Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Классификация, структура и свойства вируса бешенства .13
1.1.1 Классификация лиссавирусов 13
1.1.2 Морфология и структура вируса бешенства 17
1.1.3 Репродукция вируса бешенства 18
1.2 Эпизоотологические особенности бешенства 21
1.2.1 Ситуация с бешенством в РФ 21
1.2.2 Бешенство в других странах мира .25
1.3 Диагностика бешенства 28
1.3.1 Метод флуоресцирующих антител и его аналоги 29
1.3.2 Выделение вируса бешенства как метод диагностики 31
1.3.3 Серологические методы диагностики 32
1.3.4 Молекулярные методы диагностики и исследования 34
1.4 Профилактика бешенства у человека и животных 35
1.4.1 Штамммы вирусов бешенства, применяемые при производстве антирабических вакцин 36
1.4.2 Антирабические вакцины 41
1.4.3 Рекомендации к антирабическим вакцинам .47
1.4.4 Адъюванты для антирабических вакцин 48
Глава 2. Собственные исследования 51
2.1 Материалы и методы 51
2.1.1 Материалы 51
2.1.1.1 Вирусы 51
2.1.1.2 Культуры клеток 51
2.1.1.3 Референтные сыворотки 51
2.1.1.4. Экспериментальные животные 51
2.1.1.5 Адъюванты .51
2.1.1.6 Коммерческие ИФА наборы 51
2.1.1.7 Среды и растворы 52
2.1.1.8 Реагенты .52
2.1.1.9 Оборудование .53
2.1.2 Методы 53
2.1.2.1 Культивирование вируса бешенства штамм ERA-CB 20М .53
2.1.2.2 Культивирование штамма СVS-11 вируса бешенства .55
2.1.2.3 Титрование вируса в культуре клеток 56
2.1.2.4 Определение инфекционной активности вируса .57
2.1.2.5 Титрование вируса на белых беспородных мышах 57
2.1.2.6 Инактивация вируса бешенства штамм ERA-CB 20М .57
2.1.2.7 Определение контаминации бактериальной и грибной микрофлорой 57
2.1.2.8 Антигенные свойства .58
2.1.2.9 Определение титра антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови животных методом FAVN .58
2.1.2.10 Определение патогенности вируса для животных 62
2.1.2.11 Определение иммуногенной активности методом NIH на белых беспородных мышах 63
2.1.2.12 Индикация вируса бешенства .63
2.1.2.13 Выделение РНК 65
2.1.2.14 Получение кДНК .66
2.1.2.15 Проведение ПЦР 66
2.1.2.16 Очистка образцов из геля .68
2.1.2.17 Секвенирование 68
2.1.2.18Анализ результатов секвенирования 69
2.1.2.19 Статистическая обработка результатов 70
Глава 3. Результаты собственных исследований 71
3.1 Изучение культуральных свойств вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CВ 20М .71
3.1.1 Определение спектра наиболее чувствительной линии клеток для получения вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CB 20M 71
3.1.2 Количественное определение гликопротеина вируса бешенства .73
3.1.3 Оптимизация условий получения гликопротеина вакцинного штамма ERA-CВ 20М вируса бешенства 76
3.1.4 Определение оптимальных условий инфицирования клеток и способов культивирования вакцинного вируса штамм ERA-CВ 20М .80
3.1.5 Изучение иммунобиологических свойств вакцинного вируса бешенства штамм ERA-СВ 20М 81
3.1.6. Изучение нейровирулентных и патогенных свойств штамма ERA-CB 20M вируса бешенства 85
3.1.7 Изучение антигенных свойств вакцинного вируса бешенства штамм ERA-CB 20M в опытах на лабораторных и диких животных 91
3.1.8 Определение иммуногенной активности вакцины из штамма ERA-CB 20M 91
3.1.9 Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов N- и G – белка штамма ERA-СВ 20М вируса бешенства 92
3.2 Разработка экспериментальной серии вакцины против бешенства из штамма ERA-CB 20M вируса бешенства 95
3.2.1 Подбор адъюванта 95
3.2.2 Изготовление экспериментальных образцов антирабических вакцин для собак и кошек 98
3.2.3 Оценка безвредности, антигенной активности и стабильности вакцин «РАБИКС» и «РАБИФЕЛ» в лабораторных условиях 99
3.2.3.1 Определение внешнего вида и цвета 99
