Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Вирус гриппа 11
1.1.2 Цикл размножения вируса гриппа 12
1.1.3 Функции белков 14
1.1.4 Генетическая изменчивость вируса гриппа 17
1.2 Живые гриппозные вакцины 19
1.2.1 Инактивированные вакцины 19
1.2.2 Живые гриппозные вакцины 20
1.2.3 История вопроса 21
1.2.4 Холодоадаптированные вакцины 22
1.2.5 Классический метод получения ЖГВ 28
1.3 Обратная генетика 30
1.3.1 История вопроса 30
1.3.2 Создание живых гриппозных вакцин (ЖГВ) 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы. 38
2.1 Материалы... 38
2.1.1 Реактивы. 38
2.1.2 Лабораторные штаммы вирусов . 38
2.1.3 Клеточные линии и куриные эмбрионы. 39
2.1.4 Плазмиды 39
2.2 Методы 39
2.2.1 Получение реассортантов. 39
2.2.2 Определение инфекционного титра вирусов в ЭИД50 и накопление вирусов для последующих опытов. 40
2.2.3 Концентрирование вирусов. 40
2.2.4 Оценка патогенности вирусов для мышей 41
2.2.5 Определение защитной эффективности ХА реассортантов... 42
2.2.6 Оценка нейровирулентности вирусов для мышей. 42
2.2.7 Реакция задержки гемагглютинации 42
2.2.8 Выделение вирионной РНК 42
2.2.9 Получение ПЦР-продуктов для последующего секвенирования 43
2.2.10 Подбор праймеров для последующего секвенирования. 43
2.2.11 Очистка ПЦР-продуктов 44
2.2.12 Секвенирование. 44
2.2.13 Компьютерное обеспечение 45
2.2.14 Подготовка компетентных клеток. 45
2.2.15 Вставка необходимых генов в плазмиды. 45
2.2.16 Выделение макси количеств плазмидной ДНК 47
2.2.17 Трансфекция клеток плазмидами 48
ГЛАВА 3. Результаты 49
3.1 Изучение фенотипа реассортантов между ХА штаммом A/Краснодар/101/35/59(H2N2) и эпидемическими штаммами 49
3.2 Изучение роли отдельных генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) в поддержании его ts, ca и att фенотипа на основе реассортантов, полученных методом обратной генетики 60
ГЛАВА 4.Обсуждение. 72
4.1 Изучение фенотипа реассортантов между ХА штаммом A/Краснодар/101/35/59(H2N2) и эпидемическими штаммами 72
4.2 Изучения роли отдельных генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) в поддержании его ts, ca и att фенотипа на основе реассортантов, полученных методом обратной генетики 75
Выводы 78
Благодарности 79
Список литературы 80
- Цикл размножения вируса гриппа
- Лабораторные штаммы вирусов
- Изучение роли отдельных генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) в поддержании его ts, ca и att фенотипа на основе реассортантов, полученных методом обратной генетики
- Изучения роли отдельных генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) в поддержании его ts, ca и att фенотипа на основе реассортантов, полученных методом обратной генетики
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Имеющийся к настоящему времени опыт применения холодоадаптированной (ХА) живой гриппозной вакцины в России и США показал, что этот препарат обладает наибольшей эффективностью при массовой вакцинации против гриппа, особенно детей. Следует отметить, что в отличие от инактивированных гриппозных вакцин живая вакцина способна защитить от инфекции дрейфовыми вариантами. В настоящее время для получения живой ХА гриппозной вакцины в России используют ХА штамм А/Ленинград/134/17/57(Н2N2) [Александрова, Климов 1994], а в США – ХА штамм А/Энн Арбор/6/60(H2N2) [Herlocher et al.,1996]. Эти штаммы–доноры аттенуации получены путем пассажей при пониженной температуре и их генетические маркеры были хорошо изучены [Гендон, 2011]. Однако, применяемый в России ХА штамм-донор А/Ленинград/134/17/57 оказался генетически гетерогенным [Киселева и сотр.2005] и обнаружил повышенную реактогенность для маленьких детей [Александрова, Климов 1994]. Учитывая это обстоятельство в НИИВС им. И.И. Мечникова был получен новый ХА штамм–донор аттенуации А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и выявлены мутации в РНК-сегментах его генома, кодирующих «внутренние» белки [Гендон Ю.З. и сотр, 2013]. Данный штамм обладал приемлемыми фенотипическими характеристиками. Однако до настоящего времени остается неясным, какие гены штамма А/Краснодар/101/35/59 (Н2N2) содержат ключевые генетические детерминанты, ответственные за аттенуацию данного штамма (ts и att фенотип). Эту проблему мы попытались решить с помощью создания панели одногенных и полигенных реассортантов, используя методы обратной генетики, с последующим изучением фенотипических и генотипических характеристик сконструированных реассортантов.
