культуры клеток и методы работы с ними 52
3.1.1. Культуры клеток 52
3.1.2. Методы получения первичных культур клеток 53
3.1.3. Пассирование клеток 54
3.1.4. Изучение кинетики роста клеток в культуре 54
3.1.5. Хранение клеток в жидком азоте и восстановление их после криоконсервации 56
3.1.6. Кариологический анализ культур 56
3.1.7. Морфологическое изучение культур клеток 57
3.1.8. Контроль культур клеток на безопасность 58
3.2. Методы вирусологических исследований 59
3.2.1. Вирусы 59
3.2.2. Размножение вакцинных штаммов вирусов полиомиелита, клещевого энцефалита, бешенства, чумы плотоядных в клетках линий 4647 и Vero 60
Глава 4. Разработка способов перфузионной трипсинизации почек и селезенок зеленых мартышек 63
4.1. Перфузионная дезагрегация почек обезьян in situ 64
4.2. Перфузионная дезагрегация почек обезьян in vitro 65
4.3. Перфузионная дезагрегация селезенок обезьян in vitro 73
Заключение по главе 4 76
Глава 5. Создание и аттестация посевных и рабочих банков перевиваемых линий клеток обезьян 77
Заключение по главе 5 92
Глава 6. Экспериментальные разработки по применению линии клеток 4647 для получения противовирусных препаратов 94
6.1. Разработки по созданию вакцины против полиомиелита 94
6.2. Разработки по созданию вакцины против клещевого энцефалита...97
6.3. Разработки по созданию новой вакцины против чумы плотоядных.99
6.4. Культивирование вакцинных штаммов вируса бешенства 103
Заключение по главе 6 105
Глава 7. Разработка технологии выращивания культур клеток и вакцинных штаммов вирусов полиомиелита и клещевого энцефалита на микроносителях в биореакторах 106
7.1. Культивирование клеток линии 4647 в условиях псевдосуспензии 106
7.2. Разработка метода псевдосуспензионного культивирования клеток линии Vero 109
7.3. Применение псевдосуспензионного метода культивирования клеток линии Vero для накопления вакцинных штаммов вирусов 119
7.3.1. Культивирование клеток линии Vero и вакцинных штаммов вируса полиомиелита (штаммы Сэбина типа I, II и III) на микроносителе Цитодекс-1 в биореакторе Celligen Plus 119
7.3.2. Культивирование клеток линии Vero и вируса клещевого энцефалита (штамм Софьин) на микроносителе Цитодекс-1 в спиннерах Techne 123
Заключение по главе 7 129
Обсуждение 130
Выводы 145
Список литературы 148
- Перфузионный способ дезагрегации паренхиматозных органов
- Способы выращивания перевиваемых линий клеток
- Хранение клеток в жидком азоте и восстановление их после криоконсервации
- Создание и аттестация посевных и рабочих банков перевиваемых линий клеток обезьян
Перфузионный способ дезагрегации паренхиматозных органов
Способ перфузионной дезагрегации является наиболее эффективной модификацией ферментативного расщепления тканей паренхиматозных органов с целью получения культур клеток. Он основан на введении рас творов диспергентов непосредственно в кровеносную сеть диспергируе мого органа. При этом достигается практически полное удаление фор менных элементов крови и осуществляется одновременное воздействие диспергента на всю паренхиму органа. Последнее обстоятельство позво ляет резко сократить время дезагрегации и увеличить количество свеже изолированных клеток с высокими ростовыми потенциями [24,25,32,37,38,260,277,314]. В ряде случаев расщепление тканей органов удается провести полностью с помощью только перфузионного метода [26,94,115,142,248,313]. Однако чаще его используют для предваритель ной обработки ткани, а завершают процесс дезагрегации с помощью ру тинных методов [23,53,86, 142,308,310]. В связи с тем, что разработка перфузионной дезагрегации почек обезьян являлась предметом наших исследований, то различные способы перфузионной обработки этого органа будет описаны более подробно. Идея использования перфузионной обработки почек обезьян in situ раствором трипсина с целью получения первичных культур клеток была предложена Л.Л.Мироновой [39] и H.Kammer [184]. Однако описанные авторами методики не позволяли завершить процесс дезагрегации почек без использования рутинных методов трипсинизации и не обеспечивали получение высоких выходов клеток. Дальнейшее развитие перфузионного способа дезагрегации почек было связано с усовершенствованием методики, а именно: подбором оптимальных режимов перфузии и состава диспергентов. А.Н.Курносов с сотрудниками [24,25,26,53] предложили следующую модификацию перфузионной трипсинизации почек животных: почки экстирпировали вместе с ренальным участком брюшной аорты, не повреждая целостности почечных капсул.