3.2.3.2 Определение стерильности .100
3.2.3.3 Определение безвредности и реактогенности .100
3.2.3.4 Определение иммуногенной активности 101
3.2.3.5 Определение антигенной активности вакцины «Рабикс» 102
3.2.3.6 Определение антигенной активности вакцины «Рабифел» 103
3.2.3.7 Оценка антигенной активности вакцины «Рабикс» на естественно-восприимчивых животных 104
3.2.3.8 Оценка антигенной активности вакцины «Рабифел» на естественно-восприимчивых животных .105
3.2 Разработка ИФА-тест системы для первичного скрининга полученных пулов культурального вируссодержащего материала из штамма ERA-CB 20M вируса бешенства 106
3.2.1 Разработка тест системы ИФА на основе МКА 1С5 для определения G- белка в вакцинных полуфабрикатах 106
3.2.2 Сравнительное определение белка методом ИФА с зарубежными аналогами иммуноферментного анализа для определения гликопротеина 108
3.2.3 Анализ зависимости значения количества гликопротеина методом ИФА от индекса иммуногености вакцинного препарата методом NIH .111
4. Обсуждение 114
Выводы 125
Практические предложения .126
Список литературы
- Репродукция вируса бешенства
- Штамммы вирусов бешенства, применяемые при производстве антирабических вакцин
- Определение инфекционной активности вируса
- Оценка безвредности, антигенной активности и стабильности вакцин «РАБИКС» и «РАБИФЕЛ» в лабораторных условиях
Введение к работе
Актуальность темы. Бешенство – это острое нейровирусное заболевание, передаваемое человеку через укусы лисы, собаки, волка и других плотоядных животных, среди которых в естественной среде обитания вирус распространяется также при укусах. Мишенью вируса является центральная нервная система. Вирус бешенства (ВБ) принадлежит к отряду Mononegavirales, семейству Rhabdoviridae, роду- Lyssaviruss и является единственным из царства Vira, поражающим всех теплокровных животных, в том числе и человека со 100 % летальностью (Грибенча С.В., 2008; Львов Д.К. с со-авт., 2013 и др.). Глобальный характер распространения и многогастальность рабической инфекции привели к формированию большого разнообразия вариантов ВБ: бешенство лис, собак, арктическое бешенство, бешенство скунсов, енотов, мангуст, летучих мышей и др., а также их биологических субвариантов (Львов Д.К. с соавт., 2008 и др.). Так, по оценке Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), бешенство входит в пятерку инфекционных болезней, общих для человека и животных, наносящих наибольший социальный и экономический ущерб (Бюллетень ВОЗ, 2009). В РФ бешенство регистрируется в 63 регионах страны, представляя собой серьезную угрозу как для животных, так и для человека. С ростом числа бездомных собак и кошек возрастает и число случаев обращения людей за антирабической помощью. Для профилактики бешенства у человека и животных разработаны и используются инактивированные культуральные вакцины против бешенства, а также живые оральные вакцины, которые применяются только для диких животных. При этом основным показателем иммуногенности антираби-ческих вакцин является их способность индуцировать у иммунизированных животных синтез антирабических вируснейтрализующих антител. Поэтому решающим условием разработки вакцин является подбор такого сочетания штамма вируса и адъюванта, который позволит стимулировать у вакцинированных животных напряженный и длительный антирабический иммунитет. Сложная эпизоотическая ситуация по бешенству в РФ требует разработки
новых, более высокоиммуногенных вакцин. В связи с этим весьма актуальными представляются исследования, направленные на изучение различных штаммов ВБ и разработку технологии приготовления антирабических вакцин с использованием адъювантов нового поколения.