Также под вопросом остается возможность получения ХА реассортантов – кандидатов в живые гриппозные вакцины на базе ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2), которые обладают хорошими защитными свойствами, необходимыми для живых гриппозных вакцин. Всестороннее изучение биологических свойств реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) с эпидемическими штаммами вируса гриппа А, является необходимым условием для реальной оценки перспективности данного штамма как эффективного донора аттенуации для живых гриппозных вакцин.
Цели и задачи исследования.
Целью работы являлось изучение генетических основ аттенуации холодоадаптированного штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2), а также исследование возможности ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(H2N2) образовывать при скрещивании с эпидемическими штаммами вируса гриппа ХА реассортанты, которые могли быть использованы по своим характеристиками в качестве живых гриппозных вакцин.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Получить ХА реассортанты путем классического скрещивания ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(H2N2) c эпидемическими штаммами вируса гриппа А - А/Кумамото/102/02(H3N2) и A/Берн/07/95(H1N1).
-
Изучить фенотипические характеристики ХА реассортантов, полученных при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(H2N2) и эпидемических штаммов A/Кумамото/102/02(H3N2) и A/Берн/07/95(H1N1).
-
Проанализировать антигенную специфичность и иммуногенность полученных ХА реассортантов.
-
Провести анализ генома полученных ХА реассортантов с помощью метода секвенирования.
-
Исследовать защитную эффективность ХА реассортантов, полученных между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и эпидемическим штаммом А/Берн/07/95(Н1N1).
-
Заклонировать все 8 генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) в плазмиду рНW2000.
-
Получить с помощью трансфекции наборы одногенных и полигенных реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентным штаммом А/WSN/33(Н1N1).
-
Исследовать ts и са фенотип одногенных и полигенных реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(H2N2) и А/WSN/33(H1N1).
-
Изучить att фенотип одногенных и полигенных реассортантов, полученных между вирулентным штаммом вируса гриппа А/WSN/33 и ХА штаммом вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59(Н2N2).
Научная новизна работы
Впервые исследованы генетические основы аттенуации ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 – нового донора аттенуации для живых гриппозных вакцин. Показано, что РВ1 и NS –гены данного штамма содержат ключевые детерминанты, определяющие его ts и att фенотип.
Анализ полученных нами реассортантов свидетельствует о доминировании генов, содержащих детерминанты, ответственные за att- фенотип, в составе генома реассортантов. Это говорит о безопасности применения живых гриппозных вакцин во время гриппозной эпидемии.
Показано, что ХА штамм А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) является перспективным штаммом-донором аттенуации для ХА реассортантов, кандидатов в живые гриппозные вакцины.
Создана панель праймеров, позволяющая определять наследование генов у реассортантов вируса гриппа А сероподтипов Н2N2, H3N2 и H1N1.
Практическая значимость.
Доказана возможность использования ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 (Н2N2) в качестве штамма-донора для живых рекомбинантных гриппозных вакцин.