В культуральном боксе проводили продольный разрез аорты и непосредственно в почечные артерии нагнетали подогретый до 37С 0,25%-ный раствор трипсина. Перфузию продолжали до появления четко различимых разрывов в паренхиме органа. Для удаления остатков фермента почки промывали раствором Хенкса. После этого почки освобождали от капсул, разрезали на крупные куски и дезагрегировали в питательной среде на магнитном размешивателе или гомогенизаторе. По данным авторов, использование указанного способа дезагрегации почек поросят и телят позволило более чем в 2,5 раза увеличить выходы жизнеспособных клеток на 1 г ткани по сравнению с рутинным способом трипсинизации - (80,1±4,3)х106 клеток против (28,7±2,6)х106 клеток. К.М.Малышевой с сотрудниками [37,38] была описана модификация перфузионной обработки почек поросят, позволяющая полностью завершить процесс дезагрегации без использования рутинной трипсинизации. Изолированные почки отмывали от крови раствором Дульбекко без Са и Mg . Затем в органы нагнетали диспергирующие растворы - сме си, содержащие 0,05% -ный раствор трипсина и 0,005%-ный раствор кол-лагеназы или 0,02%-ный раствор химопсина и 0,05%-ный раствор колла-геназы. По окончании перфузии действие ферментов ингибировали путем прокачивания через почки 0,5%-го раствора гидролизата лактальбумина с 20% сыворотки крупного рогатого скота. После этого корковое вещество почек слущивали в колбу с питательной средой и размешивали на магнитной мешалке для получения гомогенного концентрата клеток. Выходы жизнеспособных клеток на 1 г ткани составляли (400-420)х10 клеток и (250-270)х106 клеток при использовании первой и второй диспергирующих смесей соответственно. Выход клеток при рутинной обработке 0,25%-ным раствором трипсина составлял всего (26-56)х106 клеток на 1 г ткани. Исследователи, применявшие метод перфузионной дезагрегации тканей для получения первичных культур клеток, отмечали, что культуры не отличались по исследованным характеристикам, в том числе и по чувствительности к вирусам, от культур, приготовленных с помощью рутинных методов трипсинизации [23,24,37,53,184,308,310]. Начало массовой вакцинации против вирусных заболеваний человека в 1950-х годах дало толчок для развития методов крупномасштабного культивирования свежеизолированных клеток человека и животных. Прямой перенос методических приемов и оборудования, применяемых в микробиологической промышленности, для культивирования клеток эу-кариотов оказался неприемлемым. Потребовалась разработка специального оборудования и способов культивирования клеток в промышленных масштабах. В результате исследований были разработаны несколько основных способов культивирования различных типов субстрат-зависимых клеток человека и животных: -ростовая поверхность с клетками и питательная среда находятся в статическом положении - стационарное культивирование; -ростовая поверхность с клетками вращается, питательная среда находится в "статическом" состоянии - роллерное культивирование; -ростовая поверхность с клетками находится в статическом положении, питательная среда прокачивается через нее - культивирование на колонках, полых волокнах, керамических картриджах [98,102,117, 147, 157,158,162,208,257,311,312]; -ростовая поверхность