Цель исследования: изучить иммунобиологические свойства вакцинного штамма ERA-CВ 20М вируса бешенства и разработать на его основе антирабическую вакцину.
Задачи исследования:
-
Изучить спектр чувствительности различных линий клеток к вакцинному штамму ERA-CВ 20М вируса бешенства.
-
Определить оптимальные условия культивирования вируса бешенства штамм ERA-CВ 20М in vitro.
-
Изучить нейровирулентные свойства и патогенность вакцинного штамма ERA-CВ 20М вируса бешенства для животных при различных способах введения.
-
Изучить антигенные свойства вируса бешенства штамм ERA-CВ 20М в опытах на естественно-восприимчивых животных.
-
Изучить иммуногенные свойства вируса бешенства штамм ERA-CВ 20М на белых беспородных мышах методом NIН.
-
Провести молекулярно-генетический анализ штамма ERA-CВ 20М вируса бешенства.
-
Приготовить экспериментальные серии культуральной инактивиро-ванной вакцины на основе штамма ERA-СВ 20М вируса бешенства в комбинации с различными адъювантами: ГОА и Abisco R-100.
-
Разработать иммуноферментную тест-систему (ИФА) на основе мо-ноклональных антител (МкА) 1С5 для оценки содержания гликопротеина (G-белка) ВБ в вируссодержащей культуральной жидкости.
Научная новизна работы. Впервые для получения нового вакцинного вируса бешенства был использован новый принцип селекции, основанный на определении количественного уровня синтеза гликопротеина – главного
иммуногена вируса бешенства. Впервые определен спектр чувствительных культур клеток для репликации вакцинного штамма ERA-CВ 20М вируса бешенства и разработаны оптимальные условия культивирования вакцинного вируса. Определена патогенность вируса бешенства штамма ERA-CВ 20М.
Впервые дана характеристика биологических свойств штамма ERA-CВ 20М вируса бешенства. Изучены антигенные и иммуногенные свойства вируса штамма ERA-CВ 20М на различных видах животных: мышах, песцах, собаках и кошках. Впервые проведен филогенетический анализ фрагментов генов N и G вакцинного штамма ERA-CВ 20М вируса бешенства. Установлено отличие от референтного штамма SAD1 по первичной структуре РНК на 10% и 15% соответственно.
Практическая значимость работы. В рамках выполненной работы на основе нового принципа селекции из популяции вируса бешенства штамм ERA получен новый вакцинный вирус штамм ERA-CВ 20М с наиболее высоким уровнем синтеза G-белка, на базе которого разработана новая высо-коиммуногенная антирабическая вакцина для ветеринарного применения.
Разработана технология изготовления антирабической вакцины из ВБ штамм ERA-CВ 20М с использованием нового иммуностимулирующего комплекса Abisco R-100 в качестве адъюванта. Для оценки поствакцинального антирабического иммунитета у животных внедрён флуоресцентный ви-руснейтрализующий тест (метод FAVN), рекомендованный ВОЗ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Наиболее пригодной для производства инактивированной культуральной
антирабической вакцины из штамма ERA-CВ 20М вируса бешенства является
перевиваемая линия клеток почки сирийского хомячка (ВНК-21-13С).
2. Способ селекции вакцинного штамма ВБ по уровню синтеза поверхностно
го гликопротеина (G-белка).
3. Созданные на основе штамма ERA-CВ 20М экспериментальные серии
вакцины против бешенства в комбинации с современным адъювантом Abisco
R-100 полностью отвечают требованиям, предъявляемым к антирабическим вакцинам.
4. Разработанная на основе МкА 1С5 иммуноферментная тест-система пригодна для контроля G-белка ВБ при производстве антирабических вакцин.