Разработаны основные элементы плазмидной технологии для получения живых реассортантных гриппозных вакцин на базе клонированных 6 генов, кодирующих «внутренние» белки ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и 2-х клонированных генов, кодирующих поверхностные белки от любого эпидемического штамма вируса гриппа типа А. Это позволит в более короткие сроки получать вакцинные штаммы вируса гриппа, минуя трудоемкую стадию анализа генома реассортантов.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Все исследованные реассортанты, полученные нами при скрещивании ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентных штаммов А/Берн/07/95(Н1N1) и A/Кумамото/102/02(H3N2), обладают генетическими и фенотипическими маркерами, необходимыми для рекомбинантных живых гриппозных вакцин.
-
ХА штамм А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) можно рассматривать как перспективный донор аттенуации при получении ХА реассортантов для живой гриппозной вакцины.
-
Анализ одногенных и полигенных реассортантов, полученных с помощью обратной генетики между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59 (Н2N2) и вирулентным штаммом А/WSN/33, свидетельствует о том, что ключевые детерминанты, ответственные за ts и att фенотип, локализованы в РВ1- гене и NS – гене штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2).
-
Анализ полученных нами реассортантов между ХА штаммом А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентным штаммом А/WSN/33(Н1N1) указывает на доминирование генов, содержащих генетические детерминанты, ответственные за att фенотип, в составе генома реассортантов. Этот факт говорит о безопасности применения живых гриппозных вакцин во время гриппозной эпидемии.
Апробация материалов диссертации и публикации
Материалы диссертации доложены на конференциях молодых учёных ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН (Москва, 2011, 2012, 2013), Young scientist workshop «Methods to study Influenza virus» (Berlin, Germany, 2011), первой всероссийской научной конференций молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012), V Международной школе молодых учёных по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012).
Апробация диссертации состоялась 17 октября 2013 г. на научной конференции отдела вирусологии ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.
По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, включая 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 92 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований с обсуждением полученных данных, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 2 рисунками. Библиография включает 95 отечественных и зарубежных источников.
Личный вклад автора заключается в непосредственном участии в выполнении всех разделов данного исследования, а также в проведении анализа полученных данных.
Цикл размножения вируса гриппа
Вирус гриппа присоединяется к N-ацетилнейраминовой (сиаловой) кислоте на поверхности клетки-хозяина. Часть сиаловой кислоты узнается HA белком вируса гриппа, который затем к ней присоединяется. Это инициирует эндоцитоз, благодаря которому вирус проникает в клетку. Затем внутри эндосомы начинает повышаться pH, что является частью естественного клеточного механизма пиноцитоза, и осуществляется при помощи протонных помп. При этом протоны из эндосомы пассивно закачиваются внутрь вирусной частицы с помощью М2 белка, что вызывает “разрыхление” внутренних структур вириона, и ослабление связей между вирусными белками. Благодаря закислению среды в эндосоме, конформация HA белка меняется, и он сливается с её оболочкой, тем самым создавая пору, через которую внутрь клетки может выйти РНП-комплекс вируса гриппа.
После освобождения от оболочки, РНП перемещается в ядро клетки с помощью сигналов ядерной локализации белков вируса. В ядре происходят все действия вируса с его генетическим материалом. РНК-зависимая РНК полимераза на основе (-)вРНК синтезирует два типа (+)РНК: матричная – необходима для синтеза вирусных белков, а другая – комплиментарная (кРНК), из который затем будут синтезировать (-)вРНК для потомства вируса. Стоит отметить, что поли(А) конец вРНК получается благодаря тому, что в первоначальной цепочке вРНК имеется последовательность 5-7 урацилов (соответсвенно, полученные из вируса мРНК не нуждаются в полиаденилировании). Однако cap конец отсутствует. Полимеразные белки забирают cap 5 конец у мРНК клетки и присоединяют его к мРНК вируса. Это процесс в англоязычной литературе называется cap snatching (“захватывание кэпа”). Рисунок 2. Жизненный цикл вируса гриппа [53]. После присоединения cap мРНК готова к транспортировке и трансляции, как и любая мРНК клетки. Однако вРНК транспортируется из ядра с помощью М1 и NS2(NEP) белков. М1 взаимодействет с РНК и NP белком, связывая их с NS2(NEP), и затем полученный комплекс покидает ядро клетки и выходит в цитоплазму.