Все приведенные выше способы культивирования с разной степенью эффективности и надежности могут быть использованы для выращивания первичных клеток животных. В производственных условиях для получения первичных культур-продуцентов широко применяют стационарный и роллерный способы культивирования. В культуральных сосудах, применяемых при этих способах выращивания, не удается добиться высокого соотношения "поверхность роста/объем культурального сосуда" из-за необходимости использовать относительно большие объемы среды роста [36,233,279]. В то же время стационарное и роллерное культивирование не требуют сложного технического и аппаратурного обеспечения и позволяют стабильно получать первичные культуры клеток. Кроме того, эффективность этих методов культивирования удалось повысить за счет применения новых модификаций культуральных сосудов, которые имеют повышенное отношение ростовой поверхности к объему. Так, многолот ковые системы Cell Factory (Nunc) могут быть соединены в различных комбинациях и обеспечивать ростовую поверхность от 600 см до 24000 см2 [278]. Модифицированные роллерные бутыли с кольцевыми выростами (2Х-роллеры) имеют ростовую поверхность в 2 раза больше по сравнению с обычными роллерами. Для выращивания первично-трипсинизированных клеток разных видов животных может быть использован псевдосуспензионный способ культивирования на микроносителях. Так, A.van Wezel [308] культивировал первичные клетки почек обезьян и собак на микроносителе ДЭАЭ-сефадекс А-50 в биореакторах с рабочим объемом 40-135 л при изготовлении вакцин против полиомиелита и бешенства соответственно. На 7-8 сут инкубирования концентрация клеток достигала 1x106 кл/мл, а индекс пролиферации культур составлял 8-10. Вирусы полиомиелита накапливались в псевдосуспензионных культурах в высоких титрах — 8,1-8,3 lg ТЦД50/МЛ, а вирус бешенства - до 6,0 lg ИД5о/мл. Хорошие результаты были получены и при культивировании вторичных и третичных культур клеток почек животных в биореакторах емкостью до 650л [308].
Способы выращивания перевиваемых линий клеток
Все способы культивирования, приведенные в разделе 1.2, успешно применяют для выращивания перевиваемых линий клеток человека и животных. Некоторые ПЛК способны расти также в условиях суспензии (гибридомы и адаптированные к росту в суспензии варианты субстрат-зависимых культур).
Мы не будем останавливаться на рутинных способах стационарного и роллерного культивирования ПЛК, а также выращивания их в условиях суспензии. Вопросы, связанные с применением суспензионного метода культивирования ПЛК для получения биопрепаратов, детально освещены в ряде обзоров [5,148,213, 225,243,254,294].
Развитие промышленных способов культивирования субстрат-зависимых ПЛК связано с разработкой биореакторов с увеличенной площадью для прикрепления и роста клеток. В дальнейшем усовершенствование культуральных сосудов, применяемых при этих способах культивирования, позволило увеличить соотношение их площади ростовой поверхности к объему и повысить концентрацию клеток на единицу объема питательной среды. Были разработаны пластинчатые системы [103,231], системы на основе макро- и микроформенных трубок [147], системы насадочного типа [158,282], системы на основе плотных или пористых керамических матриксов [225].
Одними из первых были использованы перфузионные биореакторы с наполнителями в виде стеклянных шариков [102,311], трубок [162], стальных спиралей [208]. Главными недостатками реакторов насадочного типа являлись неравномерность распределения клеток в разных частях слоя наполнителя, сложность поддержания асептических условий при заборе проб наполнителя, нерепрезентативность самих проб, невозможность проведения визуального контроля культуры в процессе инкубирования (только по косвенным признакам, например, по скорости потребления питательных веществ или накопления продуктов клеточного метаболизма), относительно невысокая конечная концентрация клеток, невозможность обеспечивать стандартную множественность заражения клеток вакцинными штаммами вирусов при крупномасштабном выпуске препаратов.