Апробация работы. Результаты исследований представлены и обсуждены на: Международном семинаре на базе Кубанского Аграрного Университета «Современные аспекты в диагностике и профилактике бешенства согласно требованиям ВОЗ» (г. Краснодар, 2011); ХIХ и ХХI Московском Международном Ветеринарном Конгрессе (г. Москва, 2011, 2013); Международной научно-практической конференции «Современные методы диагностики и средств профилактики бешенства» (г. Санкт-Петербург, 2012); Международном Семинаре по вопросам контроля и борьбы с бешенством, (г. Санкт-Петербург, 2012); Rabies Serology Meeting ANSES (Нанси, Франция, 2013).
Публикации научных работ. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 5 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК при Минобрнауки РФ.
Личный вклад соискателя. Все экспериментальные и теоретические исследования по теме диссертации проведены лично соискателем. Молеку-лярно-биологические исследования и эксперименты по оценке эффективности вакцинных препаратов на животных выполнены совместно с сотрудниками отдела прикладной вирусологии и биотехнологии ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского». Все материалы, представленные в диссертационной работе, обобщены и проанализированы лично автором.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 137 стр. машинописного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 26 таб-
Репродукция вируса бешенства
Ежегодно в мире после укусов животными, больными бешенством, погибает от 55 000 до 70 000 людей, половина из которых дети [1, 13]. В 2011г. в РФ от бешенства погибло 13 человек, в т. ч. девятилетняя девочка из Подольского района Московской области, укушенная бездомной кошкой, больной бешенством [20].
В Российской Федерации за многолетний период эпидемиологического наблюдения бешенство среди людей можно охарактеризовать как инфекцию с циклическими колебаниями с промежутками в 2-3 года. С начала 70-х годов в нашей стране ежегодно регистрируется от 4-х до 22-х случаев заболевания. На протяжении последних лет наблюдается тенденция к росту показателей заболеваемости[9].
В 2008 году среди населения Российской Федерации было зарегистрировано 17 случаев бешенства в 10-ти субъектах страны, что в 2,1 раза больше по сравнению с 2007 годом. Самыми неблагополучными являются Южный и Центральный федеральные округа. За 11 месяцев 2009 г. в Российской Федерации зарегистрировано 10 случаев бешенства. За январь – февраль 2010 отмечено 4 случая бешенства: по 1 случаю в Республиках Дагестан, Калмыкия, Астраханской и Челябинской областях [20].
Ежегодно в России антирабическую помощь получают от 250 до 450 тысяч человек, пострадавших от укусов животных, из которых каждый четвертый - ребенок.
Показатель обращаемости за антирабической помощью в 2008 году составил в целом по стране 304 на 100 тысяч населения. Наиболее неблагоприятная ситуация, где показатели существенно превышали аналогичные уровни по Российской Федерации, складывалась в республиках Северная Осетия-Алания и Хакасия, Астраханской области, Еврейской автономной области, Чукотском автономном округе, Республике Тыва, Кабардино-Балкарской Республике, Воронежской, Орловской, Калужской областях.
Городские жители составили 77,3%. В Московской области в 2008-2009 гг. в 7-ми населенных пунктах были зарегистрированы случаи нападений больных животных на группы людей с числом пострадавших от 8-ми до 14-ти человек.
Бешенство у животных
В многолетней динамике заболеваемости бешенством животных (лисица, енотовидная собака, волк, собаки, кошки и крупный рогатый скот) отмечается выраженная тенденция к росту со средним темпом 10% ежегодно. В последние годы инфекцию регистрировали в 63-х субъектах страны. Наиболее неблагополучными были регионы, входящие в Центральный и Приволжский федеральные округа. От укусов именно диких животных в 2008 году пострадало 7123 человека, что составило 1,6% от всех людей, обратившихся за антирабической помощью [9,10,14].
Только за январь-февраль 2010 года на территории РФ отмечено 796 (январь- 344, февраль – 452) случаев бешенства среди животных. Бешенство диагностировали у 397 лисиц, 3-х волков, 17 енотовидных собак, 2-х хорьков, 4-х корсаков, 2-х куниц, а так же у песца, белки и дикой кошки. Жертвами болезни стали 93 головы крупного рогатого скота и 7 голов мелкого рогатого скота, 14 лошадей, 168 собак и 86 кошек (по данным ФГУ «Центр ветеринарии» лаборатории эпизоотологии ВИЭВ) [20].