С помощью мРНК вируса и рибосом клетки в просвет ЭПР синтезируются белки HA, NA и M2, которые затем транспортируются в аппарат Гольджи для пост-трансляционной обработки. Все три полученных белка имеют сигналы апикального сортинга (“apical sorting signals”), которые направляют их к плазмалемме, где впоследствии происходит сборка вирусов.
Отпочковывание новых вирусов инициируется накоплением М1 белка в цитоплазме вблизи плазмалеммы. HA белок всё ещё прикреплен к сиаловой кислоте, когда отпочковывание вирусов уже завершено. За отделение вируса от мембраны клетки отвечает NA белок, который отрезает отпочковавшуюся вирусную частицу от сиаловой кислоты и даже удаляет кусочки этой кислоты от поверхности мембраны вируса [53; 21; 65].
Гемагглютин (HA) – один из поверхностных белков, состоит из двух субъединиц: HA1 и HA2. Они соединяются друг с другом посредством дисульфидных мостиков. HA1 имеет глобулярную конформацию и отвечает за прикрепление вириона к соответствующему рецептору клетки-хозяина. Также HA1 несёт главную антигенную детерминанту молекулы HA. HA2 имеет форму фибриллы и отвечает за слияние мембран вириона и клетки-хозяина.
Общая функция HA заключается в том, что благодаря этому белку вирион соединяется с клеткой-хозяином, а также HA инициирует рецептор-ассоциированный эндоцитоз [44]. Нейраминидаза (NA) – другой поверхностный белок, функция которого заключается в отделении новых вирусных частиц от поверхности клетки-хозяина, путем «разрезания» сиаловой кислоты. Также NA повышает вирулентность вируса, разрушая муцин в респираторном тракте и позволяя проходить сквозь респираторный эпителий [61].
При разговоре о «внутренних» белках вириона в первую очередь стоит упомянуть полимеразный комплекс белков PB1, PB2 и PA. Общая функция этого комплекса заключается в транскрипции и репликации вирусного генома. В то же время у каждого белка-субъединицы есть и свои функции. Белок PB2 отвечает за связывание с “cap” на клеточных мРНК [41]. PA белок отвечает за связывание с промотором кРНК, а также вместе с PB2 белком за отщепление и присоединение cap к синтезирующейся вирусной мРНК. Стоит отметить, что работа полимераз в отношении вРНК и кРНК немного различается, поскольку PA по большей части контактирует с кРНК, а PB1 соединяется с промотором вРНК, в то время как PB2 одинаково связывается с промоторами обоих типов РНК [21]. Также, при попадании в ядро клетки полимеразные белки способны свзявать с клеточной РНК полимеразой II, деактивируя ее и, таким образом, останавливая синтез клеточной мРНК.
NP белок имеет положительный заряд и упаковывает вирусную РНК благодаря электростатическим взаимодействиям с ней. Также он взаимодействует с М1 белком и со всем РНП-комплексом, а на финальной стадии цикла развития вируса гриппа NP отвечает за отпочковывание новых вирусных частиц.