Так, при внесении посадочной взвеси клеток линии Vero через нижнюю часть реактора при высоте слоя наполнителя всего 20 см (стеклянные шарики диаметром 3 мм) распределение клеток в нижней и верхней частях слоя составляло 1,3х105 кл/см2 и 0,55х105 кл/см2 соответственно, а количество выросших клеток на 1 кг наполнителя - 4,4x108 клеток [158]. При использовании шариков с диаметром 5 мм и подачей клеточной взвеси через боковые стороны реактора удалось добиться более равномерного распределения клеток по слою наполнителя и увеличить количество выросших клеток до 9,3x10 кл/1 кг. J.Whiteside и R.Spier [311] выращивали клетки линии ВНК-21 и 4 штамма вируса ящура в реакторах насадочного типа с рабочими объемами 0,1, 1,0, 10,0 и 100,0 л. Наполнителем служили стеклянные шарики диаметром 3 мм. Посевная доза клеток во всех случаях составляла 100x103 кл/мл, скорость тока жидкости - 2 см/мин. В качестве контроля были использованы флаконы Ру с площадью роста 200 см . Динамику накопления клеточной и вирусной биомассы оценивали по изменению в питательной среде концентрации глюкозы и лактатдегид-рогеназы соответственно.
Урожай клеток в пересчете на 1 мл использованной питательной среды был максимальным в 1,0-л реакторе и составлял 1,33x106 кл. В 10,0-л реакторе этот показатель, как и во флаконах Ру, составлял 1,05x106 кл. В то же время общий урожай клеток из одного 10,0-л реактора, по утверждению авторов, был равен урожаю клеток, полученному из 100 флаконов Ру. Штаммы вируса ящура С Noville, Oi BFS1860, SAT3 Вес 1/65 и А22 Greece 1/72 накапливались в культуральной жидкости практически в одинаковых титрах как в реакторах, так и во флаконах Ру. Исключение составил штамм Oi BFS1860, который при выращивании в 100,0-л реакторе накапливался в титре 6,4 Ig БОЕ/мл против 7,0-7,5 lg БОЕ/мл в реакторах меньшего объема и во флаконах Ру.
A.Thomson et al [292] использовали лабораторный вариант этого реактора для выращивания вируса краснухи в клетках линии Vero. Объем циркулирующей среды роста (Игла MEM с 10% сыворотки эмбрионов коров) составлял 1 л. Посадочная доза составляла 108 клеток в 150 мл среды роста. Культуру заражали вирусом ( 108 ТЦЦ5о в 150 мл среды поддержки), когда концентрация глюкозы в среде роста снижалась до 4 мМ/л. Через каждые 24 часа собирали вируссодержащую жидкость. На 4-6 сутки инкубирования содержание инфекционного вируса в жидкой фазе культуры составляло 6,7-6,8 Ig ТЦД5(/мл, а общий урожай вируса -10,3 lg ТЦЦ50. Сходные данные были получены и при использовании линии ВНК-21. По данным авторов, для получения такого количества вирусной биомассы на клетках линий Vero и ВНК-21, потребовалось бы не менее 20 роллерных бутылей
В качестве наполнителя были использованы также пористые стеклянные и желатиновые носители [195,226]. Так, B.Griffiths и D.Looby [158] сообщили, что общая ростовая поверхность пористых стеклянных шариков диаметром 5 мм (диаметр пор 60-300 мкм) на два порядка превышала ростовую поверхность сплошных шариков такого же размера на единицу объема наполнителя - 74,0 м /л и 0,7 м /л соответственно. Максимальная концентрация клеток линии Vero при выращивании на пористых наполнителях достигала 14,0x106 клеток против 1,5x106 клеток на сплошных шариках на 1 мл объема наполнителя.