Эпизоотическая ситуация по бешенству на территории России, некоторых стран СНГ и Балтии в настоящее время проявляется эпизоотиями природного типа. Резервуаром вируса бешенства и основным источником на территории России являются дикие плотоядные и, прежде всего, лисицы, енотовидные собаки и волки, на Севере — песцы [9,19].
В государствах Закавказья, Средней Азии, южных областей Казахстана наличие природных очагов бешенства сочетается с проявлением энзоотии среди собак, корсаков [9,80].
Отдельным природным очагом называют наименьший по размерам участок земной поверхности, в пределах которого циркуляция возбудителя инфекции осуществляется без заноса из вне неопределенно долгий срок. При этом наблюдаются следующие друг за другом циклы подъема и спада эпизоотии. В морфологической структуре отдельно взятого очага выделяют ядро, зоны выноса инфекции и постоянно свободные от возбудителя участки. На территории ядра имеются наиболее благоприятные условия для циркуляции возбудителя, обеспечивающие относительно стойкое его сохранение. Иногда при обширном природном очаге может быть несколько ядер. В пределах очага выделяют участки выноса. В них возбудитель обнаруживается у носителей лишь в период подъемов энзоотии. Третий элемент отдельного очага это территории свободные от возбудителя в связи с непригодностью их для обитания хозяев вируса бешенства [31,33].
В природном очаге бешенства самостоятельная циркуляция вируса осуществляется в популяции диких плотоядных животных или в популяции кровососущих и насекомоядных летучих мышей.
По данным Россельхознадзора, за три квартала 2012 г. на территории РФ было выявлено 493 очага бешенства: заболело и пало диких животных — 52%, домашних — 35 %, (из них 12 % кошки), сельскохозяйственных — 13 % [9].Только за январь 2012 г. было зарегистрировано 23 случая бешенства в крупных городах в РФ, из них 6 — у кошек. (по данным лаборатории эпизоотологии ВИЭВ ФГУ «Центр Ветеринарии») .
Штамммы вирусов бешенства, применяемые при производстве антирабических вакцин
Важнейшим условием достижения перспективной цели – ликвидации бешенства – является последовательное проведение вакцинации диких животных ежегодно не менее двух раз при условии обеспечения протективного (защитного) уровня антирабических антител у 80-85% популяции животных в зоне вакцинации.
Аналогичная программа была успешно выполнена в странах Европейского союза, однако, от начала вакцинации диких животных в Бельгии, Люксембурге и Франции в 1986 г. до продвижения зоны вакцинации к восточным границам Польши, Словакии и Венгрии в 2006 г. прошло 20 лет.
В настоящее время для специфической профилактики бешенства используют большое количество разнообразных вакцин [3,16,26,53]. По репродуктивным системам они подразделяются на три типа: 1) вакцины с использованием нервной ткани взрослых млекопитающих (овцы, козы, кролики) или новорожденных млекопитающих (кролики, крысы, мыши); 2) вакцины с использованием тканей эмбрионов птиц, или так называемые авианизированные (утиные, перепелиные эмбрионы); 3) культуральные вакцины, когда вирус выращивают в культурах клеток (линии диплоидных клеток человека или в культурах клеток животного происхождения), 4) оральные вакцины для диких животных..
Очищенная вакцина, приготавливаемая из птичьих эмбрионов. Фиксированный вирус выращивают в оплодотворенных утиных, перепелиных яйцах и инактивируют -пропиолактоном. После очистки такая вакцина является достаточно иммуногенной и безопасной [16]. ДНК-вакцины.
Внутримышечная иммунизация бактериальной плазмидной ДНК, кодирующей гликопротеин вируса бешенства, защищает собак от летального экспериментального заражения уличным вирусом бешенства, выделенным от собак. Экспериментально были обнаружены ВНА против вируса бешенства и лиссавирусов генотипов 5 и 6, однако, против последних титр антител был низким [36,47].