Белки М2 и NS2 также играют большую роль в цикле развития вируса. В частности, М2 белок представляет из себя протонные каналы, благодаря которым в эндосоме инициируется попадание РНП-комплекса в цитоплазму. NS2 белок, как уже говорилось ранее, обеспечивает транспорт свежеобразованных РНП-комплексов из ядра клетки и последующий транспорт к точке отпочковывания вирусов. [21]
Лабораторные штаммы вирусов
В США также были разработаны ХА штаммы-доноры аттенуации. В отличие от России пассирование штамма проводили на культуре клеток почек цыплят. Температура пассирования постепенно снижалась от 33С до 25С. Причём на температуру 25С пришлось 16 пассажей. В результате был получен штамм А/Энн Арбор/6/60(H2N2), который обладает как ca, так и ts фенотипом. Изучение и сравнение нуклеотидной последовательности ХА штамма А/Энн Арбор/6/60 с другими штаммами выявило наличие замен в 3-х внутренних генах (2 некодирующих мутации в гене PB2, и по одной кодирующей мутации в генах PB1 и NP, приводящих к консервативным аминокислотным заменам) [36]. Также в США был получен и холодоадаптированный донор аттенуации для вакцины от штамма вируса гриппа B. Для создания данного варианта было проведено 13 пассажей также при снижающейся температуре от 33С до 25С и последующее клонирование в первичной культуре фибробластов кур. Данный штамм был назван В/Энн Арбор/1/66 [57].
Также стоит сказать, что полученные ХА штаммы весьма стабильны как фенотипически, так и генетически. Это было подтверждено опытами с получением ревертантов штамма А/Ленинград/134/47/57(H2N2) [88]. Данные эксперименты показали, что лишь многочисленные пассажи ХА штамма ведут к потере им ts и ca фенотипа, то есть к утрате его генома необходимых мутаций, отвечающих за приобретение данных фенотипов (т.н. истинные реверсии).
Подводя итоги, можно сказать, что ЖГВ обладают гораздо более простым методом применения - интраназальным, по сравнению с инактивированными вакцинами, которые вводят подкожно. Интраназальное введение облегчает массовую вакцинацию. Также известно, что кроме гуморального иммунитета, ЖГВ в значительной степени индуцируют и клеточный иммунитет, обеспечивая большую эффективность этой вакцины [18]. Также эксперименты подтвердили способность ЖГВ вызывать коллективный иммунитет, что даёт возможность в случае пандемии гриппа быстро увеличить производство ЖГВ [70]. 1.2.5 Классический метод получения ЖГВ
Классический способ получения рекомбинантных вирусов гриппа активно применялся начиная с 70х годов 20 века. В России и, во многом, в Европе этот метод применяется и по сей день (в отличие от США, где с 2008 года был внедрён метод обратной генетики). Классический метод реассортации представляет собой скрещивание вирулентных вирусов с холодоадаптированными штаммами вируса гриппа, имеющими ts фенотип.
Рекомбинанты получают в процессе скрещивания родительских вирусов или путем реактивации инактивированного теплом вирулентного вируса с помощью аттенуированного штамма (т.н. кросс-реактивация).
При методе рекомбинации куриные эмбрионы заражают смесью вирулентного и термочувствительного вирусов в равных инфекционных дозах. В случае кросс-реактивации, вирулентный штамм предварительно прогревают при 40-45С, с целью инактивации вируса. Обработка теплом продолжается до полной потери инфекционной активности (около 24 часов) [79].
Инфицированные эмбрионы инкубируют в течении 18 часов при температуре 32С. Затем из эмбрионов производится забор аллантоисной жидкости и, с помощью метода предельных разведений в присутствии антисыворотки к аттенуированному вирусу, производят клонирование полученных реассортантов при трех температурных режимах. Также для каждого из температурных режимов берется определенный срок инкубации: 25С – 72 часа, 32С – 48 часов и 40С – 24 часа. Затем отбирают необходимые клоны с гемагглютинином и нейраминидазой, соответствующими вирулентному штамму [Polezhaev F.I. et al, 1978]. Определение антигенной принадлежности штамма при помощи реакции задержки гемагглютинации (РЗГА), тест на ингибирование нейраминидазной активности [8]. Было проведено сравнение температурочувствительности реассортантов, полученных методом рекомбинации и методом кросс реактивации [10]. В результате наибольшая температурочувствительность была показана у клонов, которые были получены при использовании кросс реактивации. Аналогичные показатели у штаммов, созданных рекомбинантным методом, были только в случае селекции клонов при температуре 25С. 1.3 Обратная генетика
Обратная генетика – это метод генной инженерии, позволяющий изучать функции отдельных генов. Благодаря современным подходам, с помощью обратной генетики вируса гриппа можно получать живые вакцины на основе плазмидных конструктов, проводить сайт-направленный мутагенез вирусных белков и таким образом изучать функции отдельно взятых белков в составе вирионов и в системах in vitro.