Хранение клеток в жидком азоте и восстановление их после криоконсервации
Криоконсервирование как первично-трипсинизированных, так и перевиваемых клеток проводили по стандартной схеме: охлаждение со скоростью 1С/мин до (-70)С, затем ампулы погружали в жидкий азот. Концентрация клеток в среде для заморозки составляла (2-10)х106 кл/мл. Для криоконсервирования использовали следующие смеси: а) среда Игла MEM (80%) + СКРС (10%) + глицерин (10%) (линии 455 и 4647); б) среда Игла MEM (80%) + сыворотка эмбрионов коров (10%) (Sigma) + DMSO (10%) (линия Vero); среда ГЛАХИ (80%) + СКРС (10%) + глицерин (10%) или DMSO (10%) (первично-трипсинизированные клетки почек зеленых мартышек). Реконсервацию клеток проводили на водяной бане при 37С. Долю жизнеспособных клеток определяли как отношение числа клеток, невосприимчивых к красителю (1%-ый раствор трипанового синего), к общему числу клеток в анализируемом образце и выражали в процентах. Препараты для рутинного цитогенетического обследования перевиваемых линий клеток 455, 4647 и Vero готовили по общепринятой методике [220]. Для определения модального класса и интервала изменчивости по числу хромосом в перевиваемых линиях клеток 455, 4647 и Vero анализировали по 100 метафазных пластинок на разных уровнях пассажей культур. При цитогенетическом изучении культур был использован метод сестринских хроматидных обменов (СХО). Предварительно клетки выращивали в среде Игла с 10% СКРС. 5-бромдезоксиуридин (5-БДУ) (Serva, ФРГ) в дозе 10 мкг/мл добавляли в первичную культуру клеток почек зеленых мартышек на 33 час, в случае линий 455 и 4647 соответственно на период 36 час и 34 час в стадии активного роста. Обработку колцемидом (8егуа,ФРГ) в дозе 0,05 мкг/мл проводили в течение 3 час перед фиксацией. Препараты хромосом получали стандартным сухо-воздушным способом. Дифференциальную окраску сестринских хроматид осуществляли по методу А.Н.Чеботарева и др. [78]. Для выявления ядрышкообразующих районов (ЯОР) хромосом использовали модификацию метода дифференциального серебрения [150]. Препараты, полученные стандартным сухо-воздушным способом, помещали на 7-10 сут в термостат при 37С. Затем инкубировали в 60%-ом растворе AgN03 (рН 4,0) при 37С в течение 16-18 час. По окончании инкубации препараты промывали дистиллированной водой, высушивали и подкрашивали 1-2 мин 1%-ным раствором красителя Романовского-Гимза. С целью выявления признаков специфической и неспецифической дегенерации исследовали цитоморфологию клеток в нативных культурах и на фиксированных препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, азуром и эозином, красителем Гимза,. Препараты с клеточным монослоем получали на кусочках покровных стекол, помещенных в пенициллиновые флаконы.
Клетки на 2-3 сут культивирования отмывали от остатков среды роста раствором Хенкса и фиксировали смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (4:1) в течение 20-30 мин. Окрашивание красителями проводили по общепринятым методикам. Нативные и фиксированнные препараты клеток исследовали в инвертированном микроскопе МБИ-6, ЛЮМАМ-ИЗ. Цейтраферную микросъемку осуществляли на микроскопе МБИ-13 при фазовоконтрастном объективе 60х. Использовали кинопленку типа А-2. Интервал между кадрами составлял 30-90 секунд. При электронномикроскопическом изучении культур клеточные взвеси центрифугировали при 3-5 тыс об/мин в течение 10 мин. Полученные осадки последовательно фиксировали в 2,5-3,0%-ном растворе глу-тарового альдегида и 1-2%-ном растворе OsC 4, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заключали в смесь эпона с аралдитом. Срезы клеток, полученные на ультрамикротоме "ЛКБ-14", контрастировали цитратом свинца и раствором уранилацетата. Анализировали в электронном микроскопе "JEM-100В" при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 3000-20000х. При изучении культур с помощью растрового электронного микроскопа клетки выращивали на покровных стеклах в течение 1 суток при 37С. Затем культуры промывали раствором Хенкса и фиксировали в 2%-ном растворе глутарового альдегида на 0,1 М натрий-какодилатном буфере с добавлением 0,1 М сахарозы. Клетки обезвоживали в серии водных растворов ацетона восходящей концентрации и высушивали методом перехода критической точки из жидкого СОг в специальном аппарате (Barzers Union, Лихтенштейн). Препараты покрывали слоем сплава золото-палладий методом ионного напыления (Polaron Equipment, Великобритания). Культуры исследовали в растровом электронном микроскопе PSEM-501 (Phillips, Нидерланды). Контроль клеток линий 455, 4647 и Vero на наличие посторонних агентов, стерильность и туморогенность проводили в полном соответствии с Методическими указаниями МЗ РФ по аттестации перевиваемых линий клеток [49] и Требованиями ВОЗ к клеточным субстратам, применяемым при производстве МИБП [316,318]. Кроме регламентированных методов контроля культур клеток на безопасность были проведены еще дополнительные тесты. Для определения активности обратной транскриптазы собирали культуральные жидкости клеток линий 455 и 4647.