В других экспериментах у собак более сильный иммунный ответ был после внутримышечного введения, тогда как у кошек - после внутрикожного. Сыворотка от собак, вакцинированных подкожно в мочку уха, защищала мышей от экспериментального заражения. Также у мышей одна доза ДНК вакцины была столь же эффективна, как 5 инъекций культуральной вакцины. Разнообразие методов рекомбинантных ДНК делает возможным получение химерных гликопротеинов лиссавирусов для защиты от многих штаммов в природе (т.е. мультивалентный препарат для диких зверей). Такие продукты могут быть вскоре лицензированы, особенно если одна доза эффективна [69].
Вакцины, приготавливаемые из ткани головного мозга - для приготовления инактивированных вакцин на основе нервной ткани может быть использован головной мозг ягнят или новорожденных мышей [4,16,32,39]. Такие вакцины оказались эффективными при массовых кампаниях вакцинации собак в Северной Африке (вакцина из головного мозга ягнят), а также в Латинской Америке и странах Карибского бассейна (вакцины, приготовленные из головного мозга мышей-сосунов). В странах Южной Америки для иммунизации собак широко применяют вакцину, получаемую из мозга мышей-сосунов, и ежегодно производят до 20 млн. доз такой вакцины. Систематическое ее применение на протяжении 10 лет в ряде стран привело к резкому снижению случаев бешенства среди собак [47].
Выбор новорожденных мышей был основан на отсутствии антигена миелина, который вызывал энцефаломиелит как негативный эффект ранних вакцин, полученных на нервной ткани. Метод производства вакцины из головного мозга мышей-сосунов по Fuenzalida-Palacios [6] был модифицирован с целью дальнейшего снижения содержания энцефалогенных субстанций в конечном продукте. Для этого использовали мышей, возраст которых во время заражения не превышал одного дня. По-прежнему рекомендуется центрифугирование ткани головного мозга при 17000g в течение 10 мин. Современные методы очистки вируса позволяют в вакцинах из головного мозга овец освободиться от мозговой ткани на 85-90% [32]. Тем не менее, вакцины, получаемые из нервной ткани, в отношении чистоты, активности, иммуногенности и безопасности не соответствуют современным требованиям [46,83].
Определение инфекционной активности вируса
Посевная концентрация на роллер (общий объем 2000 мл) составила 2х105 клеток\мл, при этом достижение 80-90% монослоя наблюдалось на 3 сутки культивирования в роллерной установке со скоростью 1,5 оборота\мин. В качестве поддерживающей среды была использована среда того же, что и ростовая среда состава, но с уменьшением процентного содержания сыворотки до 2%. На следующем этапе было проведено сравнительное исследование по определению оптимального субстрата (роллеры или культуральные флаконы – «матрасы») для культивирования и последующего заражения культуры клеток BHK-21. На момент заражения все культуры клеток были представлены в виде 75-85% монослоя. Для заражения был использован вакцинный штамм ERA-CВ-20М вируса бешенства (инфекционная активность lg 10 6,0 ТЦД 50/мл) с множественностью заражения 0,5 (табл. 10). Таблица 10
Сравнительная оценка количества гликопротеина нг/мл вируса бешенства при использовании различных видов субстрата для BHK-21.
Данные, представленные в таблице №10, наглядно демонстрируют преимущества роллерного культивирования вируса бешенства ERA-CВ 20М по сравнению с использованием культуральных флаконов (матрасов) и заражения на монослое клеток ВНК-21. После установления этих параметров была проведена работа по определению оптимальной множественности заражения, для чего нами было выбрано несколько значений
Полученные данные свидетельствуют о том, что оптимальной множественностью заражения является 0,5 - дальнейшее увеличение количества инфекционных частиц на клетку не приводило к увеличению количества гликопротеина в сборе; в тоже время уменьшение множественности значительно снижало выход белка в первых сборах.