Благодаря методам обратной генетики стало возможно получать реассортантные вирусы, актуальные для создания живой гриппозной вакцины. Причем данный метод гораздо надежней классических способов, поскольку при пассажах на куриных эмбрионах вакцинный штамм может мутировать, а созданные плазмиды практические не способны к случайным и спонтанным мутациям.
Изучение роли отдельных генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) в поддержании его ts, ca и att фенотипа на основе реассортантов, полученных методом обратной генетики
Для выделения плазмидной ДНК, предварительно выращенные в жидкой LB среде бактерии E.coli, осаждали в центрифуге Beckman на скорости 4000-5000 об/мин в течении 10 минут при температуре 4С (ротор -JLA-16250). Затем удаляли супернатант и добавляли 10 мл раствора 1 (50мМ глюкоза, 25мМ Tris 1 М с pH 8,0 и 10мМ EDTA 0,5 M с pH 8,0), 40 мкл лизоцима и инкубировали пробирку во льду в течении 10 минут. После этого добавляли 20 мл раствора 2 (0,2 М NaOH и 1% SDS) и вновь инкубировали во льду в течении 5 минут. По прошествии времени добавляли раствор 3 (294,55 мл раствора ацетата калия и 115 мл ледяной уксусной кислоты) в объёме 15 мл, аккуратно перемешивали и снова клали на лёд на 30 минут. Через полчаса полученную смесь центрифугировали на 10000 об/мин в течении 20 минут при температуре 4С. После этого супернатант сливали и растворяли осадок в 1,2 мл H2O, добавляли 800 мкл ацетата аммония (7,5 М) и инкубировали 30 минут при температуре -20С. Затем раствор центрифугировали на скорости 10000 об/мин в течении 10 минут, переносили супернатант в новые пробирки и добавляли 0,8 объёма изопропанола. После снова центрифугировали в тех же условиях. Полученный осадок промывали 70% спиртом и высушивали. После высушивания осадок разводили в 400 мкл воды, добавляли 400 мкл раствора LiCl и инкубировали в течении 20 минут на температуре -20С. После чего раствор вновь центрифугировали на 10000 об/мин при температуре 4С. Затем вновь отбирали супернатант и добавляли 0,8 объёма изопропанола, после чего опять центрифугировали. Затем аккуратно, чтобы не повредить осадок, сливали супернатант и промывали осадок 70% этанолом., после чего высушивали его на воздухе. После этого в пробирку добавляли 200мкл воды с РНКазой и растворяли, инкубируя при температуре 37С в течении 20 минут. Затем в пробирку добавляли равный объём раствора фенола и хлороформа (в соотношении 1:1) и центрифугировали в течении 6 минут. К отобранному супернатанту добавляли равный объём хлороформа и опять помещали в центрифугу на 2 минуты. К отобранному супернатанту добавляли 0,8 объёма изопропанола и 1/10 объёма ацетата натрия (3М), после чего центрифугировали при 10000 об/мин 10 минут. Полученный осадок вновь отмывали 70% спиртом и высушивали на воздухе. Затем добавляли 200 мкл воды и растворяли в ней осадок. Полученную концентрацию плазмидной ДНК после этого измерили на спектрофотометре.
Трансфекция клеток плазмидами.
Для трансфекции использовался 70-100% однодневный монослой клеток 293Т. Для опыта приготавливали смеси с плазмидами, содержащими необходимые для конкретного опыта гены (по 125-250 нг каждой плазмиды). С помощью среды Opti-MEM смесь для трансфекции доводили до 12,5 мкл. Отдельно готовили смесь Opti-MEM и липофектамина LTX: в объём равный 59,5 мкл среды добавляли 3 мкл липофектамина. Полученную смесь тщательно перемешивали и инкубировали в течении 5 минут при комнатной температуре. Затем в пробирку с плазмидами добавляли 62,5 мкл смеси Opti-MEM и липофектамина LTX, также перемешивали и инкубировали 20 минут при комнатной температуре. По истечении времени смесь вводили в культуру клеток и оставляли на 48-72 часа. Затем клетки отмывали трипсином и вводили в куриные эмбрионы по 0,1-0,2 мл. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
Изучение фенотипа реассортантов между ХА штаммом A/Краснодар/101/35/59(H2N2) и эпидемическими штаммами Для получения реассортантов на основе эпидемических штаммов A/Кумамото/102/02(H3N2) и A/Берн/07/95(H1N1) использовали стандартные методики, описанные Полежаевым с сотрудниками [10], однако вместо метода инактивации вирулентных штаммов с помощью высоких температур, в нашей лаборатории использовали другой метод – инактивация с помощью облучения ультрафиолетом. Дозу облучения при этом подбирали таким образом, чтобы титр вируса снизился на 6 lg ЭИД50/0,2 мл. Рекомбинацию проводили совместным инфицированием куриных эмбрионов как эпидемическим, так и холодоадаптированным штаммом
А/Краснодар/101/35/59(H2N2), в присутствии антисыворотки к ХА штамму. После двух пассажей реассортанты клонировали в КЭ методом предельных разведений. В результате, были получены пять реассортантов, которые обозначаются далее по тексту как: A/Кумамото/R1, A/Кумамото/R2, A/Кумамото/R3 и A/Берн/R1, A/Берн/R2, в случае реассортантов со штаммами A/Кумамото/102/02(H3N2) и A/Берн/07/95(H1N1), соответственно. С полученными реассортантами была проведена дальнейшая работа.
Изучения роли отдельных генов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) в поддержании его ts, ca и att фенотипа на основе реассортантов, полученных методом обратной генетики
В отличие от этих двух распространённых методов, метод секвенирования является наиболее точным и информативным. Данная методика позволяет использовать набор праймеров, подходящих практически для всех штаммов сероподтипов H2N2, H3N2 и H1N1 (а при некоторой модификации, вероятно, и большего количества сероподтипов) и сравнивать полученные результаты между собой, выявляя мутации и происхожение генов в реассортантах. В целом этот набор праймеров позволяет проанализировать принадлежность отдельных генов к тому или иному штамму-предку, а также позволяет определить наличие/отсутствие аттенуирующих мутаций, присутствовавших в ХА штамме А/Краснодар/101/35/59(Н2N2). Изучение защиты нашими штаммами от диких штаммов сероподтипа H1N1 показало, что реассортанты А/Берн/R1 и А/Берн/R2 обладают способностью вызывать иммунитет к штамму-предку А/Берн/07/95(H1N1). Особый интерес вызывают данные о защитной эффективности вызванной против штаммов А/Чили/01/83(H1N1) и А/Москва/904/77(H1N1).
Полученные данные свидетельствуют о том, что ХА реассортанты, полученные нами, обеспечивают защиту не только против родительского вируса, но и против дрейфовых вариантов вируса гриппа.
Итак, полученный ранее в нашей лаборатории ХА штамм А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) обладает ts и ca фенотипом. При реассортации с различными эпидемическими штаммами вируса гриппа, данный фенотип сохраняется и у реассортантов с формулой генома 6:2. Полученные реассортанты обладают достаточно высоким уровнем иммуногенности и вызвают достаточную степень защиты. Всё вышеперечисленное даёт нам понять, что ХА штамм А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) – перспективный штамм-донор аттенуации для получения ЖГВ. При этом разработка метода анализа генома реассортантов ХА штамма с эпидемическими штаммами позволит впоследствие с целью получения живой гриппозной вакцины получать такие реассортанты с актуальными эпидемическими штаммами.
Для более детального изучения возможности применения ХА штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) в качестве донора для производства ЖГВ, потребуется провести доклинические и клинические испытания.
А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентного штаммаA/WSN/33, в составе которых были гены PB1 и NS от ХА штамма, обладали выраженным ts и att фенотипом и теряли нейровирулентность. Стоит заметить, однако, что NS ген, в отличие от гена PB1, не имеет никаких мутаций в своём составе и идентичен NS гену дикого штамма. В результате можно предположить, что ключевые детерминанты, отвечающие за выработку ts и att фенотипа у реассортантов находятся именно в гене PB1.
Стоит заметить, что аттенуированный фенотип ХА штаммы-доноры вакцин A/Энн Арбор/6/60(H2N2) и A/Ленинград/134/17/57(H2N2) обусловлен налиием мутаций в генах, кодирующих белки PB1 и PB2 [47]. Данная картина схожа с таковой для нашим ХА штаммом, с различием лишь в том, что за аттенуированный фенотип штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) отвечают мутации лишь в одном полимеразном гене. Заметим, что для более чёткого доказательства роли мутаций в РВ1 гене треб дополнительные исследования, такие как включение мутаций, присутствовавших в этом гене ХА штамма, в геном вирулентных штаммов, и изучение фенотипа полученных штаммов. Что касается влияния включения NS гена на аттенуацию реассортантов с ХА штаммом, то его роль в данном случае неясна, поскольку этот ген не имеет мутаций, отвечающих за холодоадаптацию. Эпидемический штамм-предок штамма
А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) имел в своём составе абсолютно такой же ген NS по последовательности нуклеотидов. Приобретение ts фенотипа реассортантами, имеющими в своём составе NS ген от ХА штамма, может быть связано с эффектом констелляции генов. Данный феномен возможен потому, что NS1 и NS2 белки взаимодейтсвуют с другими белками вириона во время жизненного цикла вируса, такими как белок PB1 (в случае белка NS1), [35], M1 и NP в случае белка NS2 [74; 20] И, вероятно, из-за особенностей аминокислотной последовательности данного белка у сероподтипа H2N2, взаимодействие белков NS1 и NS2 штамма H2N2 с другими белками неродственных штаммов оказывается затруднено.
Стоит заметить, что подобные данные были получены при изучении одногенного реассортанта между штаммами A/Пуэрто-Рико/8(H1N1) и A/Ленинград/134/57(H2N2). Получившийся реассортант приобрел ts фенотип, хотя ни один из его штаммов-предков таким фенотипом не обладал [30]. В обоих случаях этот эффект, скорее всего, обуславливается тем, что NS ген от сероподтипа H2N2 в составе генома сероподтипа H1N1 способен вызывать сложности во взаимодействии NS1 или NS2/NEP генов с остальными генами в составе реассортанта.
В рамках исследования аттенуированного фенотипа полученных реассортантов, нами были также проведены опыты по исследованию их нейровирулентности. Результаты наших опытов говорят о том, что нейровирулентный фенотип коррелирует с аттенуированным фенотипом реассортантов в лёгких мышей. Реассортанты, имеющие NS или PB1-ген от ХА штамма обладали ts и ca фенотипом, были аттенуированы в лёгких мышей, и не вызывали гибель мышей после интраназального введения. Таким образом, изучение нейровирулентости наших реассортантов для мышей-сосунков показывает, что данный биологический феномен может выступать маркером для появления у штаммов-доноров для ЖГВ att фенотипа.