После охлаждения до 4С их осветляли при 10000 об/мин в течение 15 мин, затем надосадочные жидкости центрифугировали при 27000 об/мин в течение 2,5 ч. Полученные осадки ре-суспендировали в буфере STE (рН 7,4-7,6), получая 1000-кратные концентрат, которые исследовали в полимеразной цепной реакции. Культивирование клеток линий 455 и 4647 в полужидком агаре или агарозе проводили по методу I.Macpherson, L.Montagnier [199]. В качестве положительного контроля использовали клетки линий KB и HeLa, отрицательным контролем служили клетки линий М-22 и 5018. Посадочная концентрация всех типов клеток составляла 50x103 кл/мл. Клетки инкубировали при 37С в течение 35 сут. Обработку клеточного материала и выявление зон локализации глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) проводили с помощью электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле [77].
Создание и аттестация посевных и рабочих банков перевиваемых линий клеток обезьян
Линия 4647 была установлена проф. Л.Л.Мироновой с сотрудниками из почек здоровой взрослой зеленой мартышки, прошедшей 42-дневиый карантин [41]. Линия 455 установлена нами из селезенки взрослой зеленой мартышки 455, прошедшей 42-дневный карантин. Первичная клеточная взвесь была получена с помощью разработанной нами перфузионной трипсинизации органа. На уровне 13 субпассажа клеток первичной культуры в 2-х культуральных сосудах началась деструкция и гибель клеток. Через 35 суток в них обнаружили островки эпи-телиоподобных клеток. Эти клетки дали начало линии 455. Нами были созданы криобанки клеток линий 4647 и 455 на уровне 90 и 45 пассажей соответственно. Криобанк клеток линии 4647 насчитывает 275 ампул, линии 455 - 350 ампул. Содержание клеток в одной ампуле составляет 5x106 кл/мл. Банки клеток были обследованы согласно требованиям ВОЗ к клеточным субстратам, разрешенным для использования при изготовлении МИБЩ316]. В результате комплексных исследований, выполненных совместно с сотрудниками ОБТК ФГУП "ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН", были получены основные характеристики клеток банков линий 4647 и 455. Было установлено, что при строгом соблюдении режима криокон-сервирования доля жизнеспособных клеток после восстановления из жидкого азота для банка линии 4647 составляла 82,0 ±3,4 (%), для банка линии 455-92,1 ±2,7 (%). Показано, что клетки обеих линий обладают высокой пролифера-тивной активностью при выращивании на разных питательных средах, обогащенных 5-10% сыворотки КРС. Формирование монослоя происхо-дит на 3-4 сутки культивирования при посевной дозе (30-50)х10 кл/см . Максимальный урожай клеток на разных уровнях пассажей практически не изменяется и составляет для линии 4647 (125,2±6,9)х103 и (137,4±7,8)х103 кл/см2, а для линии 455- (110,3± 4,7)х103 и (120,1±3,4)х103 кл/см2 соответственно при стационарном и роллерном способах культи- вирования. Данные, полученные при культивировании клеток линии 4647 на микроносителях, приведены ниже (см. раздел 5.1).