При определении оптимального протокола заражения в первую очередь рассматривался вопрос о подборе оптимальной схемы сборов. В ходе выполнения исследований на эту тему было выявлено, что схема с использованием смены среды на 3, 6, 9, 12 сутки в сравнении со схемой 4, 7, 10, 13 не давала статистически достоверной разницы при определении количества гликопротеина в сборах. Кроме того, было показано, что оптимальным моментом для заражения является именно 80-90% монослой. Использование 50-70% монослоя (а также заражение в суспензию, то есть при пересеве клеток) сочеталось со значительным снижением выхода белка в первых сборах. Использование 100% монослоя в ряде случаев приводило к снижению общего числа сборов вируса. Так как вакцинный штамм ERA-CВ 20М размножается в культуре клеток без цитопатического действия (ЦПД), учитывали обнаружение вируса с помощью специфического изумрудно-зеленого свечения цитоплазматических включений (флуоресценции) вируса бешенства штамм ERA –CB 20M и вируса CVS-11 как в отпечатках мозга, так и в культуре клеток с использованием моноклонального ФИТЦ-конъюгата (фото 1-3).
Культивирование вируса штамм ERA-CВ 20М, проводили на перевиваемой линии клеток ПС (почка сайги) и ВНК-21 (почка сирийского хомяка). Эти линии клеток адаптированы к стационарному монослойному культивированию. Для получения культуральной вируссодержащей жидкости вирус выращивали в стационарном и в круговом монослое перевиваемых клеток ПС и ВНК-21. При монослойном заражении, степень заполнения клетками ростовой поверхности матраса (сосуда) должна быть не менее 90-95% , а множественность инфицирования 0,1-1,0 МЛД50/клетку. Вируссодержащую жидкость оставляют на 1 час при 37С. Затем вируссодержащую жидкость удаляют и в сосуды с инфицированными клетками доливают поддерживающую ростовую среду ДМЕМ (с 2-5% содержанием телячьей сыворотки). Средний объем заполнения культуральных матрасов поддерживающей средой должен составить 1/5 часть от общего объема сосуда. Затем культуральные матрасы помещают в термостат с температурой 37С.
Через 3 суток культуральную вируссодержащую жидкость из сосудов (матрасов) удаляют и заливают новую свежую поддерживающую ростовую среду ДМЕМ. Аналогичным образом с интервалом в 48 часов, выполняют второй и третий сборы вируссодержащей жидкости. Затем отбирают пробы для определения бактериальной и грибной контаминации , а также вирусной активности вируса. Полученнный вирус разливали на аликвоты и замораживали при -60 С.
Из серии опытов по культивированию вакцинного вируса штамм ERA-CВ-20М установили, что при множественности заражения 01-0,01 МЛД50/клетку , вирус размножается без ЦПД. Чем меньше множественность заражения (0,01 МЛД50/клетку) тем дольше происходит накопление вируса, т.е. на монослое клеток ПС- 5-7 день, а на монослое у клеток ВНК-21 на 3-4 день.
Оценка безвредности, антигенной активности и стабильности вакцин «РАБИКС» и «РАБИФЕЛ» в лабораторных условиях
История вакцинологии знает немало впечатляющих примеров успешной борьбы с инфекционными заболеваниями. Практически ликвидированы на Земле такие опасные болезни, как оспа, полиомиелит, чума крупного рогатого скота. В развитых странах блестяще реализованы национальные программы эрадикации многих экономически важных болезней животных: классической чумы свиней, болезни Ауески, диареи крупного рогатого скота, инфекционного ринотрахеита и др. Однако, несмотря на достигнутые успехи, такое антропозоонозное заболевание, как бешенство, по-прежнему представляет серьезную угрозу для человечества. Классические работы Луи Пастера и его учеников заложили основательный фундамент для создания эффективных антирабических препаратов. В настоящее время совершенно очевидно, что без углубленного знания природы возбудителя, включая детальное изучение молекулярной организации генома, невозможно создание высокоэффективных средств специфической профилактики. С другой стороны, прогресс иммунологии и конструирование новых современных адъювантов, в том числе наноадъювантов, создает предпосылки для разработки качественно новых вакцинных препаратов. Вирус бешенства – единственный представитель царства Vira, способный поражать центральную нервную систему как человека, так и животных. Способов лечения бешенства на сегодняшний день не существует – стоит заболеванию развиться, вероятность летального исхода составляет 100%.
Однако специфическая профилактика бешенства с помощью вакцин возможна. Наиболее эффективной с точки зрения стоимости стратегией профилактики бешенства у людей является эрадикация заболевания среди собак, кошек и других плотоядных млекопитающих за счет вакцинации. Необходимо отметить, что существует две принципиально различных стратегии искоренения бешенства среди диких и домашних животных. В первом случае приоритетным подходом является применение оральных вакцин с последующей оценкой их эффективности. Такой подход был успешно реализован во многих странах Европы. Вакцинация домашних животных, напротив, предполагает использование параэнтеральных способов введения. Принимая во внимание возрастающие масштабы глобализации, которая влечет за собой массовые перемещения через границы людей с домашними питомцами, особое значение приобретает оценка напряженности поствакцинального иммунитета. Бешенство встречается практически на всех континентах более чем в 150 странах включая Россию и представляет опасность для более чем 3 миллиардов людей. В связи с этим исключительное значение приобретает получение высокоиммуногенной и безопасной антирабической вакцины для иммунизации домашних животных. Вакцина против бешенства на основе нового вакцинного штамма ERA-CВ-20М может отвечать означенным требованиям, и разработка такой вакцины представляется своевременной.
При создании новой вакцины главным компонентом, безусловно, является вирус и его биологические свойства. Ранее Грибенча С.В. и др. показали, что популяция штаммов уличного вируса бешенства гетерогенна по составу биологических вариантов; неодинакова и возможность их выделения из популяции вирусов. Для создания новой вакцины, используя созданный ранее нами новы принцип селекции, мы решили получить новый штамм вакцинного вируса путем отбора из популяции штамма ERA тех биологических вариантов, для которых характерен наиболее высокий уровень экспрессии гена гликопротеина, являющегося главным иммуногеном вируса бешенства (Грибенча С.В., Лосич М.А. и др.).
Работа по оптимизации условий получения гликопротеина была построена по классической схеме: устанавливалось влияние на выход белка таких факторов, как состав ростовой и поддерживающей питательной сред, вид культуры клеток, субстрат для культивирования, множественность заражения, схема получения сборов.
К вирусу бешенства чувствителен целый ряд перевиваемых культур клеток, например, Vero, ПС, BHK и ее клоны (BSR и другие). Результаты, полученные в ходе экспериментов, говорят о том, что культуры клеток различаются по чувствительности к штамму вируса бешенства ERA-СВ 20М. Несмотря на то, что линии клеток BHK-O, BHK-21 и BSR имеют общий источник происхождения – линию клеток почки золотистого хомячка, они существенно отличаются друг от друга, во-первых, по морфологии и, во-вторых, по выходу вирусного гликопротеина после заражения. Необходимо отметить, что наименьший уровень выхода белка наблюдался при использовании линии клеток Vero. Однако, учитывая различия по данному параметру между клонами BHK, можно допустить существование и клонов Vero, более чувствительных к вирусу бешенства. В частности, антиген вакцины против бешенства на основе штамма Пастер получают именно на клетках Vero. Другим немаловажным фактором является подбор питательной среды для работы с выбранной клеточной линией. По итогам нескольких пассажей, было выявлено преимущество использования заменителя сыворотки Fetal clone III по сравнению с эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота.
Одним из ключевых моментов в максимизации выхода белка стало выращивание клеток в условиях роллерного культивирования. Несмотря на то, что количество сборов с использованием роллеров обычно ограничивалось 4, общий уровень гликопротеина вируса бешенства был все же выше, чем если использовались «матрасы».