Показано, что клеточный слой линии 4647сохраняется на стекле без смены культуральной жидкости до 2 месяцев, а под агаровым покрытием — до 1 месяца. Для линии 455 аналогичные показатели составляли 1 месяц и 20 суток. При гистологическом изучении линий 4647 и 455 на разных уровнях пассажей установлено, что клеточные пласты состоят из полигональных эпителиоподобных клеток, содержащих округлые ядра с 1-3, редко с 4-мя ядрышками. На фоне однородной популяции встречаются небольшие вкрапления вытянутых веретеновидных клеток. Цитоплазма клеток не вакуолизирована. Многослойный рост клеток не отмечен. Цитоплазматических и внутриядерных включений и других признаков контаминации клеток обеих линий не выявлено. Электронномикроскопическое изучение клеток линий 4647 и 455, проведенное совместно с С.Г.Соболевым, показало, что имеются две основные разновидности клеток. Одна из них - удлиненные веретеновид-ные клетки с крупным ядром, повторяющим форму клетки. Вторая разновидность - округлые эпителиоподобные клетки с довольно крупным ядром, имеющим изрезанные контуры. В клетках обеих разновидностей отмечали выраженную лизосомную реакцию. В некоторых клетках скопления лизосом сочетались с морфологическими признаками повреждения цитоплазмы.
При обследовании банков посевных клеток линий 4647 и 455 на ранних и поздних уровнях пассажей с помощью метода растровой электронной микроскопии различий в морфологии клеток не выявлено. Культуры представлены эпителиоподобными и фибробластоподобными клетками. Клетки обоих типов равномерно уплощены, у некоторых из них центральная часть более выпукла. Поверхность большинства клеток сглажена, хотя встречались клетки с редкими микроворсинками и мелкими складками, равномерно расположенными на всей поверхности или в центральной ее части. Таким образом, установлено, что клетки посевных банков линий 4647 и 455 имеют морфологию, свойственную нормальным эпителиопо-добным и нормальным фибробластоподобным клеткам, и по этому параметру их можно рассматривать как минимально трансформированые [7]. Контаминация клеток посторонними агентами не выявлена ни в одном из препаратов, обследованных электронномикроскопически. Кариологический анализ клеток посевного банка линии 4647, проведенный на разных уровнях пассажей (90-130 пассажи), показал, что 44-48% клеток являются тетраплоидными, 34-40% - гиперплоидными, 10-16% - диплоидными, 4-6%-гиподиплоидными. В случае линии 455 модальное число хромосом на обследованных уровнях пассажей (45-90 пассажи) составляет 110, доля тетраплоидов -36,0-40,2; гиперплоидов - 58,2-62,7; диплоидов - 4,0-6,3 (%). Изоферментная характеристика клеток банков линий 4647 и 455 на разных уровнях пассажей, полученная при анализе электрофоретической подвижности лактатдегидрогеназы (ДЦГ) и глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ), была специфичной для клеток зеленых мартышек. Г-6-ФДГ обладала подвижностью типа А (быстрая форма), а ЛДГ имела 5 изоформ, свойственных клеткам этих животных. При проведении тестирования проб культуральных жидкостей, отобранных на разных уровнях пассажей клеток банков линий 4647 и 455, на стерильность путем высева на соответствующие селективные среды, контаминации культур бактериями, грибами и микоплазмами не выявлено. Тесты на наличие микоплазм с использованием флуоресцентного красителя Hoechst-33258 во всех обследованных образцах культур, приготовленных из клеток банков линий 4647 и 455, были отрицательными. В связи с тем, что контаминация микоплазмами представляет серьезную проблему при работе с постоянными линиями клеток, было проведено тщательное обследование клеток банков линий 4647 и 455. Препараты клеток и пробы культуральных жидкостей были тестированы на наличие контаминации микоплазмами с использованием флуоресцентного красителя Hoechst - 33258, электронномикроскопического обследования клеток и высевом культуральной жидкости на селективную среду. При анализе в люминесцентном микроскопе окрашенных Hoechst-33258 препаратов клеток линий 4647 и 455 в цитоплазме некоторых из них изредка встречаются светящиеся гранулы. Для того, чтобы исключить сомнения относительно природы этих частиц, была проведена обработка клеток антибиотиками, являющимися, по данным литературы [57,118,221,270,272,298,303], высокоэффективными при деконтаминации культур клеток от микоплазм: ВМ-циклином (BM-Cyclinl и BM-Cyclin2) и ципрофлоксацином. Опыты проводили по следующим схемам:
